单波长实现多光子脉冲sted-spim显微系统的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明是关于一种单波长实现多光子脉冲STED-SP頂显微系统，属于生物分子影像学技术领域。
【背景技术】
[0002]多光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和多光子激发技术的一项新技术。多光子激发的基本原理:在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，这两个光子的能量可以加起来，使得荧光分子的电子跃迀至激发态，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相当的。多光子显微镜具有很多优点:I)对样品的光漂白区域小;2)光毒性小;3)穿透力强，多光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍;4)成像亮度和信噪比高。因此，多光子显微镜比单光子显微镜更适合长时间观察和研究活体细胞及组织，更适合对厚的生物样品进行深层次的研究，但是其分辨率和视场有待提尚。
[0003]SPIM(选择性平面照射显微镜，Selective Plane Illuminat1n Microscopy)以其低成本、样本无需切片、光损伤小、快速扫描成像等特点，现已广泛应用到发育生物学研究和观察细胞的三维结构中。SPIM与其他成像方式相比(传统荧光成像、共聚焦成像等)，SP頂是利用z轴宽场激发方式，CCD和/或CMOS进行信号采集，从而实现更大图像成像的一种宽视场显微技术，该显微镜的工作原理是基于“有选择性的平面成像”技术，激光经过激发物镜在照射物平面内形成一个yz平面的类似椭圆状激发光斑，利用CCD对椭圆状光斑内信号进行收集，从而获得更大范围内的成像，利用TAG对激发光斑在z轴上进行扫描，即可获得更大视场成像，同时辅助检流计对X轴进行扫描，获得三维图像。但是更长的椭圆状激发光斑虽然可以成像的视场更大，但是y轴上更粗，分辨率更差，在SP頂中，视场大小和分辨率是一种竞争关系，互相矛盾。现有的SPM技术在YZ平面上的光斑宽度较大，极大地影响了 YZ的分辨率，传统的解决方法是使用NA(数值孔径)更大的物镜或使用更短的激发波长来缩短光斑宽度，但是同时又造成了 YZ平面上光斑长度变短，这意味着成像视场更小。
[0004]STED(受激福射损耗显微镜，Stimulated Emiss1n Deplet1n Microscopy)利用荧光分子的能级结构和受激辐射选择性消耗PSF(点扩展函数)边沿区域的激发态荧光分子从而压缩PSF尺度，理论上分辨率随着STED光强的增大可以无限提高，首次真正实现了突破衍射极限的远场光学显微镜。调节激光与STED光三维空间重合，其中STED通过相位板和四分之一波片调节为面包圈状光斑，利用荧光分子的能级结构和受激辐射选择性消耗PSF边沿区域的激发态荧光分子从而压缩PSF尺度，最终荧光信号通过两二向色镜到达APD(雪崩光电二极管)，理论上分辨率随着STED光强的增大可以无限提高，然而STED通常是点扫描，因此其成像速度较慢，视场较小，并且STED需要两个激光器进行激发和淬灭，成本较高。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明的目的是提供一种高时空分辨率的单波长实现STED-SPM显微系统。
[0006]为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:一种单波长实现多光子脉冲STED-SP頂显微系统，其特征在于，包括一飞秒单波长激光器、两分光器件、一 STED光淬灭系统、三偏振态调节器件、一四分之一波片、一扫描器件、一激发物镜、一成像物镜、一感光元件或一分析元件，所述激发物镜的三维方向定义为X、Y和Z轴;所述飞秒单波长激光器发出的飞秒脉冲激光经第一偏振态调节器件发送到第一分光器件分成两束光，第一束光沿Y轴方向依次发射到第二偏振态调节器件、第二分光器件、第三偏振态调节器件和所述四分之一波片成为激发光束;第二束光发送到所述STED光淬灭系统，经所述STED光淬灭系统出射的光依次入射到所述第二分光器件、第三偏振态调节器和所述四分之一波片调制为面包圈状光焦斑成为淬灭光束;所述扫描器件用于对激发光束和淬灭光束进行扫描产生激发片光源和STED淬灭片光源，所述激发片光源和STED淬灭片光源经所述激发物镜照射待成像物体使待成像物体的荧光染料激发荧光，激发的荧光经所述成像物镜成像并依次经一滤光片和一会聚透镜发射到所述感光元件完成荧光染料三维成像或发射到所述分析元件完成荧光染料分析。
[0007 ] 优选地，所述STED光淬灭系统包括一玻璃棒、一延时器件、一二分之一波片、一偏振片、一保偏光纤和一相位调制单元，所述第二束光经所述玻璃棒延迟为皮秒光束后，再经所述延时器件延时后依次经所述偏振片和二分之一波片耦合进入所述保偏光纤，经所述保偏光纤出射的光经所述相位调制单元依次入射到所述第二分光器件和第二偏振态调节器。
[0008]优选地，该显微系统还包括一扫描透镜，所述扫描透镜设置在所述扫描器件与所述激发物镜之间。
[0009]优选地，所述分析元件包括一 APD、一 TCSPC元件和一计算机，所述APD用于接收经所述会聚透镜会聚后的荧光并将其通过所述TCSPC元件发送到所述计算机。
[0010]优选地，所述扫描器件包括一位于Z轴的TAG透镜和一位于X轴的检流计，所述TAG透镜同时扫描激发光束和STED淬灭光束产生连续激发光线光源和STED淬灭线光源，所述检流计用于在X轴上同时扫描激发光线光源和STED淬灭线光源产生连续激发光片光源和STED淬灭片光源。
[0011]优选地，所述相位调制单元采用相位板或s波片。
[0012]优选地，两个所述分光元件均米用偏振分光棱镜或分光片。
[0013]本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点:1、本发明由于结合多光子成像深度、SP頂高时间分辨率及STED高空间分辨率实现高时空分辨率成像，既能够解决多光子、SP頂分辨率低、STED成像速度慢的不足增强成像能力，又仅仅需要一台飞秒激光器，降低了系统的复杂性和经济成本，增加市场竞争力。2、本发明由于通过设置分光器件将同一台飞秒激光器的光束分为两束光，第一束光作为激发光进行激发荧光，第二束光作为STED光进行淬灭，通过控制分光器件的分光比进而可以实现单波长下同时实现多光子脉冲STED-SPIM成像，还可以单独实现多光子SPIM成像，另外，两束光为同一波长，因而可以免去采用光声调制元件产生的色散效应的影响，同时也简化了光学装置，减少了特定波长的滤波片等成本。3、本发明基于荧光染料的多光子吸收性质，利用第一束光进行染料的多光子激发，其激发光斑区域为YZ平面，S卩SP頂激光模式，同时在XZ平面上进行STED第二束光的重合，重合方式为第二束光的强度最大值中心的零点位于第一束光中心处，因为实现淬灭效果，利用受激辐射原理进一步缩小XZ激发荧光区域，从而实现超分辨SP頂成像。4、本发明通过Z轴扫描器件在Z轴方面同时扫描第一束光和第二束光实现增大YZ成像平面的效果，同时配合检流计实现X轴扫描，最终达到三维成像效果。5、本发明在保持SPM技术在Z轴方向上检测到的二维宽视场基础上，通过第二束光受激辐射损耗的作用，增强了 Z轴分辨率，同时也提高XY轴分辨率，在成像方面采用CCD或SCMOS成像，在保证宽视场的基础上利用Z轴扫描器件的快速扫描，增强了成像速度。6、本发明可以根据不同荧光染料的吸收和荧光光谱特性，选择不同的单波长实现单波长下两种模式的成像，增强了系统普遍适用性。7、本发明可以采用Aro和TCSPC元件实现单波长多光子脉冲STED-SP頂-FCS分析与单波长多光子SP頂-FCS分析。
【附图说明】
[0014]图1是现有技术中STED的原理示意图，其中，(a)为STED的光路结构示意图，(b)为STED的原理图；
[0015]图2是本发明的单波长实现多光子脉冲STED-SP頂显微系统结构示意图；
[0016]图3是本发明同时实现多光子脉冲的荧光吸收、淬灭和发射的原理示意图，其中，(a)为ATT0647荧光染料的吸收谱和发射谱，其中760nm波长既是ATTO 647的双光子激发波长，也是ATTO 647作为STED染料的淬灭波长，(b)为双光子STED能级原理图，通过760nm飞秒光实现双光子激发，同时通过760nm皮秒光实现STED淬灭；