本发明涉及超分辨荧光显微,特别是涉及一种基于振幅调制的空间谱估计晶格照明显微装置与方法。
背景技术:
1、在活体细胞成像领域,光学显微技术以其无损、非接触成像的性质在众多方法中脱颖而出,而光学衍射极限的存在限制了其成像分辨率。为了实现对更小尺寸细胞及亚细胞级别生物样品的观察,提高光学显微技术的成像分辨率具有重要意义。
2、晶格照明(lattice sim)超分辨荧光显微成像技术,用dmd生成晶格照明,光斑图案只做横向移动,没有旋转步骤,避免了因机械控制精度低导致的伪影。然而,该方法利用sim2对低分辨率图像进行重构,成像空间分辨率最高可达60nm,然而对于神经突触的信息传递和外泌体调节免疫应答等生物过程的研究要求分辨率优于50nm,lattice sim无法满足要求,需要进一步提高成像分辨率。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术存在的缺陷,本发明提供了一种基于振幅调制的空间谱估计晶格照明显微装置与方法,可以解决lattice sim成像空间分辨率低的问题。
2、本发明采用的技术方案在于:
3、一种基于振幅调制的空间谱估计晶格照明显微成像装置,包括激光光源,沿激光光源的光线传播方向依次设有准直扩束镜、反射镜,dmd、准直透镜、中继透镜、管镜、二向色镜、物镜、荧光样品、滤光片、集光透镜和相机。
4、激光光源出射光通过准直扩束镜和反射镜后,形成平行光入射到dmd表面,dmd表面产生的点阵列图案使光束经过准直透镜和中继透镜,会聚于管镜与中继透镜的公共焦面。管镜和物镜组成无限远成像系统,管镜的后焦面与物镜前焦面为一组共轭面,在物镜的前焦面产生晶格照明。样品发出的荧光经物镜收集以及二向色镜和滤光片滤除杂散光后经集光透镜会聚于前焦面,相机感光平面与集光透镜前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。
5、一种基于振幅调制的空间谱估计晶格照明显微成像方法,包括以下步骤:
6、s1、由激光器发射的光束沿光传输路径入射到dmd的反射表面上,经dmd调制后,在荧光样品上形成晶格照明;
7、s2、随时间变化调整dmd的反射图案实现照明光的振幅调制,所有照明图案累积结果分布均匀;
8、s3、利用ccd相机采集由荧光样品在随时间变化的晶格照明下生成的低分辨率图像序列;
9、s4、利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构,获得高分辨率图像。
10、作为本发明更优的技术方案,所述步骤s2中照明光由数字微镜器件调制振幅生成晶格照明。所述的dmd(4)是一种由多个高速数字式光反射开光组成的阵列,通过控制微镜片绕固定(轭)的轴旋转和时域响应(决定光线的反射角度和停滞时间)来决定成像图形和其特性。
11、作为本发明更优的技术方案,所述步骤s4中由空间谱估计处理低分辨率图像序列的重构得到高分辨率图像,其特征在于,对低分辨图像序列组成矩阵的协方差矩阵进行特征值分解,基于信息论方法中的最小描述长度准则(mdl),根据成像系统噪声模型,通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ0。大于的σ0特征值对应的特征向量代表信号r:{uσi=0},其他特征向量代表n:{uσi=0};
12、求解点扩散函数在信号子空间、噪声子空间的特征向量上的投影分别为dpr(r′test)和dpn(r′test):
13、
14、
15、式(1)中,dpr(r′test)为点扩散函数在信号子空间的特征向量上的投影,uσi=0为奇异值对应的特征向量。
16、式(2)中,dpn(r′test)为点扩散函数在噪声子空间的特征向量上的投影。
17、dpr(r′test)和dpn(r′test)的比值为指示函数。判别测试点有无荧光探针,当测试点为有荧光探针时,指示函数分母的值无限趋近于零,导致指示函数的值极大,否则指示函数的分子接近于0,指示函数的值较小,通常小于1,以指示函数的值为重构的结果,能清晰地区分出样品与背景噪声,提高图像分辨率。
18、本发明的有益效果是:
19、1.利用dmd生成晶格照明,相机采集低分辨率图像;平均照明图案均匀,可避免因散斑照明不均匀,采样不充分导致的图像失真,且当光子预算相同时,在晶格照明的条件下可以减少无效照明,提高图像的信噪比,最大程度避免光漂白,延长荧光探针的发光时间;
20、2.再根据特征值大小将特征向量分为信号特征向量和噪声特征向量,利用两个子空间的正交特性构造出“针状”空间谱峰,最后通过谱峰搜索重构出超分辨图像,可以兼顾成像的高时空分辨率。
1.一种振幅调制的空间谱估计晶格照明显微方法,其特征在于,将空间谱估计与晶格照明荧光显微成像技术结合,由数字微镜器件(dmd)(4)调制振幅产生的晶格照明下的低分辨率图像序列的重构由空间谱估计处理得到高分辨率图像。
2.根据权利要求1所述的一种振幅调制的空间谱估计晶格照明显微方法,其特征在于,包括以下步骤:
3.根据权利要求1所述的一种振幅调制的空间谱估计晶格照明显微方法,其特征在于,所述步骤s2中照明光由数字微镜器件调制振幅生成晶格照明。所述的dmd(4)是一种由多个高速数字式光反射开光组成的阵列,通过控制微镜片绕固定(轭)的轴旋转和时域响应(决定光线的反射角度和停滞时间)来决定成像图形和其特性。
4.根据权利要求2所述的一种振幅调制的空间谱估计晶格照明显微方法,所述步骤s4中由空间谱估计处理低分辨率图像序列的重构得到高分辨率图像,其特征在于,对低分辨图像序列组成矩阵的协方差矩阵进行特征值分解,基于信息论方法中的最小描述长度准则(mdl),根据成像系统噪声模型,通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ0。大于的σ0特征值对应的特征向量代表信号r:{uσi=0},其他特征向量代表n:{uσi=0};
5.一种振幅调制的空间谱估计晶格照明显微装置,用于实现权利要求1所述的一种振幅调制的空间谱估计晶格照明显微方法。装置包括激光光源(1),沿激光光源(1)光线传播方向依次设有准直扩束镜(2)、反射镜(3)、dmd(4)、扫描透镜(5)、中继透镜(6)、管镜(7)、二向色镜(8)、物镜(9)、荧光样品(10)、滤光片(11)、集光透镜(12)和相机(13)。
6.根据权利要求4所述的一种振幅调制的空间谱估计晶格照明显微装置,其特征在于,激光光源(1)出射光通过准直扩束镜(2)和反射镜(3)后,形成平行光入射到dmd(4)表面,dmd(4)表面产生的点阵列图案使光束经过准直透镜(5)和中继透镜(6),会聚于管镜(7)与中继透镜(6)的公共焦面。管镜(7)和物镜(9)组成无限远成像系统,管镜(7)的后焦面与物镜(9)前焦面为一组共轭面,在物镜(9)的前焦面产生晶格照明。样品(10)发出的荧光经物镜(9)集光以及二向色镜(8)和滤光片(11)滤除杂散光后经集光透镜(12)会聚于前焦面,相机(13)感光平面与集光透镜(12)前焦面重合而采集到荧光样品(10)的成像结果。ccd相机(13)采集每一扫描位置被照明区域内荧光样品(10)闪烁过程中所生成低分辨率图像序列。dmd(4)产生不同的点阵列图案可以改变物镜(9)前焦面的强度分布,对荧光样品(10)进行随时间变化的扫描,相机(13)配合dmd(4)的时钟进行图像采集,dmd(4)的所有照明图案累积结果分布均匀。