一种宽场移频超分辨显微成像系统

本发明涉及一种显微成像系统，尤其是涉及一种宽场移频超分辨显微成像系统。

背景技术：

1、宽场移频超分辨显微成像系统通过对照明光进行调制，可以从多张不同照明下的样品原始图像中提取出高空间频率的信息来提高分辨率，从而突破光学衍射极限，在生命科学领域尤其是活细胞观测领域有着较为广泛的应用场景。宽场移频超分辨显微成像系统通常可以将荧光显微镜的空间分辨率提高一倍左右，从而显示200nm以下的动植物细胞及其子结构。

2、目前，市面上的商用宽场移频超分辨显微成像系统多数都是通过衍射光栅等衍射器件来产生±1级的衍射光束，再投影到荧光显微镜的焦平面以产生干涉图案。例如，nikon公司的超分辨显微镜n-sim系列，使用机械平台控制光栅来产生不同方向和相位的条纹，但受限于机械结构的运行速度以及机械振动等问题，该方法成像速度较慢且稳定性不佳；以及公开号为cn108680544a的专利申请文件提供的显微成像装置，也是采用衍射光栅对调制后的光束进行衍射。另外，也有采用铁电液晶等来代替衍射光栅来进行干涉图案的改变的宽场移频超分辨显微成像系统，但是铁电液晶的低衍射效率，导致了其激光的利用率很低，一般不到10％，这对激光器的功率提出了很高的要求。总而言之，使用衍射器件获得超分辨成像用的干涉光时，由于通光量小、衍射级次利用率低等问题，极大地降低了光学系统整体的光能利用率，同时也限制了照明视场，而且目前大多数的衍射器件都由国外进口，价格昂贵，大幅提高了系统的成本。

3、现有公开号为cn115327757a的专利申请文件提供一种实现超高速结构光照明显微成像装置，包括第一偏振分束器，将照明光束分束，反射的光进入中心干涉光路，透射的光依次分为多个干涉子光路；与各多个干涉子光路对应的选通模块，用于控制各干涉子光路的选通状态；位于各干涉子光路上的第二偏振分束器，将各干涉子光路的光分为p偏振光和s偏振光；偏转合束模块，用于将中心干涉光路的光束与各干涉子光路的p偏振光和s偏振光合束；合束后照明到样品上，形成结构光照明图案并激发荧光，成像至图像采集模块，采用7路干涉子光路的设计，系统整体光路结构较为复杂，且较多的移相器件会对照明视场产生一定的限制。

4、可见，现有的方案都各自具有局限性。要实现宽场移频超分辨显微成像，需要全新的设计和方法，来满足系统简单且更大视场的要求。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种成本低，光能利用率高，且成像速度快的宽场移频的超分辨显微成像系统。

2、为实现上述发明目的，所采用的技术方案为：

3、一种宽场移频超分辨显微成像系统，包括生成线偏振激光束的发光模块；将所述的线偏振激光束分解为相干光束的干涉光产生模块；将相干光束投射到样品上形成照明光干涉图案并收集样品激发的荧光信号成像的显微成像模块；所述的干涉光产生模块包括：

4、分束与偏振调节模块，用于将所述发光模块的线偏振激光分解为光强相等且偏振方向一致的第一相干光束、第二相干光束和第三相干光束；

5、移相模块，用于对所述的第二相干光束和第三相干光束进行相位移动；

6、合束模块，用于使所述的第一相干光束、第二相干光束和第三相干光束合束后进入显微成像模块。

7、相较于现有技术，本发明的干涉光产生模块采用分束与偏振调节模块结合移相模块和合束模块来代替衍射器件，使用非衍射器件来进行照明光的获取，不需要使用衍射器件和扫描振镜等器件来改变干涉条纹的方向，不仅大大降低了成本，同时极大程度提高了光能利用率，能够很大程度降低激发光的损耗，在不考虑器件损耗的条件下可以达到100％的利用率，因此允许低功率激光器的使用，并且不会受到衍射器件带来的通光量限制，能够更大程度扩大照明视场，提高样品表面照明的光通量；通过移相模块快速改变光束的相位能够实现条纹的高速横向移动，可以有效提高系统的成像速度，进而通过显微成像模块能够实现超分辨成像。

8、优选的，所述的发光模块包括激光器和激光准直器，激光器发出的线偏振激光束经激光准直器后得到准直的线偏振激光束。

9、进一步优选的，所述的激光器为多色激光器，通过内部的声光调制器控制各色激光的开关以及波长的切换，以实现多色成像。

10、优选的，所述的分束与偏振调节模块包括依次设置的第一偏振分束器和第二偏振分束器，由第一偏振分束器出射的反射光束为第一相干光束，第一偏振分束器出射的投射光被第二偏振分束器反射和投射，由第二偏振分束器出射的反射光束和透射光束分别为第二相干光束和第三相干光束。

11、进一步优选的，所述的分束与偏振调节模块还包括：

12、设置在第一偏振分束器入射面前的第一二分之一波片，用于调节从所述的第一偏振分束器出射的反射光束和透射光束的光强比；

13、设置在第一偏振分束器反射光路的第二二分之一波片，用于改变第一相干光束的偏振方向；

14、设置在第二偏振分束器入射面前的第三二分之一波片，用于调节从所述的第二偏振分束器出射的反射光束和透射光束的光强比；

15、设置在第二偏振分束器透射光路的第四二分之一波片，用于改变第三相干光束的偏振方向。

16、本发明优选的技术方案中，分束与偏振调节模块包括第一偏振分束器、第二偏振分束器、第一二分之一波片、第二二分之一波片、第三二分之一波片和第四二分之一波片；第一二分之一波片设置在第一偏振分束器入射面前用于调节从第一偏振分束器出射的反射光束和透射光束的光强比，第一偏振分束器出射的反射光束产生第一相干光束，第二二分之一波片设置在第一偏振分束器的反射光出射面后用于改变第一相干光束的偏振方向，第一偏振分束器的透射光束是第二偏振分束器的入射光束，第三二分之一波片设置在第二偏振分束器入射面前用于调节从第二偏振分束器出射的反射光束和透射光束的光强比，第二偏振分束器出射的反射光束产生第二相干光束，第二偏振分束器出射的透射光束产生第三相干光束，第四二分之一波片设置在所述的第二偏振分束器的透射光出射面后用于改变第三相干光束的偏振方向。使第三相干光束在通过后面的移相模块后保持最大的光强。另外，在其他优选的技术方案中，可以采用具有与上述器件相同作用的光学元件进行替代。

17、优选的，所述的移相模块是设置在所述的第二相干光束光路上的第一电光调制器和设置在所述的第三相干光束光路上的第二电光调制器。通过对第一电光调制器以及第二电光调制器的电压进行控制，能够快速精准移动相位以得到不同的干涉图像，通过改变加载到电光调制器的电压来控制照明干涉图案的高速移动。

18、优选的，所述的合束模块包括用于将第一相干光束、第二相干光束和第三相干光束进行合束的合束器，以及位于分别位于所述第一相干光束、第二相干光束和第三相干光束的光路上的第五二分之一波片、第六二分之一波片和第七二分之一波片，用于将对应相干光束的偏振方向改变为三束光束所在的轴的投影点形成的圆的切线方向，也就是形成切向偏振。

19、进一步优选的，所述的合束器包括三个的直角棱镜反射镜和一合束反射镜，所述的第一相干光束、第二相干光束和第三相干光束分别在对应的一个直角棱镜反射镜上偏转后入射在合束反射镜上实现合束并反射进入所述的显微成像模块。本发明中，通过固定角度的直角棱镜反射镜来进行合束来确定干涉光束的角度，增强了系统的稳定性。

20、优选的，所述的合束反射镜与显微成像模块之间依次设置有第一透镜、第一管镜和第九反射镜，所述合束反射镜将合束后的光束反射到第一透镜，经过第一透镜和第一管镜，在第九反射镜处反射后入射到所述的显微成像模块。

21、进一步优选的，所述的第一透镜和所述的第一管镜构成具有光束直径扩大功能的4f系统，用于尽可能地扩大系统的视场，提高系统的光通量。

22、优选的，所述的显微成像模块包括沿光路依次设置的第二管镜、二向色镜、显微物镜、第二透镜、滤光片和cmos相机，所述的第二管镜将合束后的光束通过二向色镜传输到显微物镜的后焦面上，由显微物镜将合束后的光束以平行光方式入射到样品上，在样品表面形成六边形晶格状干涉图案的照明并激发的荧光信号，样品激发的荧光信号透过所述二向色镜，经过第二透镜和滤光片后，由cmos相机采集。

23、与现有技术相比，本发明的优点在于：

24、(1)使用非衍射器件来进行照明光的获取，不需要使用衍射器件和扫描振镜等器件来改变干涉条纹的方向，降低了成本，同时极大程度提高了光能利用率，并且不会受到衍射器件带来的通光量限制，同时移相器件更少，能够更大程度扩大照明视场，提高样品表面照明的光通量；

25、(2)通过移相模块快速改变光束的相位能够实现条纹的高速横向移动，可以有效提高系统的成像速度，进而通过显微成像模块能够实现超分辨成像；

26、(3)本发明的装置结构更加简单，器件更少，系统所占面积和体积更小，有利于系统的集成化、小型化；

27、(4)本发明采用六边形晶格状干涉图案来对样品表面进行照明，与传统超分辨成像使用的正弦干涉条纹相比，传统正弦条纹需要切换3个方向的照明，并在每个方向进行3次的相位移动，而六边形晶格状照明则不需要切换照明方向，能够简化成像时的控制流程，并提高拍摄速度。