专利名称：磁性分离柱及其在生物样品分离中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物分离装置领域，更具体地，是涉及利用磁性进行生物样品分离的装置。
背景技术：
随着现代生物技术的飞速发展，磁性分离技术在生物样品的分离中得到了广泛的应用，其原理为在磁珠(粒径＜5μm)的表面修饰上能识别、结合细胞、亚细胞物质、细菌、病毒、核酸或蛋白等生物样品的生物分子，构成磁珠-生物分子复合物。用该复合物去捕获目的生物样品，再在外磁场作用下进行阻留从而实现分离。由于普通的永磁体磁场所产生的磁感应强度偏低，很难实现对目标分离物进行快速、高效的分选。目前尚无利用生物样品中的内磁场增强分离效果提高分离效率的装置。
发明内容
所要解决的技术问题本发明需要解决的技术问题是提供一种磁性分离柱及其在生物样品分离中的应用，以克服现有技术中仅以普通的永磁体进行磁性分选，其磁场所产生的磁感应强度偏低，很难实现对目标分离物进行快速、高效的分选的不足。
技术方案本发明的构思是选择高磁导率、低矫顽力、低剩磁的材料作为磁分选柱的填料，并通过一定的工艺将填料制备成形状规则、尺寸统一的小球，分离柱的柱体就是由这些小球紧密堆积而成。将柱体置于外磁场中，在小球表面的周围便会产生高度不均匀的磁场，即高梯度磁场。因此当标记有超顺磁性、铁磁性或亚铁磁性颗粒的生物样品通过柱体时，便会被高效地阻留。将填料制备成球型并紧密堆积，一方面可以保证填料结构的稳定性，另一方面也可以有效地保护分离的样品不被破坏。
根据这种发明构思，本发明提供一种磁性分离柱，其结构由盛料段(1)、填料柱(2)、出料口(3)和推塞(4)组成，其中填料柱(2)中装填有粒径为0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm的磁性小球，在分选过程中，样品从上端流进口(5)加入并在推塞(4)压力作用下流经填料柱(2)和出料口(3)；其中，磁性小球的矫顽力Hc＝30～150A/m，最大磁导率μmax＝4000～9000。
上述的磁性分离柱的优选方案之一为，所说的磁性小球的结构为(1)由磁性软铁材料组成的球体，直径为0.01～1mm；(2)生物惰性高分子材料构成的球体表面涂敷层，厚度为0.001～500μm。
上述的磁性分离柱的进一步优选方案为，所说的磁性软铁材料的组分和重量百分比含量为铁99.0-99.8％，碳0-0.04％，余量为杂质。优选的组分和重量百分比含量为铁99.8％、碳0.01％，其余0.01％为杂质。
上述的磁性分离柱的优选方案之二为，所说的生物惰性高分子材料选自聚氯化对二甲苯、聚二氯对二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡胶之中的一种或一种以上。
本发明进一步提供上述的磁性分离柱的优选方案为，所说的磁性小球的的制备方法包括如下步骤(1)提供的熔化状态的权利要求1所说的磁性分选材料；(2)以喷溅、离心或高空跌落的方法处理上述熔化材料；(3)利用液相的表面张力凝固成球状微粒；(4)利用生物惰性高分子材料对小球进行表面涂敷，使其具有生物相容性。
上述的磁性分离柱的另一种优选方案为，所说的磁性小球的的制备方法还包括如下步骤(1)对凝固成形的小球进行粒径筛选、密度筛选和圆度筛选；(2)利用退火反应消除小球的应力以提高磁导率后，再进行表面涂覆；其中，所说的粒径筛选的目标微粒直径为0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm；其中，所说的退火反应步骤为随炉升温400-900℃、控速升温700-1000℃、保温1-5小时、控速降温400-900℃。
本发明的技术方案之二是提供上述的磁性分离柱的应用方法，即将磁性标记的生物样品在重力作用下流经外加磁场的磁性分离柱并被阻留，撤去外磁场后加压洗脱生物样品。
上述的磁性分离柱的应用的优选方案为，所说的生物样品为来自于动物、植物或微生物的组织、细胞、核酸、蛋白质或多糖。所说的磁性标记的生物样品优选为磁性纳米粒子-抗体复合物或者磁性纳米粒子-核酸探针，分别进行细胞或者核酸的特异性分离。
有益效果(1)本发明的磁分选柱制作简单、易于大规模生产、操作简便快捷、除普通外磁场外无需其他任何外部设备，利用分选柱内产生的高强度、高梯度的磁场，很好地满足了磁性分离的需要，而且分选柱体积小，重量轻，便于运输携带，可灵活地在各种适合的场合使用。
(2)本发明的磁分离柱的关键是其中的填料小球，是以高磁导率、低矫顽力、低剩磁的新型的磁性材料作为主要成分，小球表面涂敷了一层生物惰性材料，是一种新材料的新应用。
(3)本发明的填料小球形状规则、尺寸统一，一方面可以保证填料结构的稳定性，另一方面也可以有效地保护分离的样品不被破坏。
(4)以粒径较小0.01～0.1mm或0.1～0.2mm的铁球作为填料，可以产生梯度较大的磁场，适应于分离磁响应较弱的被磁性标记的生物样品。
(5)本发明的填料小球经过粒径筛选、密度筛选、圆度筛选和表面涂覆，采用了特别设计的工艺过程，对小球最后的分离性质起到了决定性的作用。
(6)经过退火处理的小球，其晶粒细化，组织均匀、硬度低，具有低矫顽力(Hc＝30～150A/m)和较高的最大磁导率(μmax＝4000～9000)，符合分离的要求。
(7)置于外磁场中，在小球表面的周围便会产生高度不均匀的磁场，即高梯度磁场。利用该高梯度磁场可以对标记有超顺磁性、铁磁性或亚铁磁性颗粒的生物样品进行高效地阻留，其余杂质可简单地被洗涤冲去，实现了特异的高效分离。
(8)分离柱的推塞在加压时可以使用人工手动，也可以与机械装置配合采用自动流量控制，无需另外设计分离柱。
如本文所用，术语“磁导率”指表征磁介质磁化能的物理量，当一个线圈中通过一定的电流时，由于磁介质的存在而发生变化，各处磁感应强度都将较磁介质不存在时的磁场强度增强几倍或减弱到几分之一(假定磁介质是均匀的，而且充满磁场所占的整个空间)。各种材料对磁场磁感应强度的影响即是用磁导率来量度物质中某点的磁感应强度B与该点磁场强度之比(MKS单位制)为该物质此时的磁导率μ。铁磁质磁导率很大，且随外磁场强度变化。顺磁质和抗磁质磁导率都很小，且不随着外磁场变化。
如本文所用，术语“矫顽力”指铁磁材料在反复磁化过程中，磁通密度B的变化始终落后于磁场强度H的变化，对应于外磁场增大与减小时相同的H值，会有不同的B值，这种不可逆现象称为磁滞现象。当外加磁场强度H下降至零时，B值并不回到零而为称为剩余磁感应强度，简称剩磁。为使B值回到零，必须加一个反向磁场强度Hc，Hc称为矫顽磁场强度，俗称矫顽力。矫顽力不仅与铁磁质的性质有关，还依赖于铁磁质原先的磁化强度。矫顽力高低不同是软磁材料和硬磁材料的重要区别之一，在制造变压器铁芯或电磁铁时，需要选择矫顽力较小的材料(如软铁，硅钢)，制造永磁体时，需要选择矫顽力大的材料(如铝镍钴等)，以求尽可能保存磁性。
图1磁性分选柱示意图。由盛料段(1)、填料柱(2)、出料口(3)和推塞(4)组成，其中填料柱(2)中装填有小球，样品从上端流进口(5)加入。
图2磁性分选过程示意图。从人脐带血样品中分离纯化出CD34+细胞(即造血干细胞)(1)磁性纳米粒子直接与CD34单克隆抗体连接；(2)连接抗体的磁性纳米粒子加入单个核细胞体系中，与CD34+细胞进行特异性结合，完成磁标记；(3)经过磁性标记的待分离体系注入到分选柱盛料段内，在自身重力的作用下流经填料柱；(4)填料柱在外磁场下产生高强、高梯度磁场，对被磁标记的CD34+细胞高效阻留，其余细胞和杂质被洗涤冲去。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如化工产品手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂或者试剂购自上海化学试剂厂。Oligo-dT购自Promega公司。其他K562白血病细胞(上海细胞库)、单克隆抗体(美国CALTAG公司)和磁性纳米粒子(自制)来源为上海师范大学沈鹤柏，文献沈鹤柏，汪友宝，杨海峰，等。DNA在磁性纳米粒子表面的键合及表面增强拉曼光谱研究。科学通报，2003，48(21)，2252～2256。
实施例1填料小球的制备采用飞溅骤冷法制备。
取软铁材料三份，其组分和重量百分比含量分别为铁99.0％+碳0.04％，铁99.5％+碳0.001％，以及铁99.8％+碳0.01％，余量均含极少量铝、钠、锌、铬、镍、铜、锰等元素。使该三种材料在1500℃-1800℃高温下熔化，熔化的软铁经过3-50米/秒的速度喷溅、高空跌落或离心摔出法，利用液相的表面张力自动收缩成球状，跌落水中，骤冷凝固成小铁球。
实施例2粒度筛选实施例1所制备的三种材料的小球的粒径大部分为0.2～1mm，铁球粒径不同，其磁学性质也不同。本发明采用分样筛进行粒度筛选挑选合适目数的分样筛筛选目标粒度分别为0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm的小球。粒径较大的铁球0.2～1mm可用于处理大量样品，适合于分离磁响应较强的被磁性标记的生物样品。粒径较小0.01～0.1mm或0.1～0.2mm的铁球可以产生梯度较大的磁场，适应于分离磁响应较弱的被磁性标记的生物样品。
密度筛选填料小球的主要成分是铁。在小球制备的过程中会出现氧化物含量较多或含有其它杂质的小球，需要通过密度筛选来选择质量合格的小球。采用密度筛选器进行密度筛选，原理为利用小球在低阻力直线运动时所受一个持续恒定的与运动方向垂直的力，因密度有所差别，不同小球运动轨迹不同，通过针对一定运动轨迹的小球进行剔除，从而实现密度筛选。
圆度筛选小球应为形状规则的球型，若形状不规则，会破坏被分离的生物样品，因此还需对小球进行圆度筛选，剔除形状不规则的铁球。采用圆度筛选器进行圆度筛选，原理为利用小球外形规整度与摩擦力之间的关系来筛选，球形规整度越高，小球与接触面综合摩擦力越低，待筛选的小球通过含一定高低落差的圆弧形轨道，圆度不规则的小球摩擦力大，能提供足够向心力保证其始终在轨道内运动，圆度规则的小球不能提供足够向心力，被甩出轨道，由此筛选出圆度规则的小球。
实施例3提高磁导率由骤冷产生的应力，使小球的磁学性质不能满足分选用料的要求。需要通过合适的退火工序，来消除应力，从而提高小铁球的磁导率，降低其矫顽力。随炉升温至400-900℃、控制升温至700-1000℃、保温1-5小时，控速降温至400-900℃，优选随炉升温至800℃、控制升温至900℃、保温4小时，控速降温至500℃。为了避免小球的氧化，小球的退火，在真空炉或氢气氛围中进行。经过退火处理的小球，其晶粒细化，组织均匀、硬度低，具有低矫顽力(Hc＝30～150A/m)和较高的最大磁导率(μmax＝4000～9000)，符合分离用料的基本要求。其中，铁99.8％+碳0.01％，余量为杂质的材料性能最适合于磁性分离应用。
实施例4表面涂敷小球在潮湿空气中容易氧化，并且易被腐蚀。因此不宜直接应用于生物样品的分离，需要对其表面进行生物相容性的改性处理。本发明采用的办法是在其表面均匀涂敷一层生物相容性的材料。选用的材料为聚氯化对二甲苯或聚二氯对二甲苯等高分子或天然高分子。
制备二甲苯聚合物的反应可分成两步即二聚体热解成活性中间体对二亚甲基苯(p-xylylene)和活性中间体的气相沉积聚合。
1、工业上二甲苯聚合物的单体是对二亚甲基苯的环状二聚体或其取代衍生物。二聚体最直接的合成方法是用二甲苯作原料，使其与水蒸气于常压下热解(950℃)然后把热解气体骤冷到二甲苯溶剂中，即得到二聚体；在对二亚甲基苯二聚体苯环上的氢经氯取代即可得氯代对二亚甲基苯二聚体。
2、二甲苯聚合物的制备包含两个过程，即二聚体的热解(680℃)和热解中间体的气相沉积聚合(常温)。二聚体气化后进入热解区，其亚甲基-亚甲基键受热断裂形成二分子活性中间体(对二亚甲基苯)。该活性中间体在气相时稳定，但一旦在沉积室凝结就迅速聚合成高分子量固态膜。
以氯代二甲基苯聚合物涂覆物件时，被涂物件置于沉积室，并不断旋转以使聚合物膜在物件表面均匀分布。物件涂覆过程类似于金属蒸镀，担不同的是金属蒸镀只能是视线式，而二甲苯聚合物则是弥散式，各个方位共性涂覆，这样就使得任何复杂表面都可以均匀的涂覆上聚合物膜。聚合物膜厚度可以通过调节二聚体蒸发量来控制。此外，因沉积室温度是常温，从而可以使被涂覆物件免受热破坏危险。沉积室尺寸可根据被涂物件大小而改变。
该涂覆层完全无针孔，涂层超薄，厚度为0.001～500μm，厚度均一。涂敷层具有极低的水汽透过率(对于去离子水的溶胀为零)和耐溶剂性，可抵抗强酸、强碱及各种溶剂侵蚀，对氧气、氯气、氮气和二氧化碳等也具有较好的阻隔性，可有效抑制霉菌、细菌在表面繁殖生长。
实施例6从人脐带血样品中分离纯化出CD34+细胞(即造血干细胞)本发明采用磁性纳米粒子直接与CD34单克隆抗体连接，构成磁性纳米粒子-抗体复合物，将该复合物加入到需要分离的样品中，由于CD34+细胞表面表达CD34抗原，抗原抗体之间有特异性反应，磁性纳米粒子复合物便可以与目的细胞进行特异性结合，再将待分离样品注入到分选柱盛料段内，并以常规方法外加一磁场。由于分离柱能够产生高强度、高梯度的柱内磁场，可以高效地将被标记的CD34+细胞阻留住。由样品自身重力使其通过填料柱经出料口流出、弃去。将PBS缓冲液(磷酸缓冲液)多次洗涤填料柱，未经磁标记的其他物质被洗涤冲去，(见图2)然后撤去外磁场，柱内磁场亦随即消失，再用PBS缓冲液在推塞提供的压力下将磁性纳米粒子-抗体-CD34+细胞复合物洗脱出来，免疫分析和显微镜检测结果显示分离效果良好，从而实现了CD34+细胞的分离、纯化。
实施例7从K562白血病细胞中提取mRNA(信使RNA)取k562并加入细胞裂解液将其裂解，然后采用磁性纳米粒子与Oligo-dT(连续T碱基的寡聚核苷酸)相连接，构成磁性纳米粒子-Oligo-dT复合物，将该复合物加入已裂解的k562细胞液中，利用Oligo-dT和mRNA之间的碱基互补原则将mRNA磁性标记，标记完毕后细胞液按照实施例6同样的方法加压通过分选柱，被标记的mRNA被柱内磁场高效阻留，其余物质冲洗流出，再将阻留物清洗后撤去外磁场，柱内磁场随即瞬时消失，然后用双蒸水将纳米粒子-mRNA洗脱出来。RT-PCR检测mRNA分离效果良好，从而实现了mRNA的一步法提取、分离和纯化。
权利要求
1.一种磁性分离柱，其结构由盛料段(1)、填料柱(2)、出料口(3)和推塞(4)组成，其中填料柱(2)中装填有粒径为0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm的磁性小球，在分选过程中，样品从上端流进口(5)加入并在重力作用下流经填料柱(2)和出料口(3)，推塞(4)则用于施加压力洗脱出被阻留的样品；其中，磁性小球的矫顽力Hc＝30～150A/m，最大磁导率μmax＝4000～9000。
2.根据权利要求1所述的磁性分离柱，其特征在于，所说的磁性小球的结构为(1)由磁性软铁材料组成的球体，直径为0.01～1mm；(2)生物惰性高分子材料构成的球体表面涂敷层，厚度为0.001～500μm。
3.根据权利要求2所述的磁性分离柱，其特征在于，所说的磁性软铁材料的组分和重量百分比含量为铁99.0-99.8％，碳0-0.04％，余量为杂质。
4.根据权利要求3所述的磁性分离柱，其特征在于，所说的磁性软铁材料的组分和重量百分比含量为铁99.8％、碳0.01％，其余0.01％为杂质。
5.根据权利要求2所述的磁性分离柱，其特征在于，所说的生物惰性高分子材料选自聚氯化对二甲苯、聚二氯对二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡胶之中的一种或一种以上。
6.根据权利要求1所述的磁性分离柱，其特征在于，所说的磁性小球的的制备方法包括如下步骤(1)提供的熔化状态的权利要求1所说的磁性分选材料；(2)以喷溅、离心或高空跌落的方法处理上述熔化材料；(3)利用液相的表面张力凝固成球状微粒；(4)利用生物惰性高分子材料对小球进行表面涂敷，使其具有生物相容性。
7.根据权利要求1所述的磁性分离柱，其特征在于，所说的磁性小球的的制备方法还包括如下步骤(1)对凝固成形的小球进行粒径筛选、密度筛选和圆度筛选；(2)利用退火反应消除小球的应力以提高磁导率后，再进行表面涂覆；其中，所说的粒径筛选的目标微粒直径为0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm；其中，所说的退火反应步骤为随炉升温400-900℃、控速升温700-1000℃、保温1-5小时、控速降温400-900℃。
8.权利要求1所说的磁性分离柱的应用，将磁性标记的生物样品在重力作用下流经外加磁场的磁性分离柱并被阻留，撤去外磁场后洗脱生物样品。
9.根据权利要求8所述的磁性分离柱的应用，其特征在于，所说的生物样品为来自于动物、植物或微生物的组织、细胞、核酸、蛋白质或多糖。
10.根据权利要求9所述的磁性分离柱的应用，其特征在于，所说的磁性标记的生物样品为磁性纳米粒子-抗体复合物或者磁性纳米粒子-核酸探针，分别进行细胞或者核酸的特异性分离。
全文摘要
本发明涉及一种磁性分离柱及其在生物样品分离中的应用，其结构由盛料段(1)、填料柱(2)、出料口(3)和推塞(4)组成，其中填料柱(2)中装填有粒径为0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm的磁性软铁小球，在分选过程中，样品从上端流进口(5)加入在重力作用下流经填料柱(2)和出料口(3)，推塞(4)则用于施加压力洗脱出被阻留的样品。本发明的磁分离柱在外磁场作用下可以产生高梯度磁场，从而可以简单、有效、方便、快捷地分离各种细胞、亚细胞物质、细菌、病毒、核酸或蛋白质等生物样品。
文档编号B22F9/06GK1899698SQ20061002844
公开日2007年1月24日 申请日期2006年6月30日 优先权日2006年6月30日
发明者沈鹤柏, 周海清, 兰天, 张诗渊 申请人:上海师范大学