一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统及其实施方法

1.本发明专利涉及双光子成像的技术领域，具体而言，涉及一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统及其实施方法。


背景技术：

2.双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，跃迁到高能级，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子。双光子激发需要很高的光子密度，因此双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光每个脉冲的持续时间只有100飞秒，因此具有很高的峰值能量。其重复频率一般为80mhz。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，每次成像只拍摄焦平面附近约5um厚度的一层样品，具有天然的层析能力。
3.传统的双光子显微镜进行三维成像的时候，需要在z轴移动物镜，或者移动焦点，一层一层地扫描样品，成像速度慢。一种提高双光子三维成像速度的方法(如图3所示)，是在z轴产生多个焦点，每个焦点在不同的z轴位置(深度)。z轴上不同焦点的激发光脉冲在时间上间隔6.7ns左右，因此其激发出的荧光也大约间隔6.7ns。通过高速的荧光探测器和信号采集卡记录荧光产生的时间从而将采集到的荧光信号分配到该荧光激发时所在的深度。
4.然而聚焦在样品内不同的深度会因为样品与物镜的折射率不匹配产生球差，使得聚焦情况变差，影响成像质量。而且不同深度的球差大小不同，很难用固定的球差补偿器件(如物镜的像差矫正环)矫正每一个深度的像差。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统及其实施方法，旨在解决现有技术中，在双光子系统中聚焦在样品内不同的深度的光的球差难以补偿的问题。
6.本发明是这样实现的，一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统，包括非稳回形腔，所述非稳回形腔包括第一凹面反射镜、第二凹面反射镜、波前校正器、分光镜和反射镜；
7.激光光源发出的光进入所述非稳回形腔后，经所述第一凹面反射镜后，入射至所述波前校正器，所述波前校正器用于对光波波面相位进行校正，再入射至所述第二凹面反射镜，然后经所述反射镜反射至所述分光镜，分为两束光脉冲，其中一束光脉冲p
2n-1
输出到双光子系统中，另一束光脉冲p
2n
重新进入所述非稳回形腔开始下一轮循环，其中光脉冲p
2n-1
表示所述非稳回形腔输出的脉冲序列，n为光脉冲经过所述分光镜的次数。
8.可选的，所述波前校正器位于所述第一凹面反射镜的后焦面处，且所述波前校正器位于所述第二凹面反射镜的前焦面处。
9.可选的，通过调节所述反射镜到所述第一凹面反射镜或所述第二凹面反射镜的距离来调整所述非稳回形腔的长短，，并保持第一凹面反射镜、波前校正器和第二凹面反射镜之间的距离不变，从而调节相邻两个光脉冲p
2n-1
和p
2n+1
在物镜下沿光轴方向焦点位置错开的距离
△
z。
10.可选的，从激光光源发出的单个脉冲标记为p0，经过聚光透镜后聚焦在所述分光镜附近，贴着所述分光镜的边缘进入所述非稳回形腔，所述第一凹面反射镜和所述聚光透镜构成共焦系统，p0光经所述第二凹面反射镜后聚焦在所述分光镜附近。
11.可选的，相邻的输出光脉冲p
2n-1
与p
2n+1
每次在垂直于光轴方向上错开
△
y，经过多次循环后，p1与p
2n+1
最终在垂直光轴方向上的累积错位量为
△y×
n；
12.当所述累积错位量大于所述分光镜在垂直光轴方向上的大小时，则光束超过所述分光镜的边缘输出，不再重新进入所述非稳回形腔。
13.可选的，光脉冲p
2n+1
的聚焦深度为z
max-n
△
z，其中z
max
是光脉冲p1在双光子系统中聚焦的深度；
△
z＝l/m2，m是原点o到双光子系统的物镜焦点之间的放大率，原点o是光束p0经过所述非稳回形腔后和自己交叉的点，l是所述非稳回形腔缩短的长度。
14.可选的，所述波前校正器为可变形镜，所述可变形镜包括多个驱动单元，每个驱动单元都有各自独立的控制器，在外加电压控制下，所述可变形镜的镜面可以产生所需的形变量。
15.一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统的实施方法，在所述分光镜上加载的像差由一组zernike多项式表示，其中zernike多项式表示为n为大于0的整数，表示zernike像差的阶数；而球差项在zernike多项式中表示为在所述分光镜上加载的球差分解到上的系数为
[0016][0017]
其中，物镜的有效数值孔径na＝n1sinα＝n2sinβ，α和β是边缘光线在水中和在样品中的折射角，n1和n2是光分别在水中和样品中的折射率。
[0018]
可选的，在双光子系统中加载一个初始球差偏移量使得p1光在聚焦到z
max
的球差为0，其中p1光为初始从所述非稳回形腔入射到双光子系统的光，z
max
是脉冲p1在双光子系统中聚焦的深度。
[0019]
可选的，所述初始球差偏移量通过调节双光子系统中物镜的像差矫正环实现，或者通过加入额外的像差补偿器件来实现。
[0020]
与现有技术相比，本发明提供的一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统，通过非稳回形腔使得激光光源发出的光在双光子系统的物镜下产生z轴多焦点，脉冲光经过该非稳回形腔后会变为一个脉冲序列，脉冲序列在时间上有一定间隔，空间上聚焦位置在光轴方向错开，即从非稳回形腔输出的脉冲序列在物镜下聚焦在样品的不同深度；并且在非稳回形腔中加入波前校正器，补偿了物镜与样品折射率不匹配引起的球差，改善了成像质量。
附图说明
[0021]
图1是本发明提供的一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统的非稳回形腔结构图与光路循环示意图；
[0022]
图2是本发明提供的一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统的仿真实验结果示意图；
[0023]
图3是现有的回形腔-双光子显微镜系统的示意图。
具体实施方式
[0024]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
[0026]
本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
[0027]
参照图1-2所示，为本发明提供的较佳实施例。
[0028]
一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统，包括非稳回形腔，非稳回形腔包括第一凹面反射镜、第二凹面反射镜、波前校正器、分光镜和反射镜；
[0029]
激光光源发出的光进入非稳回形腔后，经第一凹面反射镜后，入射至波前校正器，波前校正器用于对光波波面相位进行校正，再入射至第二凹面反射镜，然后经反射镜反射至分光镜，分为两束光脉冲，其中一束光脉冲p
2n-1
输出到双光子系统中，另一束光脉冲p
2n
重新进入非稳回形腔开始下一轮循环，其中光脉冲p
2n-1
表示非稳回形腔输出的脉冲序列，其中n＝1，2，3，
……
，n表示光脉冲在非稳回形腔内循环的次数。
[0030]
本实施例提供的一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统，通过非稳回形腔使得激光光源发出的光在双光子系统的物镜下产生z轴多焦点，脉冲光经过该非稳回形腔后会变为一个脉冲序列，脉冲序列在时间上有一定间隔，空间上聚焦位置在光轴方向错开，即从非稳回形腔输出的脉冲序列在物镜下聚焦在样品的不同深度；并且在非稳回形腔中加入波前校正器，补偿了物镜与样品折射率不匹配引起的球差，改善了成像质量。
[0031]
如果没有波前校正器对球差进行校正，则由于样品和物镜折射率不匹配，在深度成像时，近轴光束和远轴光束的折射偏转角不一样，因此近轴光束和远轴光束不能聚焦在同一点，即产生了所谓的球差。球差会引起系统z轴分辨率降低，同时也让聚焦能力降低，从而降低荧光信号。
[0032]
其中，激光光源可采用钛宝石飞秒激光器，激光的输出重复频率为80mhz，为了在两个脉冲之间插入多个回型腔产生的脉冲，通过脉冲拾取器(conoptics pulse picker(model 350-210-ra))，将激光的重复频率降为20mhz。
[0033]
第一凹面反射镜和第二凹面反射镜为凹面反射镜，对光束起到会聚作用，比较适
合搭建光学4f系统，光学4f系统是线性光学信息处理系统，线性光学信息处理系统是指系统对多个输入之和的响应(输出)等于各单独输入时的响应(输出)之和。优选的，第一凹面反射镜和第二凹面反射镜的焦距相等。
[0034]
例如，常规的光学4f系统中，物点在第一个透镜的前焦点，光栏在第一个透镜的后焦点和第二个透镜的前焦点，像点在第二个透镜的后焦点。
[0035]
一个光学成像系统就是典型的线性系统。相干光照明时，光学透镜所具有的傅里叶变换是一种线性变换。光学透镜将不同的光学图像变换成不同的空间频谱，可用光电探测元件接收各个部分的空间频谱来进行分析，或运用空间光调制器对输入信号的空间频谱进行各种处理。
[0036]
分光镜为半透半反镜，其透射和反射比决定了脉冲输出的衰减速度，例如立方体形状的分光棱镜。优选的，在工作时，分光镜会反射一部分光使其进入非稳回形腔内循环，同时透射一部分光输出到双光子系统。
[0037]
波前校正器，可采用变形镜，又称变形反射镜(deformable mirror，简称：dm)，主要运用于各种自适应光学系统之中，主要用于校正波前像差，它由很多驱动单元组合而成，每个驱动单元都有自己独立的控制器，在外加电压控制下，变形镜的镜面可以产生需要的形变量，从而对波前像差进行调制。
[0038]
反射镜为普通的反射镜，没有严格距离限制，起到镜像补偿作用，主要作用是转折光路。在非稳回形腔中，反射镜与第一凹面反射镜、第二凹面反射镜、波前校正器和分光镜一起形成光学意义上的回路。根据光路设计需要，反射镜可以是一个或多个。
[0039]
在本系统中还有其余器件(如图3所示)：其余器件为传统双光子标准配件，例如scanmirror：扫描振镜；objective：物镜；pmt：光电倍增管，用于探测荧光信号；sample：样品。
[0040]
具体的，波前校正器位于第一凹面反射镜的后焦面处，且波前校正器位于第二凹面反射镜的前焦面处。
[0041]
例如，从激光光源发出的单个脉冲标记为p0，经过聚光透镜后聚焦在分光镜附近，贴着分光镜的边缘进入非稳回形腔，第一凹面反射镜和聚光透镜构成共焦系统，p0光经第一凹面反射镜后变为平行光，入射至波前校正器上，被波前校正器反射后仍为平行光，入射至第二凹面反射镜，p0光经第二凹面反射镜后聚焦在分光镜附近，在聚焦前经反射镜反射至分光镜。一部分光透射后进入双光子系统，另一部分光被分光镜反射后重新入射至第一凹面反射镜，进入下一轮光脉冲循环。这里的光脉冲循环指的是光在非稳回形腔中依次通过各光学元件后，再次依次通过各光学元件，不断重复，直至达到终止条件或者无限循环下去。
[0042]
在本实施例中，通过调节反射镜到第一凹面反射镜或第二凹面反射镜的距离来调整非稳回形腔的长短，并保持第一凹面反射镜、波前校正器和第二凹面反射镜之间的距离不变(使用者可能在这三个器件中间加入其它反射镜)，从而调节相邻两个光脉冲p
2n-1
和p
2n+1
在物镜下沿光轴方向焦点位置错开的距离
△
z。调节
△
z可使散射引起的功率衰减和非稳回形腔的功率衰减相互抵消，进而使得各在物镜下各焦点激发的荧光强度相等，使得各焦点处的成像质量得到保证。
[0043]
优选的，光脉冲循环的终止条件如下：相邻的输出光脉冲p
2n-1
与p
2n+1
每次在垂直于
光轴方向上错开
△
y，经过多次循环后，p1与p
2n+1
最终在垂直光轴方向上的累积错位量为
△y×
n；
[0044]
当累积错位量大于分光镜在垂直光轴方向上的大小时，则光束超过分光镜的边缘输出，不再重新进入非稳回形腔。因此可以根据这个光脉冲循环终止条件设计分光镜的大小，进而控制非稳回形腔产生的脉冲个数。
[0045]
在本实施例中，光脉冲p
2n+1
的聚焦深度为z
max-n
△
z，其中z
max
是光脉冲p1在双光子系统中聚焦的深度；
△
z＝l/m2，m是原点o到双光子系统的物镜焦点之间的放大率，原点o是光束p0经过非稳回形腔后和自己交叉的点，l是非稳回形腔缩短的长度，即非稳回形腔由初始的光学4f系统状态时总长度，改变非稳回形腔缩短长度时的改变量。
[0046]
在非稳回形腔内的共轭镜组，组成的光学4f系统放大率为1，同时也决定了整个非稳回形腔的初始的总长度，例如整个非稳回形腔的初始总长度为4f。
[0047]
非稳回形腔的长度除以光速即为相邻两个激光脉冲的时间间隔。
[0048]
由于荧光存在荧光寿命，即荧光光子是在一定时间范围内释放的，因此回形腔产生的时间间隔必须大于荧光物质的荧光寿命。
[0049]
在本发明中，基于以上各实施例的一种在物镜下产生z轴多焦点并补偿球差的系统的实施方法，在分光镜上加载的像差由一组zernike多项式表示，其中zernike多项式表示为n为大于0的整数，表示zernike像差的阶数；而球差项在zernike多项式中表示为在分光镜上加载的球差分解到上的系数为
[0050][0051]
其中，物镜的有效数值孔径na＝n1sinα＝n2sinβ，α和β是边缘光线在水中和在样品中的折射角，n1和n2是光分别在水中和样品中的折射率。
[0052]
优选的，在双光子系统中加载一个初始球差偏移量使得p1光在聚焦到z
max
的球差为0，其中p1光为初始从非稳回形腔入射到双光子系统的光，z
max
是脉冲p1在双光子系统中聚焦的深度。
[0053]
其中，初始球差偏移量通过调节双光子系统中物镜的像差矫正环实现，或者通过加入额外的像差补偿器件来实现。
[0054]
在以下具体的实施例中：
[0055]
如图1所示，非稳回形腔结构图与光路循环示意图。
[0056]
在图1-a中，黑色虚线是第一个循环的光轴。f1，f2：是双胶合透镜，m1和m2是凹面反射镜，dm是可变形镜，m3是反射镜，m4是分光镜。原点o是光束p0经过回形腔后和自己交叉的点。m4反射的光将重新进入回形腔进行下一轮循环，m4透射的光将进入双光子显微镜系统用于点扫描成像。
[0057]
在图1-b中，p0经过一次非稳回形腔后到达m4，分为透射光p1和反射光p2。p2经过非稳回形腔后与p0在光轴方向错开l，在垂直光轴方向错开
△
y。
[0058]
在图1-c中，p2经过m4分为透射光p3和反射光p4。p4经过非稳回形腔后与p0在光轴方向错开l
×
2，在垂直光轴方向错开
△y×
2。
[0059]
器件介绍：
[0060]
f1，f2：是焦距为100毫米的双胶合透镜。它们与分光镜m4的距离都为100毫米。
[0061]
m1是凹面反射镜，焦距500毫米，距离m4约为500毫米。
[0062]
dm是可变形镜，是一种波前校正器，主要运用于各种自适应光学系统之中，通过改变光波波前传输的光程来改变入射光波波前的相位结构，从而达到对光波波面相位进行校正的目的。本系统中在dm上加载球差，对不同深度的焦点做球差矫正。dm位于凹面反射镜m1的后焦面，距离m1为500毫米。
[0063]
m2是凹面反射镜，焦距500毫米。dm位于凹面反射镜m2的前焦面，距离m2为500毫米。
[0064]
m3为普通反射镜，没有严格距离限制。
[0065]
m4为分光镜，会反射一部分光使其进入腔内循环，同时透射一部分光输出到双光子系统。其透射和反射比决定了脉冲输出的衰减速度。m4位于m2的后焦面附近，同时位于m1的前焦面附近，
[0066]
五个反射器件，组成了一个光路回形腔，即为本实施例的非稳回形腔。同时dm和m4位于m1和m2的焦面上，构成了一个循环的光学4f系统。整个非稳回形腔的腔长约为2m，可以通过调节m4到m1和m2的距离来调整非稳回形腔的长短，调整各个脉冲在物镜下z轴间隔
△
z的大小。
[0067]
光路描述：
[0068]
光束的聚焦变化：本实施例的非稳回形腔的光源为重复频率小于20mhz的飞秒激光光源。从激光器发出的单个脉冲标记为p0，平行光经过f1聚焦在m4附近，贴着m4的右边缘进入非稳回形腔。因为m1和f1构成共焦系统，因此经过m1后变为平行光，经过dm反射后依然是平行光。然后经过m2凹面反射后变为聚焦光，焦点在m4附近。
[0069]
光束的空间位置变化：p0经过m4后分为两束光，透射光p1和反射光p2。p1经过透镜f1后变为平行光输出到双光子显微系统中，p2重新进入回形腔开始第二轮循环。m4的分光点位于p0光束交点o处，z轴正方向
△
y的位置，因此p2与p0在垂直于光轴方向上有
△
y的位移。整个腔长为4f-l，p2的焦点比p0的焦点在光轴方向上滞后l。p2经过非稳回形腔后再次到达m4分为透射光p3和反射光p4。p3比p1垂直于光轴方向上分开
△
y，在双光子系统中在物镜下沿光轴方向上的焦点错开
△
z，
△
z＝l/m2。(注：光束序列p
2n-1
表示回形腔输出的脉冲序列，其中n表示脉冲在腔内循环的次数，m是o点到物镜焦点的光学放大率)
[0070]
光脉冲循环终止条件：
[0071]
相邻的输出光脉冲p
2n-1
与p
2n+1
每次在垂直于光轴方向上错开
△
y，经过多次循环后，p1与p
2n+1
最终在垂直光轴方向上累积的错位量为
△y×
n，如果这个累积错位量大于分光镜m4在垂直光轴y方向上的大小，则光束超过m4的左边缘输出，不再反射进入非稳回形腔，从而达到终止条件将剩余的能量全部输出。因此可以根据这个光束终止条件设计分光镜m4的大小，进而控制非稳回形腔产生的脉冲个数。
[0072]
光束的能量变化：
[0073]
m4的透射反射比决定了输出光束序列的能量衰减速度。设m4的透射反射比为η：1-η。初始光束能量为1，则输出光束序列p
2n-1
(n＝1,2,3,4
…
n)的能量为η(1-η)
n-1
，最终输出的光束p
2n+1
其能量为(1-η)
n-1
。
[0074]
在本发明的非稳回形腔中，可以搭配更任意分光比例的分光镜，实现任意脉冲序列的衰减速度的功能。
输入的地方原路返回。如果反射面为奇数，4f系统成的倒像和反射面的镜像相互抵消，每次循环都会使得光脉冲向同一个方向移动
△
y，这样才能满足非稳腔的设计，不会原路返回。
[0087]
本发明的技术方案已通过仿真和实验的验证，切实有效。
[0088]
如图2所示，脉冲序列p
2n-1
(n是经过回形腔的次数，n＝1,2,3，
…
)在能量、时间和空间上的差别。
[0089]
在图2-a中，脉冲p
2n-1
经过非稳回形腔的次数越多能量越低，呈指数衰减，衰减速度由回形腔的分光镜的透射比例决定。透射比率越大，衰减越快。脉冲p
2n-1
在时间上间隔6.7ns，为光走过非稳回形腔的时间。
[0090]
在图2-b中，脉冲序列p
2n-1
在空间上的分布。脉冲序列在光轴z方向是分开的，每经过一次非稳回形腔在z轴上聚焦滞后l，在垂直光轴y方向上错开
△
y，在垂直光轴x方向上不变。脉冲p1能量最强，聚焦在样品最深处。
[0091]
有益效果：
[0092]
1.在非稳回形腔中加入了波前校正器dm，对聚焦在折射率不匹配的样品中所产生的球差进行补偿，提高了z轴多焦点双光子成像的三维分辨率和荧光信号强度。
[0093]
2.设计了非稳回形腔，脉冲循环固定的次数后就全部输出腔外，降低了不同脉冲序列之间的交叉影响。非稳回形腔的另一大优点是可以搭配更任意分光比例的分光镜，实现任意脉冲序列的衰减速度的功能。
[0094]
3.在非稳回形腔中，采用凹面反射镜，相比现有技术中常用的双胶合透镜，改善了色散和光损失，提高了双光子成像荧光信号强度。
[0095]
在本发明的各实施例中，在回形腔内增加反射镜的个数，将凹面反射镜替换为透镜，改变透镜的焦距(但仍是4f系统)的系统设计方案都属于本发明保护的范畴。
[0096]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。