专利名称：人工酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶的合成，且特别地涉及包括有机聚合物和具有生物催化功能性 (functionality)的活性部位的人工酶的合成。
背景技术：
本发明涉及在2008年2月观日递交的美国临时申请61/032118，在此通过引用并 入。
酶是由已折叠成特定的形状的多肽的一条或多条链组成的大的构象复杂的结构， 其结果是生物化学催化剂。为了营养、结构和其他目的，生命系统需要使用宽范围的小到 中等尺寸分子，并且较小分子通常仅可作为必须被分解的较大分子的聚合形式获得。为了 产生存活的能量，多糖、大蛋白质和长链脂肪酸是碳、其他必需元素和还原电势最普遍的来 源。因此，最重要的酶的种类之一是实施分解代谢功能的酶，即，将较大分子分解成较小单 元。催化这些大分子分解的分解代谢酶大部分是水解酶，因为它们促进水分子在天然聚合 物的一个或多个单体之间的插入。图1显示通过溶菌酶的羧基功能解聚肽聚糖的机理。参 见 D. J. Vocadlo 等人，Nature 412,835 (2001)。
迄今在精确地模拟生物过程的人工系统的开发中的许多限制之一是实施与天然 发生的酶相似功能的模拟酶的开发。特定的需求是被称作糖苷水解酶的水解酶的子集 (subset)的模拟(mimetization)，糖苷水解酶是催化多糖或基于糖的单体长链的分解的 酶。大部分的这些酶在活性部位或“催化裂口(catalytic cleft) ”实施至少一些它们的 催化活性，即，结合、解聚和释放。后一个术语是由于活性部位形成的构象而使用的，如通过 X-射线晶体学、核磁共振(NMR)和高速计算机模型所预测的。简单来说，活性部位表现为适 当地描述为延伸的沟(trough)、嘴或开口袋的形状的一些变型。在一些酶中，活性部位完全 是封闭的，即，活性部位是隧道或凹陷的形状。在大部分情况下，包含活性部位的区域形成 至少半封闭的体积，在该体积中，多糖底物可按顺序(i)暂时地结合；(ii)变为暴露于催 化氨基酸残基和主链结构，且然后(iii)作为催化产物离开。在任何情况下，催化部位或催 化裂口确定在构象上特定的和在化学上独特的结构，在糖苷水解酶的情况下，这样的结构 非常适合多糖的分解。图2A和图2B显示示例性的活性部位。图2A显示己糖激酶的空间 填充模型[Heriot-WattUniversity，Scotland]。图2B显示在羧肽酶A的活性部位中的关 键残基和金属离子辅因子(有颜色的)[Dept. of Chemistry, Washington University]。
除活性部位之外，酶的剩余部分通常由多个结构亚基组成，结构亚基通常是多个 在结构上折叠的线性多肽链。在大部分情况下，蛋白质复合物的这个“非-催化”部分占 复合物总质量、氨基酸残基数和所占体积的90%以上。乍看，这个非-催化部分描述非常 大比例的专职于与其生物学功能(例如多糖的水解)不直接相关的职责的蛋白质。根据 本领域技术人员熟悉的生物化学理论，酶的绝大部分用作结构支架或支持物，目的是指导 较小的关键催化部分成为可承担催化的三维(3D)构象，或更直白地说，酶的绝大部分用 来将酶的催化部分折叠成活性部位。参见，例如H. S. Taylor, Proc. R. Soc. (London)A108,105(1928)；以及 Warshel 和 Levitt. Τ. Mol. Biol. 103. 227 (1976)。这个在相对的残基定型 (commitment)中的著名的不均衡并不意味着减少酶的非-催化部分在通过示例性的功能 支持催化中的作用，例如缓冲底物-引起的形状改变的影响；促进支持催化的构象改变；以 及作用稳定反应物和产物之间的过渡状态的基于氧化和/或还原的机理的电子源/电子槽 (sink)ο
这个上述的结构定型不均衡也意味着，活性部位可能仅由酶的5%组成。例如，即 使在尺寸为1000个氨基酸残基范围内的纤维素酶中，催化可能发生在由仅约50个氨基酸 界定的体积中。从3D模拟和其他研究得出结论即使是大的多糖如纤维素水解成较小的多 糖或单糖可发生在界定纤维素酶(例如内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶、或葡糖苷酶) 的活性部位的狭窄的空间中，纤维素酶具有用作催化剂-促进剂的两位数字数量的氨基 酸-主要在过渡状态的稳定和水解中-或在这样的活性的直接支持中，例如，结合、定向、电 子源或电子槽、缓冲氧化还原电势、摩擦学支持(即，溶剂化的促进)和产物的释放。图3Α 显示来自海洋红嗜热盐菌(Miodothermusmarinus)的纤维素酶12A的拓扑表示，用黄色显 7^/ ^ [Centre forExtremophile Research, University of Bath，UK]。
3B 千会11 酶6B (红色)、纤维素酶6A-天然的(蓝色)和纤维素酶6A葡萄糖/纤维四糖复合物(黄 色)的活性-中心环的立体-表示。参见G. J. Davies等人，Biochem. T. 348, 201 (2000)。
合成“塑料酶”(plastic enzyme)或“合成的酶/人工促酶(synzyme) ”的现有技 术包括分子印记技术，以及那些包括催化活性蛋白质(整体或部分)与用作结构支架的聚 合物的整合的技术-通常称为聚合物支持的酶或基质固定的酶。
分子印记技术是用于制备能够以高亲和力和高选择性识别和结合期望的底物或 模板的聚合物材料的技术。分子印记聚合物(MIP)已用于许多应用中，包括色谱法和固相 提取中的固定相、传感器中的识别元件和化学反应的催化剂。在分子印记技术中，模板分子 被用来在聚合物上形成三维(3D)构象。印记使用单体，单体的位置由其与模板的相互作 用来确定，随后单体被聚合，从而大致保留模板和那些已引入到聚合物中的关键官能团之 间的空间关系。为了维持模板分子的记忆效应，MIP通常是高度交联和刚性的。因此，MIP 可重新结合模板分子或可模拟以与构象-诱导模板或构象上相似的靶分子相似的催化方 式作用的催化剂的活性部位。这个策略的原理是Fisher在1890年代假定的“锁和钥匙” 模型，其中，钥匙是模板，锁是催化部位，而聚合物被用来模拟与钥匙接触的锁的部分。参 见 E.Fischer，Ber. Dtsch. Chem. Ges. 23，799 (1890)。在本领域广泛已知的，MIP 的缺点是 以下三个方面(1)依赖于聚合物来模拟催化部位；( 所述聚合物在维持被假定的生物催 化构象(以及，通过推断，以有效地从底物转变为产物的方式维持至少最初底物、过渡状态 和产物分子所需的构象的柔性)中的限制；以及(3)整合到聚合物中以充分地模拟实施实 际的靶分子结合、过渡状态的稳定、和产物的释放的生物催化氨基酸残基的功能性的缺少。 图4显示丙烯酸-糖聚合物的分子印记的实例。参见Y. Kanekiyo等人，Chem. Commun.， 2698(2002)。
关于酶的构象如何促进催化的更多现代理论包括=Koshland假定的诱导契合模 型。参见 D. E. Koshland, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 44，98 (1958)。这个模型说明，基于 蛋白质的聚合物中的构象变化至少对于识别/结合、过渡状态的稳定和产物的释放是必要 的。诱导契合模型推断，基于锁和钥匙的催化聚合物如MIP由于其缺少采取构象状态的正确范围的柔性而具有内在的缺点。此模型也暗示，可模拟这些构象状态的聚合物将作为具 有催化能力的系统与生物酶更近似，这些构象状态包括催化氧化/催化还原的促进和缓 冲、过渡状态的稳定、溶剂化和其他需要的“活性部位”功能性。
因此，仍需要一种改进的合成人工酶的方法，此人工酶精确地模拟天然发生的酶 的柔性构象和功能。特别地，这些方法将用化学功能性修饰人工聚合物，并将其折叠成所期 望的构象，结果是具有酶的生物催化活性的成形的聚合物。发明内容
本发明涉及一种人工酶，其包括被共聚合以产生具有生物催化功能性的活性部 位的塑料或其他有机分子。活性部位可包括上述塑料和其他聚合的有机分子、天然氨基 酸或人工氨基酸、具有亲核基团和/或亲电基团的分子、或促进通常与大部分氨基酸固有 的正交功能(orthogonal function)无关的独特的化学功能的分子。独特的化学功能可 包括酮-烯醇反应性、烯-二醇形成、Snl和Sn2置换、第尔斯-阿尔德反应、一般的易位 (general metathesis)、或复合有机金属功能(complex metallo-organic function)、硝 基醛醇(Henry反应)、诺文葛耳反应、Morita_Bay 1 is_Hi 1 Iman反应、Stegl ich重排、1，3偶 极环加成、Mrecker合成、烯丙基化、烷基化(alkylation)、卤化和氨基化。塑料可包括聚 脲、聚酰亚胺、聚氨酯、聚丙烯酸或聚乳酸。塑料可与一种或多种其他塑料、结合剂或交联剂 共聚合。所述人工酶可以是糖苷水解酶。
此方法能够合成精确地模拟天然地发生的酶的柔性构象和功能的人工酶。这些方 法可用来以化学功能性修饰人工聚合物，且将其折叠成所期望的构象，导致具有酶的生物 催化活性的定形的聚合物。这样的定形和功能化的聚合物也可具有生物酶不具有的功能 性，即，实施反-生物催化(trans-biotic catalysis)，且可在通常可中和生物酶的催化活 性的溶剂化、温度、压力、电磁辐射和存在抑制性辅因子的条件下，即，在反-生物条件下进 行这种催化。在促进和支持催化中的人工聚合物的本质提供了被支持和功能化的活性部位 上的优越的结构特性，导致更长的持续和更简单地可使用的催化系统，特别是用于工业过 程。
引入且形成说明书的部分的附图示例说明本发明，并结合说明书描述本发明。在 附图中，相同的元件由相同的数字指出。
图1显示通过溶菌酶的羧基功能解聚肽聚糖的机理。
图2A显示己糖激酶的空间填充模型。图2B显示在羧肽酶A的活性部位中的关键 残基和金属离子辅因子(带颜色的)。
图3A显示来自海洋红嗜热盐菌的纤维素酶12A的拓扑表示，用黄色显示底物。图 :3B显示纤维素酶6B (红色)、纤维素酶6A-天然的(蓝色)和纤维素酶6A葡萄糖/纤维四 糖复合物(黄色)的活性-中心环的立体-表示。
图4显示丙烯酸-糖聚合物的分子印记的实例。
图5显示具有支持与其他单体的催化、共聚合、折叠和修饰(decoration)的功能 性的聚丙烯酸的类型。
图6显示活性部位模拟物(mimetic)的示意图，其中人工聚合物(蓝色)支持催 化部位(绿色)，底物(黄色，具有红色和蓝色球)位于催化部位中。
图7显示对于多肽可得到的熵状态的折叠的隧道表示，其中，“N” =正确地折叠的 状态。
图8显示共聚合的流线模式(in-line mode)(左边)和修饰模式(decoration mode)(中间和右边)之间的差异的示意图。
图9显示“经典的”双-单体非均质共聚物的实例。
图10显示包括PEG化的亮氨酸的主链/流线共聚合的示例性的合成方法。
图11显示包括引起流线共聚合方案中折叠/方向变化的非天然氨基酸 (amine-acid)的示例性合成方法。
图12显示包括基于多肽的“构象体(conformamers)，，的示例性的合成方法，此构 象体可用作修饰共聚合方案中的支架，修饰共聚合方案可能用N’ -功能化单体，得到叔酰 胺。
图13显示包括基于塑料的“构象体”的示例性的合成方法，此构象体可用作修饰 共聚合方案中的支架，修饰共聚合方案可能用连接氨基酸等的功能化单体。
图14显示(顶部)包括基于塑料的支架的示例性的合成方法，此支架用于与单链 DNA发生非均质共聚合以得到预折叠的可寻址模板，(中间)模板化为通过DNA杂交接近的 试剂的可能反应类型，以及(底部)可周在聚合和/或正交功能化中的非天然氨基酸。
图15显示使用醛功能性来诱导主链折叠、交联、催化和用作其他单体的功能化点 的示例性的合成方法。
图16显示示例性的基于塑料的聚合物。
图17显示小的亚-分子折叠体(foldamer)的概念。
图18显示用有机金属功能化。
图19显示聚苯乙烯末端用马来酰亚胺功能化，用于结合包括巯基的基团，例如半 胱氨酸。
图20显示折叠成“裂口”构象且周胺基和羟基预功能化的示例性的亚-分子单元 [图来自二氧化硅(silica)的单体，Prof. Q. Yang, Acad. Sinica, PRC]。
图21显示折叠成裂口构象且用(从逆时针方向)胺、羧酸、醛、羟基、咪唑基和吡 啶基部分预功能化的示例性的亚-分子单元，每个功能化位于对于结构的每一个基于苯基 的单体来说独特的“地址”。此单元被锚定到固相，固相由在底部的厚的且成角度的线表示。 参见 G. C. Lloyd-Jones, Annu. Rep. ProR. Chem. 97 (2001)。
图22显示由被聚合成五个地址裂口的多个联苯基环单体组成的示例性的亚-分 子单元，每一个地址裂口具有正交的化学功能潜力。这个结构也是通过在底部显示的聚合 的和交联的基团锚定到固相的。
图23显示折叠成截短的环状构象的示例性的亚-分子单元，此构象具有在环的内 部上由十个(10)编号的、大的单球体或双球体部分表示的可功能化的“地址”。参见Kendig 的美国专利第6，716，370号。
图M显示交联成超-分子结构的五个( 亚-分子单元的示例性的俯视图，产生 裂口封闭尺寸从底部到顶部渐进地增加的催化裂口。每一个单元可如图21-23所描述的被正交功能化。
图25显示催化裂口几何学的示例性理想化产物的斜侧视图，由多个截短的成形 的环和内表面功能化的亚-分子单元组成，亚-分子单元已被交联成封闭尺寸从右到左渐 进地增加的超-分子结构。还显示在末端的圆形的环“锚定物(anchor) ”或种子形状(seed shape)，该末端被用作截短的环状单元迭代添加的聚合向导，以产生和保护产物的完整的 “裂口”构象。在上方显示用于尺寸对比的短的30个葡萄糖单体-长的纤维素分子。
本发明的最佳模式和工业应用
本发明涉及使用人工聚合物模拟酶活性部位，以及使用这些人工酶进行催化。进 一步，如本文所使用的，人工酶更通常地指的是用于最佳地为反应提供化学上特定的活性 原子的基于聚合物的支架，而不仅仅是模拟天然酶的那些。各种聚合物可用于此模拟，包 括聚酰亚胺、聚脲、聚氨酯、聚丙烯酸和聚乳酸，以及具有能够实现与下述物质整合的性质 和功能性的其他聚合物天然氨基酸和人工氨基酸、具有亲核基团和亲电基团(分别类似 于氨基酸的胺功能性和羧基功能性)的其他分子，以及形成通常与大部分氨基酸固有的正 交功能不相关的独特的化学能力的其他分子，即，胺、羧基、甲酰胺、羟基、巯基和饱和烃。这 些“反式-氨基酸”功能可实现酮-烯醇反应性、烯-二醇形成、基于卤化物的Snl和Sn2置 换、第尔斯-阿尔德反应、一般的易位反应、复合有机金属功能、金属螯合能力、Henry反应、 诺文葛耳反应、Morita-Bay 1 is_Hi 1 Iman反应、Stegl ich重排、1，3偶极环加成、Strecker合 成、烯丙基化、烷基化、卤化和氨基化，以及通过将不限于二十个天然地发生的氨基酸的基 团整合到主链聚合物提供的其他能力。图5显示具有支持与其他单体的催化、共聚合、折叠 和修饰的功能性的聚丙烯酸的类型[Univ. of Conc印cion，Chile]。
如本领域所已知的，大部分酶的活性部位是界定整个基于蛋白质的复合物的 亚-部分的结构性区域。通过能够降低活化能、稳定底物和产物之间的过渡状态、贡献化学 功能和稳定几何学的机理，活性部位促进起始材料转化为产物的速率的增加，即，催化。酶 的活性部位或催化部位包括以特定的3D构象排列的氨基酸残基的独特组装，特定的3D构 象对于识别和修饰靶分子或底物(或模拟底物的诱导物或抑制物)是高特异性的，所述识 别和修饰使用残基的正交功能、残基在3D空间的位置、界面溶剂化和活性部位的构象柔性 的总和，如由更大的基于蛋白质的酶复合物的支架所促进的。
改进的基于人工聚合物的天然酶将完成与天然酶相同的生物催化功能，以改善所 完成的生物催化功能和整个分子的结构的方式。关于活性部位本身的结构和/或功能的 改进，这可包括基于以下的优良的特征(i)基于过渡状态和离去基团的熵调节和焓调节 的催化速率的增加；(ii)完成特定的催化所需的氨基酸和其他正交功能性和残基的数量 的增加；(iii)基于包括不由天然地发生的氨基酸提供的化学功能性，可用化学物质(且因 此，可进行的可能的催化)的更宽的范围，(iv)可以被催化的底物的更广泛的范围；以及 (ν)对活性部位构象的增加的控制，且因此，对催化的连续步骤的增加的控制，通过用可包 括上述基于塑料的聚合物的人工聚合物整体或部分置换模拟酶的非-催化部分。图6显示 活性部位模拟物的示意图，其中人工聚合物(蓝色)支持催化部位(绿色)，底物(黄色， 具有红色和蓝色球)位于催化部位中。[Robinson Group,Organic Chemistry Institute, University of Zurich, CH]。
通常，这些化合物(本文称为“塑料”，以描述一组广义的有机聚合物，其单体具有能够通过缩合、自由基增长、脱水和其他方式聚合的功能性)可单独制备或可与一种或 多种其他单体/低聚物/聚合物、具有与其他化学物结合的能力的化学功能性、或交联剂 和溶剂以各种不同的形状和尺寸共聚合。塑料单体、结合剂等的更顺从和反复的聚合也 可导致可与一系列几何学结构一致的聚合产物，例如，树枝状高分子、被良好界定的球体、 分形-模式3D网(fractal-patterned 3D net)、嵌段或层状共聚物(其中，塑料根据设 计在从液体或胶体到固相的聚合过程中析出)阵列片层(arrayedsheets)和平行片层 (parallel sheets)、和螺旋。在受控制的条件下，且勤勉使用单体和其他初始材料，塑料聚 合物可具有紧密模拟天然酶活性部位的形状。
除了具有类似活性部位的构象之外，塑料还可将氨基酸直接聚合到其碳主链中， 或主链可被氨基酸以不显著地影响聚合物如所期望的折叠的能力的方式“修饰”。下面描述 用于构建基于塑料聚合物的活性部位模拟物的示例性的方法，活性部位模拟物采取粗略地 描述为裂口或沟的、与糖苷水解酶的催化区域相似的结构。
除了采取所期望的形状，和将氨基酸或其他活性单体或功能性包括到此系统中， 重要的是，所得的聚合物模拟活性部位的柔性。许多“形状记忆”聚合物基于塑料(例如，上 面所列出中的一种或其他)，塑料被设计成采取受限制的一组构象可能性，即，一系列构象， 且即使在经历使聚合物突破其设计的范围的构象之后仍维持该范围。这在活性部位的模拟 中是重要的，因为没有酶具有完全静态的催化中心，且所有的糖苷水解酶通过所表达的构 象柔性进行结合、粘附、改变周围的构象、裂解、稳定和释放比最初的糖链更小的糖链。模拟 的聚合物优选地像天然的活性部位一样折叠，具有与活性部位的相同的氨基酸(或具有实 施与那些残基相同或更好的化学功能的基团)，且也能够像活性部位一样弯曲和改变形状。 始终，模拟聚合物必须保持一定的受限制的一组构象，即，不会“太柔性”，使得不会有可能 解开和失去其形状记忆的风险。
如本领域的实践者现在所理解的，在将多肽转化为可用的酶，S卩，转化为具有催化 功能的蛋白质中的困难之一是在将已经按照原样合成的、或已完全变性的线性的、天然的 序列折叠为天然形式中的固有的不确定性。目前不存在用于将大于50个左右氨基酸长度 的线性肽可靠和可预测地折叠成有限组的形状的技术。这是为什么存在很少市售的、人工 合成的大于约五十(50)残基长度的肽的主要原因，这种肽具有任何复杂生物活性，即，是 “真正的酶”。根据能量形貌理论，酶的最终构象是渐进地降低的自由能状态的总和，自由能 状态是在基于能量的“折叠隧道”内的构象转变之后达到的，“折叠隧道”是在两年前假定 的。参见 Gulukota 和 Wolynes，Proc Natl Acad Sci USA. 91，9292 (1994)和 Leopold 等 人，Proc Natl AcadSci USA.巡，8721 (1992)。图7显示对于多肽可得到的熵状态的折叠 的隧道表示，其中，“N” =正确地折叠的状态[Dept. of Biochemistry, Univ. ofToronto, CAN]。虽然最终构象在这个方面，特别是考虑到最小的熵，是非常理想的，理论和实验二者 都表明，存在前体酶可采用的许多亚稳态，原因是(1)那些状态具有相对地低的(尽管不 是最小的)自由能水平；和(2)必须进行在前体酶被正确地再次折叠之前克服过渡能垒而 解折叠前体酶的正能量投入。简单来说，存在前体酶执拗于一种或多种那些不正确的状态 而保持在催化上无活性的高的可能性。在现有技术中，任何超过50-mer尺寸的多肽的折叠 需要万亿次计算的超级计算机来预测和提出50-+-mer(50-pluS-mer)可落入的许多可能 的亚稳“陷阱”。结果，不存在可靠地和正确地将分子充分折叠以挑战在基因工程微生物中产生酶的方法。
本发明通过使用塑料或其他适当的聚合物直接形成活性部位而完全避免了折叠 问题，其通过支架或其他支持物在构象的界定的几何学范围内促进特定的催化功能。天然 酶的折叠的构象仅用作将要通过基于塑料的聚合物和其他试剂模拟的活性部位的形状、化 学特征(即，基于氨基酸或其他单体残基的功能)和构象的可接受的范围的启发。可被构 建的示例性的结构包括模拟糖苷水解酶-与-多糖的识别、结合、过渡状态的稳定、解聚、缓 冲和释放部位的形状的沟和裂口。示例性的功能性包括在那些活性部位的氨基酸残基。构 象和其范围可通过超级计算机模型、NMR和X-射线晶体学设计入塑料聚合物主链中。
通常，聚合物可通过从分子外部加强蛋白质来支持已知的在催化上-活性的酶的 功能，且有时，可置换一个或多个氨基酸残基，以导致共-聚合的蛋白质-塑料模拟物。后 者的一个实例是使用聚乙二醇/聚氧化乙烯(PEG/PE0)嵌合系统，通过将一个或多个残基 PEG化至延伸的胶体而将酶蛋白质直接连接到固相，延伸的胶体本身可共价地键合到聚苯 乙烯(PS)或其他顺从的树脂的固体中心。在这个“球和棒”策略中，PEG分子形成延伸的支 持物，同时酶在末端被折叠成活性构象。另一个策略是在过程中将聚合物用作基质支持物， 其中，期望酶被保持在固相中，但不如上述的PEG实例中紧密与聚合物整合。用于基质支持 物的使酶功能化的通常的策略是一个或多个外周残基的正交修饰或功能化以随后被包括 到固相基质中，外周残基相对地远离结合部位或催化部位。这样的实例是生物素化以结合 在固相上的抗生蛋白链菌素、将赖氨酰或精氨酰残基结合到在基质上的N-羟基琥珀酰亚 胺、以及将自由的半胱氨酰残基结合到在固相上的马来酰亚胺残基。
示例实施方案和应用
可用来形成共聚合的人工酶的示例性的单体包括i)天然地发生的α -氨基酸； )人工α -氨基酸、β -氨基酸、Y -氨基酸或其他延伸的主链氨基酸；iii)各种主链长度 的N’ -功能化的氨基酸；iv)具有促进其包括到聚合物中的功能性的其他单体。这样的功 能性，如果是由氨基酸启发的，可包括有用地远离亲电基团(例如，羧酸和不饱和的碳，即， 烯烃和炔烃)的亲核基团(例如，伯胺或仲胺、羟基、巯基和磷酸基)，使得在单体上的正交 化学功能呈现在整个聚合物中对于催化有用的官能团的定向；以及ν)基于塑料的单体，除 了其形成超-分子主链的部分的得到且期望的作用之外，(i)用促进催化的化学功能正交 功能化；或ii)以“修饰”模式(在下面另外的详细地描述)正交功能化以接受氨基酸、基 于DNA的核苷酸、或其他对催化有贡献的单体、及其低聚物，从而正交活性单体不显著地促 进超-分子结构的整体形状或3D构象。
示例性的人工酶包括基于塑料的单体与具有促进催化的正交功能性的其他单体 的共聚合，该共聚合以利用后者的非-正交部分作为所得分子的一级主链的亚基的方式进 行。在本领域应理解，“流线”或“主链”共聚合，在本文所描述的情况下，且如此后在概念上 将使用的，描述多个单体家族包括到固相，使得单体的每一个独特的家族以与其他独特单 体家族相等的基础-就对超分子组装体的整体形状、折叠或3D构象的贡献程度而言-整合 到所得超-分子组装体。这种类型的聚合也已被描述为“选择性链增长”。参见，C. J. Hawker 和 K. L. ffoolev, Science 309，1200(2005)。
另一个示例性的人工酶包括共聚合的基于塑料的单体和具有促进催化的正交功 能性的其他单体，该共聚合以不利用后者的非-正交部分作为所得一级主链的亚基的方式进行。在本领域应理解，“侧基”或“修饰”共聚合，在本文所描述的情况下，且如此后将使 用的，描述多个单体家族包括到产物，使得其中促进正交功能的每一个家族以与形成实际 的和所理解的支架的一级单体家族不相等的基础-就3D构象而言-整合到超-分子组装 体中。这个方式的聚合也已被描述为“选择性链功能化”。图8显示共聚合的流线模式(左 边)和修饰模式(中间和右边)之间的差异的示意图。参见Hawker和Woo ley。
另一个示例性的人工酶包括基于塑料的单体与具有促进催化的正交功能性的其 他单体的共聚合，该共聚合以利用后者的非-正交部分作为相对于由聚合的塑料代表的一 级主链的二级主链的方式进行。在本领域应理解，这个“配对的”或“经典的”共聚合，在本 文所描述的情况下，且如此后将使用的，描述多个正交的-功能的单体家族的加入，使得后 者以与其他独特的单体家族相等或不相等的基础-就3D构象而言-整合到所得分子。相 对于聚合的塑料的所理解的“一级主链”，功能性单体的贡献可以是总体地相等的、总体地 不相等的、或其在每一个残基位置关于复合物的3D构象的整体贡献是变化的。本领域应理 解，配对的和共聚合的单体的非均质本质导致具有与配对的单体单独的聚合不同的折叠、 形状和3D构象的超-分子组装体。图9显示“经典的”双-单体非均质共聚物的实例[来 自 Prof. Martin Hubbe, North Carolina St. Univ.的说明]。
另一个示例性的人工酶包括基于塑料的单体与寡肽的非均质共聚合，以制造聚合 物支持的活性部位主要模拟物。这个结构将包括修饰-类型共聚合方案，其中亲核功能和 亲电功能将存在于主要的聚合物主链上，在空间上指向且与聚合的α -氨基酸上的羧基和 仲酰胺基团一致，以形成塑料和多肽的嵌段共聚物。
另一个示例性的人工酶包括基于塑料的单体与单链DNA的非均质共聚合，以制造 寡核苷酸主链的可寻址的模板，寡核苷酸主链用与氨基酸的催化反应性或识别等有关的官 能团功能化，且也可用对催化、反应性或识别惰性的官能团功能化。这个结构也将包括修 饰-类型的共聚合方案，其中功能将存在于主要的聚合物主链上，在空间上指向且与在聚 合的核苷酸单磷酸酯(类似单链DNA或RNA)上的磷酸基团的位置一致，以形成塑料和核酸 的嵌段共聚物。核酸可以是用另外的功能修饰以实现这种形式的共聚合的5’ -磷酸酯，例 如产生对塑料聚合物主链上的一致功能具有反应性的5’ -氨基磷酸酯、5’ -硫代磷酸酯和 5’ -磷酰胼基团。
图10显示包括PEG化的亮氨酸的主链/流线共聚合的示例性的合成方法。参见， R. W. Flood 等人，OrR. Lett. 3,683 (2001)。
图11显示包括引起流线共聚合方案中的折叠/方向变化的非天然氨基酸的示例 性合成方法。参见，S. Itsuno 等人，Polymer Bulletin 20,435 (1988)。
图12显示包括基于多肽的超-分子“构象体”的示例性的合成方法，此构象体可用 作修饰共聚合方案中的支架，修饰共聚合方案可能用N’ -功能化单体，得到叔酰胺。参见， C. E. MacPhee 和 D. N. ffoolfson, Curr. Qpin. Solid State and Matls. Sci. 8,141 (2004)。
图13显示包括基于塑料的“构象体”的示例性的合成方法，此构象体可用作 修饰共聚合方案中的支架，修饰共聚合方案可能用连接氨基酸等的功能化单体。参见， K. L. Wooley 等人，PNAS 97，11 147(2000)。
图14显示(顶部)包括基于塑料的支架的示例性的合成方法，此支架用于与单链 DNA发生非均质共聚合以得到预折叠的可寻址的模板，(中间)模板化为通过DNA杂交接近的试剂的可能反应类型，以及(底部)可用在聚合和/或正交功能化中的非天然氨基酸。参 见，D. Umeno 等人,Chem. Commun. , 1433 (1998) ；K. J. Gartner 等人,AnRew. Chem. Int. Ed. 41, 1796 (2002)；和 D. R. Halpin 等人，PLOS Biology 2,1031 (2004)。
图15显示使用醛功能性来诱导主链折叠、交联、催化且用作其他单体的功能化点 的示例性合成方法。参见，T. Groth 和 I. M. Melda, Comb. Chem. 3,45 (2001)。
图16显示示例性的基于塑料的聚合物。参见，A. E. Barron和R. N. Zuckerman. Curr. Qpin. Chem. Biol. 3. 681 (1999)。
图17显示小的亚-分子折叠体的概念的实例。参见P. J.Hill等人，Chem. Rev. 101. 3893(2001)。
Tsou已描述活性部位柔性的概念的实例。参见C. L. Tsou, Anal. NY. Acad. Sci. (2002)。
图18显示用有机金属功能化的实例。参见J. Kaplan和W. F. DegradoPNAS 101, 11566(2004)。
图19显示聚苯乙烯末端用马来酰亚胺的功能化，用于结合包括巯基的基团，例如 半胱氨酸。
图20显示折叠成“裂口”构象且用胺基和羟基预功能化的示例性的亚-分子单元 [图来自二氧化硅单体，Prof. Q. Yang, Acad. Sinica, PRC]。
图21显示折叠成裂口构象且用(从逆时针方向)胺、羧酸、醛、羟基、咪唑基和吡 啶基部分预功能化的示例性的亚-分子单元，每个功能化位于对于结构的每一个基于苯基 的单体来说独特的“地址”。此单元被锚定到固相，固相由在底部的厚的且成角度的线表示。 参见 G. C. Lloyd-Jones, Annu. Rep. ProR. Chem. 97 (2001)。
图22显示由被聚合成五个地址裂口的多个联苯基环单体组成的示例性的亚-分 子单元，每一个地址裂口具有正交的化学功能潜力。这个结构也是通过在底部显示的聚合 的和交联的基团锚定到固相的。
图23显示折叠成截短的环状构象的示例性的亚-分子单元，此构象具有在环的内 部上由十个(10)编号的、大的单球体或双球体部分表示的可功能化的“地址”。参见Kendig 的美国专利第6，716，370号。
图M显示交联成超-分子结构的五个( 亚-分子单元的示例性的俯视图，产生 裂口封闭尺寸从底部到顶部渐进地增加的催化裂口。每一个单元可如图21-23所描述的被 正交功能化。
图25显示催化裂口几何学的示例性理想化产物的斜侧视图，由多个截短的成形 的环和内表面功能化的亚-分子单元组成，亚-分子单元已被交联成封闭尺寸从右到左渐 进地增加的超-分子结构。还显示在末端的圆形的环“锚定物”或种子形状，该末端被用作 截短的环状单元迭代添加的聚合向导，以产生和保护产物的完整的“裂口”构象。在上方显 示用于尺寸对比的短的30个葡萄糖单体-长的纤维素分子。
通过引用并入
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本发明已被描述为人工酶。将理解，上面的描述仅为示例说明本发明的原理的应用，本发明的范围由根据说明书所考虑的权利要求确定。本发明的其他变型和修改对于本 领域技术人员来说是明显的。
权利要求
1.一种人工酶，包括与提供具有生物催化功能性的活性部位的其他单体共聚合的有机 聚合物。
2.如权利要求1所述的人工酶，其中所述活性部位包括天然氨基酸或人工氨基酸、具 有亲核和/或亲电基团的分子、或促进通常与大部分氨基酸固有的正交功能无关的独特的 化学功能的分子。
3.如权利要求2所述的人工酶，其中所述独特的化学功能包括酮-烯醇反应性、 烯-二醇形成、基于卤化物的Snl和Sn2置换、第尔斯-阿尔德反应、一般的易位反应、复合 有机金属功能、Henry反应、诺文葛耳反应、Morita-Baylis-Hillman反应、Steglich重排、 1,3偶极环加成、Strecker合成、烯丙基化、烷基化、卤化或氨基化。
4.如权利要求1所述的人工酶，其中塑料包括聚脲、聚酰亚胺、聚氨酯、聚丙烯酸或聚 乳酸。
5.如权利要求1所述的人工酶，其中塑料进一步与一种或多种其他塑料、其他类型的 有机聚合物、结合剂或交联剂共聚合。
6.如权利要求1所述的人工酶，其中与所述活性部位共聚合的塑料提供糖苷水解酶的 一种或多种功能。
全文摘要
本发明涉及使用人工聚合物模拟酶活性位点和使用这些人工酶进行催化。此外，如本文所使用的，人工酶更通常地指的是用于最佳地为反应提供特定的化学活性原子的基于聚合物的支架，而不仅仅是模拟天然酶的那些。各种聚合物可用于此模拟，包括聚酰亚胺、聚脲、聚氨酯、聚丙烯酸和聚乳酸，以及具有能够实现与下述物质整合的性质和功能性的其他聚合物天然氨基酸和人工氨基酸、具有亲核基团和亲电基团(分别类似于氨基酸的胺功能性和羧基功能性)的其他分子、以及促进通常与大部分氨基酸中固有的正交功能无关的独特的化学能力的其他分子，即，胺、羧基、甲酰胺、羟基、巯基和饱和烃。
文档编号C40B50/14GK102037167SQ200980115190
公开日2011年4月27日 申请日期2009年2月28日 优先权日2008年2月28日
发明者保罗·本特利, 文森特·苏萨菈 申请人:尹斯特有限公司