专利名称：一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法
技术领域：
本发明涉及蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA文库的构建方法。
背景技术：
利用得到的大量拟南芥FL-cDNA (full-length cDNA)克隆，Ichikawa等人发展了
一种选择性功能增加方式，系统阐明拟南芥基因功能-被称为FOX hunting system(全
称 Full-lengthcDNA Over-expressing gene hunting system)在 2006 年，首先作为一种技术被提出。这种方法通过在转基因植物中过量表达单个或有限数量的FL-cDNA， 产生大量显性突变，可以根据新的重要特征，鉴定基因功能。这种技术的建立有重要的意义，为鉴定基因功能，几种系统和工具都是产生功能缺失突变而发展起来。目前，拟南芥FOX植株，水稻FOX拟南芥植株和FOX水稻植株都可以用来鉴定和探索植物基因的功能，结合使用这几种突变植株能更有效地分析基因的功能。因此，利用功能性技术，对植物的全长cDNA就可以进行基因功能分析。而现在，很多植物如大豆、小麦、柑橘和杨树等植物的全长cDNA克隆被收集。长期以来盐碱草源地区生长的乡土树种蒙古柳(Salixmongolica)。由于与其它柳树的居群不同,其生态学特性和表现型存在差异,植物的基因也具有多样性的特点，蒙古柳是盐碱地宝贵的生物基因资源，蒙古柳全长cDNA文库的研究还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法。本发明的一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法是按照以下步骤进行的一、采用异硫氰酸胍法提取蒙古柳的总RNA，然后采用试剂盒对提取的蒙古柳总RNA反转录成总cDNA ；二、将步骤一反转录的总cDNA连接到pGEM-T载体上，构建出pGEM_cDNA，转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建了 pGEM-cDNA在大肠杆菌JM109中的文库；三、将步骤二得到的pGEM-cDNA和pBI121载体，采用AsiSI和AscI酶分别进行双酶切，然后将酶切后的目的片段与酶切后的PBI121载体进行连接，得到植物二元表达载体pBI121::cDNA ；四、将步骤三得到的植物二元表达载体pBI121: :cDNA,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建出JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文库，提取JM109菌株的pBI121: : cDNA 克隆文库的 DNA ；五、将步骤四得到的JM109菌株的pBI121: : cDNA克隆文库的DNA通过电击转化导入根癌农杆菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA文库的构建。本发明包含以下有益效果本发明对蒙古柳中抗逆性基因进行研究，筛选出目的基因，利用分子生物学的手段，从基因表达特性及转基因植物对逆境的应答性进行深入细致的研究，以期获得具有耐性的植物材料。本发明作为抗旱、耐盐碱基础理论研究的一部分，将为植物耐性分子育种奠定理论基础。研究的结果不但可以丰富植物的遗传、生理方面的理论基础，同时对沙化土地资源的高效利用、生态环境的建设等方面具有一定的作用。
图I为具体实施方式
一中提取的蒙古柳嫩芽及根的总RNA的电泳图；其中，I为根的总RNA的电泳图，2为叶的总RNA的电泳图；图2为具体实施方式
一中蒙古柳嫩芽及根的总RNA反转录成总cDNA的PCR鉴定结果电泳图；其中，I为总cDNA的电泳图，2为λ DNA用HindIII酶切3小时后的电泳图；图3为具体实施方式
一中蓝白斑筛选进行检测结果；图4为具体实施方式
一中选取白斑进行PCR鉴定电泳结果图；其中，I为ADNA用HindIII酶切3小时后的电泳图，2为阴性对照；·图5为具体实施方式
一中选取白斑进行PCR鉴定电泳结果图；图6为具体实施方式
一中ρΒΙ121载体酶切检测电泳图；其中，I为λ DNA用HindIII酶切3小时后的电泳图，2为ρΒΙ121载体酶切后的电泳图；图7为具体实施方式
一中蒙古柳cDNA表达载体的构建不意图；图8为具体实施方式
一中蒙古柳pBI121: :cDNA载体的JM109克隆文库的PCR检测结果电泳图；其中I为λ DNA用Hind III酶切3小时后的电泳图，2为阳性对照；图9为具体实施方式
一中蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA植物表达文库的PCR检测结果电泳图；其中，I为DM2000，2为蒙古柳FOXhunting农杆菌cDNA电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式的一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法是按照以下步骤进行的一、采用异硫氰酸胍法提取蒙古柳的总RNA，然后采用试剂盒对提取的蒙古柳总RNA反转录成总cDNA ；二、将步骤一反转录的总cDNA连接到pGEM-T载体上，构建出pGEM_cDNA，转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建了 pGEM-cDNA在大肠杆菌JM109中的文库；三、将步骤二得到的pGEM-cDNA和pBI121载体，采用AsiSI和AscI酶(购自Fermentas公司)分别进行双酶切，然后将酶切后的目的片段与酶切后的pBI121载体进行连接，得到植物二元表达载体PBI121: :cDNA ；四、将步骤三得到的植物二元表达载体pBI121: :cDNA,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建出JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文库，提取JM109菌株的pBI121: :cDNA 克隆文库的 DNA ；五、将步骤四得到的JM109菌株的pBI121: :cDNA克隆文库的DNA通过电击转化导入根癌农杆菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA文库的构建。
具体是实施方式二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中所述的转录的总cDNA连接到pGEM-T载体的连接体系为
权利要求
1.一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法,其特征在于FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建是按照以下步骤进行的 一、采用异硫氰酸胍法提取蒙古柳的总RNA，然后采用试剂盒对提取的蒙古柳总RNA反转录成总cDNA ； 二、将步骤一反转录的总cDNA连接到pGEM-T载体上，构建出pGEM_cDNA，转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建了 pGEM-cDNA在大肠杆菌JM109中的文库； 三、将步骤二得到的pGEM-cDNA和pBI121载体，采用AsiSI和AscI酶分别进行双酶切，然后将酶切后的目的片段与酶切后的PBI121载体进行连接，得到植物二元表达载体pBI121::cDNA ； 四、将步骤三得到的植物二元表达载体PBI121::cDNA，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建出JM109菌株的pBI121: :cDNA克隆文库，提取JM109菌株的pBI121: : cDNA克隆文库的DNA ； 五、将步骤四得到的JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文库的DNA通过电击转化导入根癌农杆菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA文库的构建。
2.根据权利要求I所述的一种FOXhunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法，其特征在于步骤二中所述的转录的总cDNA连接到pGEM-T载体的连接体系为成分用量目的基因总cDNA片段10μ pGEM-T载体片段6pL10XT4 DNA Ligaase buffer2uLT4 DNA 连接_2pL 连接反应条件16°C水浴，12 14h。
3.根据权利要求I所述的一种FOXhunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法，其特征在于步骤三中所述的AsiSI和AscI酶切体系为成分用量pBI121-T-cDNA20μ!_.IOX Buffer3tuL AsiSI1.5(uLAsd1.5‘uLddtfcO4liL 反应条件37°C水浴，2 3h。
全文摘要
一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法，它涉及蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA文库的构建方法。本发明提供了一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法。构建方法如下提取蒙古柳的总RNA，反转录成总cDNA；连接到pGEM-T载体上，转化JM109感受态细胞中，构建了pGEM-cDNA；将pGEM-cDNA和pBI121载体，双酶切后连接，得到pBI121::cDNA；再转化至JM109感受态细胞中，构建出pBI121::cDNA克隆文库；电击转化根癌农杆菌EHA105菌株中，即完成。本发明对沙化土地资源的高效利用、生态环境的建设有一定作用。
文档编号C40B50/06GK102899726SQ201210447250
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者柳参奎, 南桂仙, 王连勇, 罗秋香, 张欣欣, 管清杰, 马书荣, 金淑梅, 李莹, 于耸 申请人:东北林业大学