专利名称：一种用于评价运输应激模型的基因芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于评价运输应激模型的基因芯片及其应用。
背景技术：
运输应激(transport stress)是指在运输途中的禁食/限饲、环境变化(混群、密度、温度、湿度)、颠簸、心理压力等应激原的综合作用下，动物机体产生本能的适应性和防御性反映，是影响动物生产的重要因素之一。运输应激条件下，动物往往表现为呼吸、心跳加速，恐惧不安、性情急躁，体内的营养、水分大量消耗，并最终影响动物的生产性能、免疫水平及畜广品品质。运输应激的机理为动物受到应激原的作用后，下丘脑兴奋，分泌促肾上腺皮质释放激素，通过垂体门脉系统进入垂体前叶，使垂体前叶分泌肾上腺皮质激素(ACTH)增多，ACTH通过血液循环到达肾上腺，促使糖皮质激素的释放。应激初期分泌的肾上腺，也可刺激垂体前叶释放ACTH，ACTH分泌的增多，阻碍某些营养物质的吸收，加强分解代谢，抑制炎症和免疫反应，致使机体抵抗力下降。应激原的强度大，作用持久时，肾上腺皮质分泌功能衰竭，可造成动物发病和死亡。目前对于运输应激模型的评价并没有一个确定的标准，大多时候用皮质醇、儿茶酚胺等激素水平的变化来衡量应激的发生，但导致激素变化的影响因素太多，且其自身的代谢速度快，不能稳定和确切的指示机体实际的应激状态，所以我们引入基因芯片这一新技术。基因芯片技术作为基因诊断、相关基因确定、疾病分子机理分析、药物筛选等重要工具，具有高通量、并行性及样品消耗量少的优势，在中药研究尤其是新药的设计筛选开发独具魅力，能够进行大规模筛选，在药物与基因间架起一座桥梁，通过基因表达谱芯片实验可以同时观察成千上万个基因在不同个体、不同组织、不同发育阶段的表达状况，从疾病及药物两个角度对生物体的多个参数同时进行研究，发掘药物靶点并同时获取作用机制的相关信息，改变了传统的一次实验仅对单个或几个基因表达差异进行观察，为多环节药物作用机制的研究提供了有力工具。因此，我们希望通过基因表达谱分析找到能够评价动物运输应激模型的基因芯片。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于评价运输应激模型的基因芯片。本发明另一目的是提供一种包括上述基因芯片的试剂盒。本发明又一目的是提供一种利用上述基因芯片或试剂盒评价运输应激模型的方法。本发明提供的评价运输应激模型的基因芯片，其主要针对以下基因产生的RNA、CRNA或⑶NA进行检测
1、细胞死亡相关基因:Gdnf、Lifr、Ppp3rl、SphkK B4galtl、PhldaK 1124、Adm、Gsdmal、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tptl、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax02、免疫相关基因RTl-CE5、RTl-CE16、Tlr9、RTl-CE3、Ptms、B4galtl、Gpx2、Ptprc、CtnnbK Apobλ S100a9、Itga6、TgfbrK Hmoxl03、氧化应激相关基因Scdl、Gpx2、Akrlc21、Hmoxl、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Aldhlal、Fmo1、Cyp2jl0o4、应激应答相关基因Fgb、B4galtl、SphkU 1124、NrepΛ Adm、Fga、AcvrU A<qp2、Ptprc、Gpx2、Bcl211、Rela、Tnrc6a、Pdcd6ip、Ppp Ir 15b、Tgfbr1、Hmoxl、Gdnf、Casc3、Noxl、Cyplal、Aldhlal、Hspa8、Tfrc、Tlr9、Bax。一种优选的组合应当具有针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针Gdnf、Lifr、Ppp3rl、Sphkl、B4galtl、Phldal、1124、Adm、Gsdmal、Acvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tpt1、Aldhlal、Actc1、Rhot2、Bax、RTl-CE5、RTl-CE16、Tlr9、RTl-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、NoxK Cox7c、CyplaK FmoK Cyp2jl0、Fgb、NrepΛ Fga、Tnrc6a、Ppplrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0利用上述基因芯片对目的基因进行检测后，通过以下运输应激综合症评价标准进行检验1、细胞死亡相关基因上调 Ppp3rl、Sphkl、B4galtl、Phldal、1124、Adm、Gsdmal、Acvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Gdnf、Lifr ;下调 Tpt1、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax0 T 检验 Ρ〈0· 01。2、免疫相关基因上调 Ptms、B4galtl、Gpx2、Ptprc、Ctnnbl、Apob、S100a9、Itga6、TgfbrUHmoxl ;下调 RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3。T 检验 Ρ〈0.01。3、氧化应激相关基因上调 Scdl、Gpx2、Akrlc21、Hmoxl ；下调 Ndufc2、NoxKCox7c、Cyplal、Aldhlal、Fmol、Cyp2jlO。T 检验 P〈0.01。4、应激应答相关基因上调 Fgbλ B4galtl、SphkU 1124、NrepΛ Adm、Fga、AcvrUAqp2、Ptprc、Gpx2、Bcl211、Rela、Tnrc6a、Pdcd6ip、PppIr 15b、Tgfbr1、Hmoxl、Gdnf、Casc3 ；下调 NoxK CyplaK AldhlaK Hspa8、Tfrc、Tlr9、Bax0 T 检验 Ρ〈0.01。本发明中所述的探针可以是上述相应基因的核酸序列、其互补序列，或者它们的片段，它们被固定在适于检测反应的固相载体上，制成基因芯片。本发明中所述固相载体可选用本领域中众所周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果。优选的，本发明所述固相载体为玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片等。本发明所述基因芯片可包含在一个试剂盒中，其中还可以包括用于评价反应的相应试剂、缓冲液以及说明书等。其包括对上述基因产生的RNA或表达产物测定的全部或部分试剂，典型地，测定RNA的试剂包括荧光定量PCR检测试剂盒，原位杂交及其原位RT-PCR，Northern检测试剂盒等，测定蛋白表达产物的试剂盒，包括ELISA试剂盒、抗体芯片等。在本发明的实施方案中，所述固相载体为玻璃片，玻璃片用多聚赖氨酸进行处理，向其上固定具有本发明所选的基因特征性片段，利用机械手点印芯片，并将芯片重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性，得到评价用基因芯片。同时以荧光素标记待测样品，和芯片进行杂交。在本发明中，待测样品核酸的抽提可采用异硫氰酸胍稳定法，用分光光度计对RNA定量。本发明所述评价用基因芯片采用了下述严格交反应条件。依据本发明所选择的条件，可实现使大量杂交反应中的大多数反应物处于最佳状况中，从而使尽可能多的配对物都不遗漏，即减少假阳性的可能，将错配降到最低。(I)预杂交芯片1.取出芯片，平衡至室温；I1.加入 IX 杂交 Buffer ；II1. 45°C, 60rpm,预杂交 lOmin。(2)杂交液的配制表I杂交液的配制
权利要求
1.一种用于评价运输应激模型的基因芯片，其具有针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA 进行检测的探针中的一种或多种Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphkl、B4galt1、Phldal、1124、A dm λ Gsdmal、Acvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Re la、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tptl、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，还包括针对下述基因产生的RNA、cRNA 或 cDNA 进行检测的探针中的一种或多种RT1_CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Fmo1、Cyp2jl0、Fgbλ Nrepλ Fga、Tnrc6a、Ppplrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0
3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于，所述探针为来自下述基因的核酸序列或其互补序列:Gdnf、Lifr、Ppp3rl、SphkK B4galtl、PhldaK 1124、Adm、GsdmaKAcvrl、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Re la、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tpt1、AldhlaU ActcU Rhot2、Bax、RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S 100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Fmo1、Cyp2jlO、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppplrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0
4.一种用于评价运输应激模型的试剂盒，其包括针对下述基因产生的RNA、cRNA、cDNA或其表达产物进行测定的试剂Gdnf、Lifr、Ppp3rl、SphkU B4galtl、PhldaU 1124、Adm、Gsdmal、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl211、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmoxl、Sort1、Tptl、Aldhlal、Actcl、Rhot2、Bax0
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其还包括针对下述基因产生的RNA、cRNA、cDNA或其表达产物进行测定的试剂RT1-CE5、RTl-CE16、Tlr9、RTl-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scdl、Gpx2、Akrlc21、Ndufc2、Noxl、Cox7c、Cyplal、Fmol、Cyp2jl0、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppp lrl5b、Casc3、Hspa8、Tfrc0
6.根据权利要求4或5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为a)检测RNA、cRNA、cDNA的试剂盒荧光定量PCR检测试剂盒，原位杂交及原位RT-PCR，Nouthern检测试剂盒中的一种或几种； 或b)检测表达产物的试剂盒ELISA试剂盒或抗体芯片试剂盒中的一种或几种。
7.权利要求1-3任一项所述基因芯片、权利要求4-6任一项所述试剂盒在用于评价运输应激模型中的应用。
8.一种用于评价运输应激模型的方法，其特征在于，利用权利要求1-3任一项所述基因芯片或权利要求4-6任一项所述试剂盒对所述运输应激模型基因进行检测，通过基因的差异性表达进行聚类分析，从而评价运输应激模型。
全文摘要
本发明涉及一种用于评价运输应激模型的基因芯片及其应用。所述基因芯片包括针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针中的一种或多种Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax。本发明芯片通过一次实时、同步、高通量检测神经－免疫－内分泌指标的变化多层次、多靶点全面评价畜禽在运输应激后上述指标的典型变化，对于评价运输过程中畜禽的机体状况及生产性能具有指导意义。本发明芯片不仅将在新药研究中体现节省样品、节省时间，同时节省资金，具有重大实际意义。
文档编号C40B40/06GK103031374SQ20121043919
公开日2013年4月10日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者许剑琴, 刘凤华, 万长荣, 尹朋, 麻武仁, 徐霄龙 申请人:中国农业大学