本发明在第一个观点中涉及根据权利要求1的前序部分的用于检查试样的显微镜。本发明在第二个观点中涉及根据权利要求23的前序部分的用于检查试样的显微术方法。
背景技术：
1、按类属的显微镜至少具有下列组成部分：光源，用于提供对试样进行照明的照明光；具有显微镜物镜的照明光路，用于将照明光导引到试样上，其中，照明光路具有望远镜式光学器件用以提供光瞳平面和居间像平面；探测器，用于检测试样因受到照明光的照射而发射出的放射光；具有显微镜物镜或者具有另外的显微镜物镜的探测光路，用于将放射光导引到探测器上；和控制单元，用于驱控光源和用于评估探测器的测量数据。
2、在按类属的用于显微术的方法中至少执行下列方法步骤：经由具有显微镜物镜的照明光路将照明光导引到试样上，其中，照明光路具有望远镜式光学器件用以提供光瞳平面和居间像平面，将由试样因受到照明光的照射而发射出的放射光经由具有显微镜物镜或具有另外的显微镜物镜的探测光路导引到探测器上并且由控制单元评估探测器的测量数据。
3、按类属的显微镜和按类属的方法已知有多种设计方案和变体，例如由de 10 2022103 051 a1所已知。
4、对许多显微技术而言，以尽可能均匀的、即均等的强度分布照亮试样平面中的区域是所期望的。这种照明模式也被称为平顶照明。
5、此外，相干照明经常也是所期望的，尤其是当使用slm（slm = spatial lightmodulator，即空间光调制器）来调制照明光时。
6、过去，已研发出了大量技术，以便将高斯形的激光束型廓改形成相干的平顶光束型廓，其中，主要存在三种方案来达到均匀的和相干的照明。
7、在第一种能较为简单地实现的可行方案中，将具有高斯形的光束型廓的激光束用光圈、例如机械的构件或有涂层的光学器进行裁切，使得最终仅使用光束的靠近光轴的区域，在该区域中，强度分布基本上是均匀的。在一个变体中，可以采用衍射的元件，用以从有待整形的高斯光束中切割出期望的光束分量。然后可以利用该衍射的元件的楔形相位将高斯光束的期望的分量与不期望的分量在空间上分开 [salter]。通过使楔形相位图案与有待整形的高斯光束在空间上相适配，可以提高均匀化程度 [nakata]。这些方法的缺点是，被光圈遮挡的光线和借助衍射的元件移除的光分量丢失并且不再可供使用。
8、达到平顶照明的另一种可行方案在于，通过光学器件重新分配高斯光束的强度分布，即，使得在该光学器件的输出端处生成了期望的光束型廓。
9、例如，光束能够在空间上被分割并且这些单体可以借助聚焦性的光学器件在较小的面积中再次叠加。这可以例如用微透镜阵列（mla）实现。也可行的是，采用反射性的光学器件，其中，一个或多个反射镜承担起mla的功能。然而，由于多个分光束在空间上的叠加，使得在光束整形模块之后无法确保平坦的波前，因此也无法确保空间相干性，并且光束型廓或多或少程度地“带有斑点”（英文：speckle = 斑点、光斑）。
10、用多模纤维能以如下方式执行光束整形，即，让作为高斯模式入射的光线在多模纤维中激发大量空间模态。通过在纤维中的模态混合在纤维末端处产生了均匀的光束型廓。纤维横截面的形状在此给定了在纤维末端处的光束形状。由于纤维模态的叠加，使得产生了带有斑点的、因此不是完全均匀的光束型廓（英文speckled = 有斑点、有光斑）。在纤维输出端处的光通常不在空间上相干或者仅部分相干。另一种实现均匀化的可行方案是光导棒（https://www.edmundoptics.de/c/light-pipes-homogenizing-rods/697/）。
11、经由光功率的再分配进行对激光束的强度型廓的成形能用折射的光学器件尤其是在使用非球面透镜的情况下实现，但也能用诸如doe（doe = diffractive opticalelement = 衍射光学元件）或slm的衍射的部件实现。衍射的光学器件不仅可以被设计成透射式的，例如具有透射的slm和/或透射的doe，或可以设计成反射式的，例如具有lcos-slm（lcos = liquid crystal on silicon = 硅基液晶）和/或反射的doe [midelphotonics]。doe的缺点是，它们针对特定的波长进行了优化，因此是单色的。
12、为了将高斯光束转换成具有期望的均匀的强度型廓的光束，驱控doe或slm时必须使用的相位函数可以在使用gerchberg-saxton算法（gs算法）的情况下确定。但这个算法的缺点是，相位在光束整形之后不是平坦的，而是混乱的。对相位的修正能够借助在光学共轭平面中的第二相位调制器来执行 [jesacher]。在gerchberg-saxton算法中，借助迭代的方法计算相位图案，当该相位图案在给定的照明下在位于光束上游的光瞳平面中的空间光调制器上呈现时，在居间图像中产生了期望的照明图案。居间图像和光瞳以原则上已知的方式经由傅立叶变换相互关联。原则上能够产生任意的图案，也能够产生三维的图案，然而，其中，该算法需要相当大的计算量 [ger72]。
13、此外还提出了另外的算法以针对用于在全息图中减少“斑点”，因此减少光束型廓与均匀性的斑点状的偏差的方案 [schmidt]。但随着算法复杂度越来越高，光效率随之降低。
14、最后，已知一种名为“普遍相位对比”的方法，在该方法中，在居间像平面中生成了有待成像的图像的相位图案 [glückstad]。然后产生共路干涉仪，在共路干涉仪中，在光瞳平面中安装了针对低空间频率具有相偏pi的矩形或圆形的相位掩模（相位对比滤光片）。然后可以从相移的低空间频率与未经调制的较高空间频率的干涉中恢复有待成像的图像的强度型廓。
15、在所提到的措施中，可以通过对激光束的空间裁切、用折射的光学器件进行的光束再分配以及在共轭的傅里叶平面中的由两个doe构成的组合来达到空间上相干的光束整形。
16、空间相干性在此涉及到在光束整形后的经整形的光束的平坦的相位。如上文所述，通过裁切空间上的光束型廓实现的光束整形由于高的功率损失而通常并不适宜。
17、以借助折射的光学器件实现的光束再分配为基础的光束整形单元由柏林的adl-optics公司（产品：πshaper；http://pishaper.com/shaper.html）和耶拿的asphericon公司（产品：atopshape；https://www.asphericon.com/produkte/beamtuning/strahlformung）市售可得。
18、还已知的是，折射的光学器件或衍射的光学器件借助3d打印法和/或在使用纳米结构和/或超材料的情况下直接在单模纤维的纤维末端上完成。除了实现原本的光束整形的组成部分外，也可以用3d打印法打印用来准直已整形的光束的球面的和非球面的光学器件。
19、例如由us 2022/0308354 a1已知有远场平顶整形器，它们产生了艾里式强度分布，艾里式强度分布通过在远场中的传播变成平顶分布。用透镜可以对艾里光束型廓进行傅里叶变换并且在透镜焦点中获得了平顶分布。与之相反的是，近场平顶整形器在近场中产生了平顶区域，即直接在光束整形光学器件之后产生。
20、当在使用折射的光束整形单元或光束再分配器的情况下由高斯光束产生平顶光束时，可以在相应地选择光学器件的情况下至少部分地、例如在可见（vis）光谱范围内消色差地实现光学的结构 [us2004264007a1、us6487022b1]。在这种光束整形中被视为不利的是，平顶光束形状与高斯光束相比由于球面相位没有完全修正而不是传播不变的。
21、这种事实情况借助图1 [laskin laskin]说明，在那里示出了激光束沿其在自由空间中的传播在四个不同的轴向地点处的强度型廓的发展。虽然在图1a中所示的状况下存在了平顶分布，但该型廓随着激光束的沿传输方向的传播经过图1b）和1c）中的分布而发生变化，直至最后在图1d）的远场中以具有艾里函数形式的、因此具有平顶型廓的傅里叶变换形式的光束分布存在。
22、虽然在光束整形单元的光束下游的轴向区域（在该轴向区域中存在期望的平顶分布并且由未完全修正的球面的像差引起的光束变换能以图1所示的方式忽略）在市售可得的单色光束整形单元中是1.5 m。但对于在可见（vis）辐射范围内的消色差的光束整形单元来说，这个值减小到了几厘米。对使用3d打印法打印的光学器件而言就这方面还未看到任何数据。
23、为了能够利用折射的光束整形单元的消色差特性，必须将照明光路的其内存在平顶分布的区域成像到照明光路的其内需要使用平顶照明的区域或平面中。这可以例如如在[laskin laskin]中所述那样在使用4f望远镜式成像的情况下完成。在[laskin]中已经描述了在使用lcos-slm和dmd-slm（dmd = digital mirror device = 数字镜装置）的情况下平顶照明用来产生计算机生成的全息图的应用。
24、用其能达到比阿贝极限更好的分辨率的显微术方法被认为是高分辨率的显微术。除了基于激光扫描显微术的措施，如sted显微术（sted = stimulated emissiondepletion，受激发射损耗）、resolft显微术（resolft = reversible saturable opticallinear fluorescence transitions，可逆饱和光学荧光跃迁）、minflux显微术（minflux =minimal emission fluxes，最小发射通量）、艾里扫描方法（对探测点模糊函数psf的高分辨率扫描，psf = point spread function，点扩散函数）和ism显微术（image scanningmikroskopie，图像扫描显微术）之外，也存在一些基于宽场照明的措施。在此，属于相关技术的有：用结构化照明的显微术sim（sim = structured illumination microscopy，结构化照明显微术）和sml显微术（smlm = single molecules localization microscopy，单分子定位显微术），属于sml显微术的例如有：palm显微术（palm = photoactivatedlocalization microscopy，光激活定位显微术）、(d)storm显微术（[direct] stochasticoptical reconstruction microscopy，（直接）随机光学重建显微术）和paint显微术（paint = point accumulation for imaging in nanoscale topography = 点累积纳米成像技术）。
25、sim方法基于对试样的结构化的照明，试样用合适的荧光染料着色。已经证实实用的是，为此采用相位光栅的衍射级，相位光栅可以静态地产生或通过布置在居间像平面中的空间光调制器或slm产生。光栅的衍射级被作为点成像到显微镜物镜的光瞳中。然后，通过光束的干涉在试样平面中生成了光栅结构。通常只使用光栅的最低的衍射级。替选地，也可以将振幅光栅成像到试样平面中。如果将非相干的光用于sim，则必须采用振幅光栅。由于在振幅光栅处的光损耗，使得相位光栅更为优选。相位光栅的+-1衍射级和0衍射级可以成像到显微镜物镜的光瞳中，其中，照明光点应当尽可能小。然后可以用+-1衍射级和0衍射级的干涉产生在照明平面中的光栅结构。
26、在smlm措施中，执行了对用合适的荧光染料着色的试样的宽场照明。视所述措施而定，染料分子的闪烁机制可以经由不同的波长（palm），照明的强度（dstorm）或试样本身（paint）来启动。可以探测每次闪烁事件并且然后可以基于计算机地对荧光分子定位。此外，为了避免干扰性的背景和/或达到更好的表面灵敏度，还可以使用tirf照明（tirf =total internal reflection，全内反射）。
技术实现思路
1、可以视作本发明的任务的是，说明一种显微镜和一种用于显微术的方法，其中，能为不同的显微术方法使用平顶照明。
2、这个任务通过一种具有权利要求1的特征的显微镜和一种具有权利要求23的特征的用于显微术的方法解决。
3、根据本发明的显微镜的有利的实施例和根据本发明的方法的优选的变体在下文中尤其是结合从属权利要求和附图来阐释。
4、根据本发明，上述类型的显微镜通过如下方式改进，即，使得照明光路具有至少部分消色差的光束整形单元，用以在光束整形单元的近场中提供相干的平顶区域，其中，相干的平顶区域处在居间像平面的或另外的居间像平面的区域中。
5、根据本发明，上述类型的方法通过如下方式改进，即，使得在照明光路中在居间像平面的或另外的居间像平面的区域中用至少部分消色差的光束整形单元提供相干的平顶区域。
6、对于根据本发明的显微镜来说，由于相干性的要求，使得主要考虑使用激光器作为光源，但其他的光源也是可行的。也可以称为激发光的照明光是优选在可见光范围内和邻近的范围内的电磁辐射。关于有待检查的试样方面原则上不存在任何限制。通常，有待检查的试样是生物试样。
7、术语“照明光路”指的是所有引导光束和改变光束的光学部件，如显微镜物镜、透镜、反射镜、棱镜、光栅、滤光片、光圈、分束器、调制器、例如空间光调制器（slm），利用这些光学部件并且经由这些光学部件，使得光源的激发光被导引到直至有待检查的试样上。改变光束的部件也包括色散的元件和尤其是衍射的元件。原则上可以使用市售可得的显微镜物镜。
8、术语“光瞳平面”指的是尤其是与照明光路的或探测光路的光轴垂直的如下平面：该平面与各自的显微镜物镜的后焦平面光学共轭。术语“居间像平面”指的是尤其是与照明光路或探测光路的光轴垂直的如下平面：该平面与各自的显微镜物镜的像平面光学共轭。
9、在本说明书中，当提到部件处在光瞳平面中或居间像平面中时，总是隐含如下意思，即，该相关的部件位于各自的光瞳平面附近或位于各自的居间像平面附近。这方面本来就已经很清楚，这是因为无论光瞳平面还是居间像平面都不是数学意义上的平面，并且这是因为在此所关注的部件、例如空间光调制器和其他部件，分别在光轴方向具有有限的延展范围。
10、放射光是试样受到激发光照明而发射出的电磁辐射。“发射出”意指，探测光来自试样。放射光也可以指的是探测光。放射光可以被试样反射回来，或者可以是透射通过被照明的试样的光。放射光典型地可以是来自用于制备试样的荧光标记的与激发光相比发生红移的荧光。
11、可以使用能在市面上买到的探测器作为探测器。特别优选地使用半导体探测器。探测器尤其可以是二维空间分辨的探测器，也就是是摄像头，例如ccd、cmos或spad阵列摄像头。然而对于某些显微技术，例如其中让照明点或照明线在试样上进行扫描或扫描通过试样的那种显微技术而言，可行的是，使用点形探测器、例如光电倍增管，或者使用线形探测器、例如ccd或cmos线阵或线性spad阵列。
12、术语“探测光路”指的是所有导引光束的和改变光束的光学部件，如物镜、透镜、反射镜、棱镜、光栅、滤光片、光圈、分束器、调制器，如空间光调制器(slm)，用这些光学部件并且经由这些光学部件，使得探测光从有待检查的试样被导引直至探测器上。照明光路的显微镜物镜和探测光路的显微镜物镜可以是一个且同一个显微镜物镜。例如在其中试样从一个且同一个方向被照明并进行观察的反射光式显微镜中可能是这样的情形。然而，照明光路的显微镜物镜也可以不同于探测光路的显微镜物镜。例如，在透射光式显微镜和在其中试样被斜向照明的反射光式显微镜中或在光片显微镜中是这样的情况。
13、在照明光路中，为了改变在试样上或试样中应当用激发光照射的地点，存在扫描仪，例如具有检流计式反射镜或mems反射镜，它们准静态地或共振地运行。特别优选地，扫描仪反射镜布置在光瞳平面中或布置在照明光路的光瞳平面的附近。然而，扫描仪对实现本发明而言不是强制性必需的。
14、术语“控制单元”指的是与根据本发明的显微镜的部件协同作用以使这些部件按规定工作的所有的硬件部件和软件部件。尤其地，控制单元可以具有计算装置，例如pc，和摄像头控制部。控制单元的计算器资源可以被分配到多个计算机上，并且必要时分配到计算机网络上，尤其是也可以经由互联网进行分配。控制单元可以尤其是具有常用的操作设备和外围设备，如鼠标、键盘、屏幕、存储介质、操纵杆、互联网连接部。控制单元尤其可以从探测器读取图像数据，并且也可以用于并被设立成用于驱控光源。根据本发明，控制部至少被设立成用于驱控光源和评估探测器的测量数据。当例如存在空间光调制器时，控制单元也可以适宜地被设立成用于驱控这些光调制器。控制单元例如通过缆线与所驱控并评估它们的测量数据的部件以有效的方式连接。
15、相干的平顶区域应当被理解为在照明光路中具有有限的轴向延展范围和有限的横向延展范围的区域，在该区域中，照明光具有基本上均匀的和相干的光分布。根据本发明，光束整形单元至少部分是消色差的，也就是说，光束整形单元至少在有限的波长区间中提供相干的平顶区域，相干的平顶区域除了波长之外基本上具有相同的特性。光束整形单元也可以被称为光束整形模块或平顶整形器。
16、可以被视为是本发明的主要构思是，在显微镜的照明光路中为了提升照明的光学质量而布置有光束整形单元用以提供至少部分消色差的相干的平顶区域。
17、可以被视为本发明的主要优点的是，使得已知的显微术方法，例如sim显微术和tirf显微术能以提升的质量实现。尤其可以在使用本发明的情况下提供了多模态的显微镜，用这些多模态的显微镜能执行不同的显微术方法。
18、在本发明中，为了生成相干的平顶区域原则上可以使用上述不同的至少部分消色差的光束整形单元。在一种有利的变体中，光束整形单元具有用于光束再分配的折射的光学器件或者由这种光学器件形成。优选地，光束整形单元在可见光的范围中或者在可见光的部分范围中是消色差的。本发明的应用于是对照明光的多种不同的波长和对多种不同的染料来说是可能的。
19、此外，光束整形单元具有结构化的光纤或者由结构化的光纤形成。在光纤的纤维末端处在此可以尤其是通过3d打印法成型有折射的光束整形器。补充地，在光纤的纤维末端处可以尤其是通过3d打印法成型有准直透镜。
20、对将根据本发明的显微镜用于用结构化的照明进行的显微术而言是优选的是，光束整形单元是偏振保持型的。
21、在光束整形单元的光束上游可以布置着第二望远镜式光学器件，该第二望远镜式光学器件被用于使来自光源的照明光与光束整形单元的输入孔径相适配。此外，照明光路在光源与第二望远镜式光学器件之间具有光学的单模纤维，从而使得输送给光束整形单元的照明光具有高斯形的强度型廓。
22、望远镜式光学器件可以具有第一透镜和第二透镜，经由这些透镜提供了在显微镜物镜的后焦平面的4f成像或居间像平面。照明光路的镜筒透镜可以是另外的望远镜式光学器件的一部分。
23、不同的显微镜物镜通常具有不同尺寸的进入光瞳。此外也可能的是，各自的显微镜物镜的进入光瞳的轴向的位置分别是不同的。为了与各不同的显微镜物镜的进入光瞳的不同的尺寸和/或不同的轴向位置相适配，可能有利的是，镜筒透镜是能轴向调整的。
24、替选或补充地，照明光路为了调适照明光可以在显微镜物镜的后焦平面中具有能调设的准直光学器件。准直光学器件可以具有至少一个能轴向移动的透镜、尤其是两个能轴向移动的透镜。替选或补充地，准直光学器件可以具备至少一个带有能调设的焦距的透镜、尤其是两个分别带有能调设的焦距的透镜。此外，准直光学器件还可以替选或补充地具有至少一个带有多个焦距不同的透镜的透镜转换器、尤其是两个带有多个焦距不同的透镜的透镜转换器。最后也可能的是，望远镜式光学器件通过准直光学器件实现。
25、在一种特别优选的实施例中，照明光路在居间像平面的或另外的居间像平面的区域中具有能枢转的反射镜用以在显微镜物镜的后焦平面中横向移动照明光点。为了枢转也可以被称为tirf反射镜的能枢转的反射镜，可以存在能驱控的致动器。
26、替选或补充地，照明光路可以在光瞳平面的或另外的光瞳平面的区域中具有能线性移动的光学器件来产生横向的光束偏移以便在显微镜物镜的后焦平面中横向移动照明光点。也可以被称为tirf滑动件的能线性移动的光学器件，可以是能选择性地从照明光路中移除的。为了移动能线性移动的光学器件，可以存在能驱控的致动器。
27、tirf反射镜和/或tirf滑动件可以有利地被用于tirf显微术和/或hilo显微术（hilo-microscopy = highly inclined and laminated optical sheet microscopy，高度倾斜和层压的光学片显微术）。hilo显微技术例如使用在sml显微术（sml = singlemolecule localization = 单分子定位）中。
28、于是，控制单元被适宜地设立成用于驱控用来枢转能枢转的反射镜的致动器和/或用来移动能线性移动的光学器件的致动器，尤其是用以执行tirf显微术和/或hilo显微术。
29、照明光可以在照明光路的居间像平面或另外的居间像平面中和/或光瞳平面或另外的光瞳平面中被操纵用以执行期望的显微术方法。
30、为了将显微镜用于用结构化的照明（sim）进行的显微术，在居间像平面或另外的居间像平面中可以存在尤其是能调设的波前调制器。波前调制器可以例如通过能移动的、尤其是能线性地和优选双轴地移动的光栅实现。有利地，光栅可以是能选择性地从照明光路中移除的。为了操作、也就是说线性地移动光栅，可以存在能驱控的致动器。控制单元可以有利地被设立成用于驱控光栅的致动器，尤其是用于执行sim显微术。
31、在另一种优选的设计方案中，波前调制器具有至少一个空间光调制器。
32、原则上可能的是，在居间像平面中或者在居间像平面的附近的空间光调制器和/或可能存在的另外的空间光调制器由振幅调制的空间光调制器形成。然而有利的是，空间光调制器中的一个、多个或每个空间光调制器均由相位调制的空间光调制器形成。相位调制的空间光调制器通常由于较小的光损耗而是优选的。
33、于是，空间光调制器中的一个、多个或每个空间光调制器可以由反射性的空间光调制器形成。但也可能的是，空间光调制器中的一个、多个或每个空间光调制由透射性的空间光调制器形成。
34、例如，空间光调制器中的一个、多个或每个空间光调制可以由下列部件中的一个或多个部件形成：dmd（digital mirror device，数字镜器件）、向列的slm、lcos显示器（lcos=liquid chrystal on silicon，硅基液晶）、可变的相位板、能驱控的能变形的反射镜（dm = deformable mirror，能变形的镜）。
35、有利地，控制单元可以被设立成用于驱控空间光调制器，尤其是用以执行tirf显微术、hilo显微术和/或sim显微术。控制单元也可以被设立成用于驱控空间光调制器以使照明光与显微镜物镜的可变的光瞳相适配。由此可以至少部分和必要时完全实现上述能调设的准直光学器件的功能，从而使得准直光学器件必要时是不必要的。
36、为了sim显微术的目的，照明光路在居间像平面或另外的居间像平面附近具有一个能双轴地枢转的摆动板或两个分别能单轴地枢转的摆动板。一个摆动板或多个摆动板用于移动照明光的用于sim显微术的、由在居间像平面中的光栅和/或空间光调制器生成的结构。控制单元可以适宜地被设立成用于驱控一个用来使摆动板双轴地枢转的致动器或多个用来使单轴的摆动板枢转的致动器。一个致动器或多个致动器可以例如是如在扫描仪中所用类型的检流计式致动器。
37、在光瞳平面或另外的光瞳平面中可以存在空间光调制器，该空间光调制器例如可以用于在试样中产生照明图案、例如用于产生计算机生成的全息图以照明试样。控制单元可以被设立成用于驱控在光瞳平面或另外的光瞳平面中的空间光调制器用以在试样中产生照明图案、例如用于生成计算机生成的全息图以照明试样。
38、根据本发明的方法的一种优选的变体的特征在于，驱控布置在居间像平面或另外的居间像平面中的空间光调制器用以执行tirf显微术或hilo显微术或sim显微术。针对tirf显微术或hilo显微术，可以在使用上述类型的tirf反射镜和/或tirf滑块的情况下将照明光的光点恰当地定位在显微镜物镜的后焦平面中，使得实现了照明光到试样中的期望的入射角度。
39、在根据本发明的方法的另一种优选的变体中，相干的平顶区域被成像到试样中并且然后用宽场显微术方法、例如smlm方法检查试样。