桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗药性水平检测cDNA芯片的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗药性水平检测cDNA芯片及其制作方法和应用。本发明利用正向抑制性消减杂交（suppressionsubtractivehybridization，SSH）方法分别获得了不同抗性品系桔小实蝇抗药性特异上调表达基因片段，再PCR扩增各抗药性相关特异表达基因，纯化回收得到118个桔小实蝇抗敌百虫抗性相关特异性基因片段，103个桔小实蝇抗高效氯氰菊酯抗性相关特异性基因片段。以上述特异的抗性靶基因片段为DNA探针，构建了桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯检测cDNA芯片。本发明cDNA芯片能够简单有效地实现对桔小实蝇抗药性水平的实时监测。
【专利说明】桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗药性水平检测cDNA芯片的制备方法及其应用【技术领域】
[0001]本发明涉及昆虫抗药性检测【技术领域】。更具体地，涉及一种检测桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯的抗性水平的CDNA芯片及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]世界卫生组织在1957年对昆虫抗药性的定义是:“昆虫具有耐受杀死正常种群中大多数个体的药量的能力并在其种群中发展起来的现象”。昆虫对杀虫剂的抗药性是一种进化现象，是昆虫种群内部遗传结构在杀虫剂选择作用下持续变化的外在表现，是昆虫种群的一种特性，主要包括自然耐药性、交互抗药性、负交互抗药性及多抗药性等。昆虫产生抗药性的后果是:现行的化学药剂防治剂量效果降低-人们开始加大药剂剂量-昆虫抗性增强最终导致防治失败，给环境和人类食品安全生产带来严重的破坏性后果。桔小实蝇是我国华南及西南地区果实蔬菜上的重要害虫之一，每年给我过农业生产特别是经济水果造成重大的经济损失。目前，田间防治桔小实蝇主要采用的化学药剂防治，多年的田间种群监测数据显示桔小实蝇已经对多种农药产生了抗药性。
[0003]为了延缓昆虫抗药性发展，减少农药剂量的使用，保护环境和人类安全，对昆虫抗药性进行监测，实时掌握其抗药性动态，及时轮换使用不同类型的农药是治理昆虫抗药性产生的一种很好的策略。昆虫抗药性的机制主要分为:行为抗性、靶标抗药性和生理代谢抗药性。很多研究证明昆虫的这些抗药性机制都是由基因调控的，基因与抗药性是一种内因-表观的关系。因 此，了解不同类型杀虫剂作用下，昆虫产生抗性时，其体内特异性抗性相关基因的表达情况，可以为了解昆虫抗性发展水平提供依据。
[0004]基因芯片杂交技术(gene chip hybrid analysis)是基于核酸分子原位杂交技术原理发展而来的，根据碱基互补的原理，利用基因探针在基因混合物中识别特定基因。该技术将大量DNA探针分子固定于支持物上，然后与荧光标记的样品(DNA或RNA)进行杂交，通过检测杂交信号强弱来判断样品中靶分子的数量。可以对来源于不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与相关因素联系起来，加快这些基因功能的确定，具有广阔的应用前景。利用表达性基因芯片杂交技术，可以同时对抗药性及敏感昆虫体内的成千上万个不同基因进行差异表达定量检测。
[0005]桔小实蝇是我国华南及西南地区果实蔬菜上的重要害虫之一。在农业生产中，为了减少损失，目前，田间防治桔小实蝇主要采用的化学药剂防治，多年的田间种群监测数据显示桔小实蝇已经敌百虫、高效氯氰菊酯等多种农药已经产生了抗药性。2002-2004年，研究学者采用药膜法测定了广东、海南、福建、广西等4省(区)桔小实蝇汉dorsalis种群对敌百虫和高效氯氰菊酯的抗药性，结果表明澄海、闽南桔小实蝇种群对敌百虫抗药性达到4.56和4.07倍，大部分地区桔小实蝇种群对上述2种杀虫剂抗药性尚处于敏感阶段，同时监测2003-2004年广州郊区桔小实蝇成虫对敌百虫和高效氯氰菊酯的抗药性变化，发现除敌百虫外，桔小实蝇对高效氯氰菊酯的抗药性变化不明显。在接下来的2005-2007年间继续对我国7个省份不同地区的田间桔小实蝇抗药性发展进行了监测，结果表明不同地区桔小实蝇均对上述2种药剂抗药性呈上升趋势。随后2008-2012年对全国不同地区的连续监测表明田间桔小实蝇种群均对上述2种药剂抗性达到了中抗甚至高抗水平。
[0006]为了延缓昆虫抗药性发展，减少农药剂量的使用，保护环境和人类安全，对昆虫抗药性进行监测，实时掌握其抗药性动态，及时轮换使用不同类型的农药是治理昆虫抗药性产生的一种很好的策略。
[0007]目前桔小实蝇的抗药性监测主要采用的是生物测定法，但传统的生物测定方法比较繁琐，操作起来比较复杂，每次测定都需要大量的虫源，往往需要先从野外采集部分虫源带回人工饲养繁殖以达到供试虫数，结果使测得的抗药性水平具有滞后性。另外，生物测定受外界环境(如:虫态、营养、温度、湿度等)的影响较大，重复性和精确性较低。而分子生物学抗药性监测技术，其灵敏度较高，仅用少量试虫就可对抗药性程度进行检测，可实现对样品的高通量并行检测，操作简单，操作简单、省时且试验误差小，可以确定害虫个体的抗药性程度，这一点是生物测定方法所无法达到的。而实现分子抗药性监测就要对抗药性基因进行全面了解，检测更多的抗药性相关基因才能更准确的反映抗药性发展水平。
[0008]昆虫抗药性机制是其体内基因调控的结果，虽然研究者们已经对桔小实蝇的抗药性机制从多个方面进行了探讨，但是也存在着一些问题，在抗药性靶标基因的研究上较少，仅仅涉及到Malpha 6基因，在代谢抗药性相关研究中也仅对个别酶或蛋白变化现象进行了初步研究，并没有涉及到其编码的基因研究。同时昆虫抗药性是多基因共同协调作用的结果，是一种多基因效应现象。但到底有多少基因参与到抗药性作用、不同的抗药性水平涉及抗药性基因是否 相同及抗药性基因是怎样参与抗药性过程等方面的研究尚缺少报道。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是克服现有检测桔小实蝇抗药性的技术不足，提供了一种检测桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯的抗性相关基因表达水平的cDNA芯片。
[0010]本发明的另一目的在于提供上述cDNA芯片的构建方法。
[0011 ] 本发明还有一个发明目的是提供上述芯片的应用。
[0012]本发明的发明目的是通过以下技术方案予以实现:
提供一种检测桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗性水平的cDNA芯片，所述芯片包含221个靶基因cDNA探针；其中118个靶基因DNA探针为桔小实蝇抗敌百虫抗性相关特异性基因片段，103个靶基因DNA探针为桔小实蝇抗高效氯氰菊酯抗性相关特异性基因片段。
[0013]其中，118个桔小实蝇抗敌百虫特异性基因片段是:S004(4)-A9、S004⑷-B7、S004 ⑷-D6、S004(4)-H9、S004(5)_B10、S004(5)_B5、S004(5)_C10、S004(5)_C7、S004(5)-D1、S004(5)-D10、S004(5)_D11、S004(5)_G1、S004(5)_H3、S004(5)_H7、S004(6)-10、S004(6)-12、S004(6)_18、S004(6)_21、S004(7)_100、S004(7)_109、S004(7)-138、S004(7)-156、S004(7)_165、S004(7)_183、S004(8)_197、S004(8)_199、S004(8)-217、S004(8)-225、S004(8)_240、S004(8)_248、S004(9)_293、S004(9)_308、S004(9)-328、S004(10)-394、S004 (10)-401、S004 (10)-443、S004 (10)-471、S005(1)_A1、、S005 ⑴-B2、、S005 ⑴-Cl、S005 ⑴-D12、S005 ⑴-G8、S005 ⑵-A8、S005 ⑵-C7、S005 ⑵-E8、S005 ⑵-Gl、S005 ⑶-A5、S005 ⑶-A9、S005 ⑶-All、S005 ⑶-C11、S005 ⑶-D12、S005 ⑶-D8、S005 ⑶-H12、S005 ⑷-A2、S005 ⑷-A3、S005 ⑷-A8、S005 (4)-B8、S005 (4)-G1、S005 (4)_G2、S005 (5)_A5、S005 (5)_B7、S005 (5)_E11、
S005(5) -G6、S005 (5) -G9、S005 (5) -H2、S005 (6) -13、S005 (6) -17、S005 (6) -49、S005 (7) -98、S005(7)-100、S005(7)-103、S005(7)_116、S005(7)_107、S005(7)_131、S005(7)_176、S005(7)-178、S005(7)-18U S005(7)_188、S005(7)_189、S005(8)_200、S005(8)_194、S005(8)-211、S005(8)-212、S005(8)_213、S005(8)_216、S005(8)_224、S005(8)_235、S005(8)-236、S005(8)-254、S005(8)_259、S005(8)-26U S005(8)_286、S005(8)_264、S005(9)-293、S005(9)-299、S005(9)_304、S005(9)_308、S005(9)_310、S005(9)_312、S005(9)-317、S005(9)-329、S005(9)_333、S005 (9)-350、、S005(9)_355、S005(9)_357、S005(9)-358、S005(9)-359、S005(9)_371、S005 (10)-388、S005 (10)-390、S005 (10)-401、
5007⑶-Gil、S007(6)-34、S007(7)_107、S007 ⑴-178、S007(8)_192、S007(8)_259、S007(10)-420，序列如 SEQ ID N0.5" SEQ ID N0.122 所示。
[0014]103个桔小实蝇抗高效氯氰菊酯特异性基因片段是:S002(1)-A3、S002(1)_B4、S002⑶-D9、 S002⑶-E7、 S002(4)_C10、 S002⑷-E4、 S002(4)_F8、 S002(5)_E5、S002 (6)-16, S002(6)-19, S002 (6)-82, S002(8)_270、S002(10)-416、S002 (10)-452、
5002(10)-444、S008(l)-B2、S008 (I)-DlU S008 (1)_D5、S008(1)_D6、S008(1)_E3、S008⑴-F10、 S008⑴-F12、 S008⑵-B1、 S008⑵-F10、 S008(2)_F12、 S008⑵-Gl、
5008⑶-BIO、S008(3)-C11、S008 ⑶-DIO、S008(5)_B12、S008(5)_B8、S008(5)_C7、S008 (5)-E5、S008 (5)-G11、S008 (5)_H2、S008 (6)_14、S008 (6)_29、S008 (6)_42、S008 (6)-58、S008 (6)-64、S008 (6)_77、S008 (6)_85、S008 (6)_93、S008 (7)_130、S008(7)-135、S008 (8)-276, S003 (I)-AlO, S003 (1)_B6、S003(1)_D7、S003(1)_E1、
5003(I) -E9、S003 (I) -F2、S003 (I) -F5、S003 (I) -F9、S003 (I) -G4、S003 (2) -C6、S003 (2) -D4、S003 ⑵-D5、S003 ⑵-E7、S003 ⑵-F3、S003 ⑵-G5、S003 ⑶ _F1、S003 (3)_H10、S003⑷-A8、 S003⑷-Cl、 S003(4)_C12、 S003⑷_F1、 S003⑷-G6、 S003(5)_B11、
S003(5) -B2、S003 (5) -B8、S003 (5) -E6、S003 (5) -H5、S003 (6) -8、S003 (6) -32、S003 (6) -51、S003(6)-74、S003 (6)-81, S003(6)_92、S003(7)_151、S003(7)_160、S003(7)_165、S003(7)-167、S003(7)-175、S003(8)_196、S003(8)_204、S003(8)_220、S003(8)_224、S003(8)-231、S003(8)-249、S003(8)_271、S003(8)_284、S003(8)_288、S003(9)_311、S003(9)-312、S003(9)-321、S003(9)_352、S003(10)-395、S003 (10)-404、S003(10)-405、S003(10)-406、S003(10)-432、S003(10)-469，序列如 SEQ ID N0.123~SEQ ID N0.225 所示。
[0015]本发明提供的cDNA芯片的构建方法如下:
51.SSH文库构建:分别提取桔小实蝇敏感品系、敌百虫抗性品系和高效氯氰菊酯抗性品系的RNA，按本实验室构建SSH文库的策略和方法(Li，2011)，分别构建与抗敌百虫和抗高效氯氰菊酯相关的SSH文库；
52.从SI构建的两个文库中分别随机挑选2820个差减重组克隆子，然后摇菌、提取重组质粒DNA ；
53.分别以S2获得的重组质粒DNA为模板，以接头引物NestedPCR Primer IF (SEQID N0.1)和 Nested PCR Primer 2R (SEQ ID N0.2)进行 PCR 扩增，将各基因 PCR 产物凝胶电泳检测其浓度和片段的单一性，并进行纯化回收；
54.将S3纯化产物采用芯片点样仪点样于化学修饰的载玻片载体上，同时设置阳性和阴性对照，得到初始基因芯片； 55.分别采用构建SSH文库时使用的抗性品系总RNA和敏感品系总RNA为检测样，对
S4得到的初始基因芯片进行DNA芯片杂交，去除假阳性差异基因，选择在基因芯片上杂交后上调信号值大于等于2的样品为抗性相关差异表达基因；
56.以S5得到的抗性相关差异表达基因的重组质粒为模板进行PCR扩增，引物同S3所述，对产物进行纯化回收并测序，序列采用DNAstar软件进行拼接组装，去除重复和冗繁序列，挑取出单一非重叠序列作为特异性抗性相关靶标基因。
[0016]S7.将S6得到的特异性抗性相关靶标基因利用基因芯片点样仪点样于化学修饰的玻璃片载体上，同时设置阳性和阴性对照，委托北京博奥生物有限公司构建检测桔小实蝇抗敌百虫和抗高效氯氰菊酯的抗性水平的cDNA芯片。
[0017]其中，步骤SI所述SSH文库构建的具体操作包括接头连接、第一次扣除杂交、第二次扣除杂交、第一次抑制性PCR、第二次抑制性PCR ;利用桔小实蝇看家基因G6PDH进行半定量PCR，分别检测所述接头连接和消减杂交效率，引物序列为G6TOH-F:5’ -GCTGCCGAAACCTACAAA-3’ (SEQ ID N0.3)，G6PDH-R:5’ -CGCTTATCATAGCCACCC-3’ (SEQID N0.4)，扩增片段中不含Tfea I酶切位点。
[0018]步骤S7所述化学修饰的玻璃片载体是指:通过化学反应在载体表面上引入氨基官能团，使DNA能够与表面官能团能共价结合，稳定地固化于支持物表面。
[0019]本发明具有以下有益效果:
本发明首次采用基因芯片技术，发掘并寻找桔小实蝇抗药性相关基因片段，然后利用抗性相关基因片段点制成特异性靶标抗性相关cDNA芯片，对桔小实蝇抗性水平进行监测。可以同时对抗药性及敏感虫体内的成千上万个不同基因进行差异表达定量检测，过程简单有效，弥补了传统生测方法的不足，实现高通量、快速、准确实时监测桔小实蝇抗性发展，从而延缓其抗药性，实现食品生产安全。
[0020]另外，分别通过对抗敌百虫3.21倍、16.8倍和69.5倍及抗高效氯氰菊酯5.3倍、21.6倍和160.9倍桔小实蝇成虫品系抗性相关基因表达水平的检测表明，该基因芯片具有高通量、集成化和微型化的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为初始基因芯片筛选SSH克隆文库杂交扫描图。
[0022]图2为本发明制备cDNA芯片检测桔小实蝇抗性品系杂交扫描图。
【具体实施方式】
[0023]以下结合具体实施例来进一步说明本发明，除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和实验方法为本【技术领域】常规试剂、设备和方法。[0024]本发明实施例消减杂交(SSH)采用Clontech公司生产的试剂盒(购自广州瑞真生物公司，具体操作参照本实验室李怡峰博士论文进行);PCR扩增试剂、感受态细胞DH5 a购自瑞真生物公司，总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，克隆载体pGEM_T购自Promega 公司。
[0025]分子生物学基本操作:琼脂糖凝胶电泳、PCR产物纯化回收、克隆连接、转化、质粒提取、酶切鉴定等分子生物学操作按照《分子克隆实验操作指南》(科学出版社，第三版，黄培堂编译，2002年)操作。序列测序有上海英潍捷基公司广州分公司完成。
[0026]实施例1检测桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗性水平的cDNA芯片的构建 1、桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗性品系SSH文库的构建
(I)結小实妮抗性品系选育:
用试验室饲养保留的敏感品系作为抗药性品系筛选的亲代Ftl，在室内同一条件下饲养，采用药膜法，分别用敌百虫和高效氯氰菊酯进行逐代筛选。
[0027]敏感品系Ftl的选择标准:敌百虫对桔小实蝇成虫敏感品系的致死中浓度LC50=2.65mg/L ;高效氯氰菊酯对桔小实蝇敏感品系的致死中浓度LC5(I=3.36mg/L。
[0028]抗性品系的获得:经过一些代数的筛选后，敌百虫筛选至22代后，敌百虫对桔小实蝇成虫的致死中浓度LC5Q=184.17mg/L ;高效氯氰菊酯筛选至24代后，高效氯氰菊酯对桔小实蝇成虫的致死中浓度为LC5(i=538.49mg/L。
[0029]具体筛选步骤为:首先测定亲代(Ftl)对敌百虫和高效氯氰菊酯的毒力敏感基线，然后采用药膜法，以致死中浓度(LC5tl)对种群进行抗药性筛选；以丙酮稀释药剂至亲代LC50浓度，均匀涂布于250mL锥形瓶中，待丙酮完全挥发后，放入50-60头羽化后3_5天的桔小实蝇成虫，用医用纱布封口，倒置24hr，条件为:光周期:14hr光照:10hr黑暗，温度26-30°C，湿度:60%-95%。24hr后，存活下来的成虫移入养虫笼中用人工饲料饲养。连续处理三代。从第四代开始根据第三代成虫的LC5tl浓度处理接下来的三代，以此类推，使其种群获得抗药性，得到桔小实蝇抗敌百虫和抗高效氯氰菊酯成虫品系。
[0030](2)分别以步骤(1)中各抗性品系为检测子，以敏感品系成虫为驱动子，分别构建各抗性品系特异性差异基因表达文库。
[0031]构建的特异性差异基因表达文库经过两轮消减杂交和2次选择性PCR后，获得了库容量为9.48 X IO3的桔小实蝇成虫抗敌百虫品系差异基因表达文库，库容量为1.05 X IO4的桔小实蝇成虫抗高效氯氰菊酯品系差异基因表达文库。
[0032]2、初始基因芯片的制备
(I)从抗敌百虫和抗高效氯氰菊酯品系SSH文库中分别随机挑选2820个差减重组克隆子，然后摇菌、提取重组质粒DNA。
[0033](2)采用 Nested PCR Primer IF(序列见 SEQ ID N0.1)和 Nested PCR Primer 2R(序列见SEQ ID N0.2)引物分别PCR扩增每一个重组质粒。PCR体系包括IOXPCR BufferIOu L, 2.5mmol/L dNTP 8 u L、F/2R 引物(10 y mol/L)各 4 y L，重组质粒 DNA 模板 10_50ng、Taq DNA 聚合酶(5U/ii L) 0.L，加无菌水至 IOOii L。PCR 反应参数:94°C变性 30S，68°C退火30S, 72°C延伸1.5min, 35个循环，72°C延伸5min。
[0034](3)用酒精- 异丙醇法沉淀纯化PCR扩增产物，凝胶电泳检测其浓度和片段的单一性，以桔小实蝇G6H)H、28S和P -actin基因为内参基因对照，产物送北京博奥生物有限公司点制成芯片，纯化产物采用芯片点样仪点样于化学修饰的载玻片、硅片、膜或高分子材料等载体上。芯片样品还包括Hex作为阳性对照，Blank (点样溶液)作为阴性对照。整个点阵分为32个亚阵列，亚阵列有12列，11行，点间距为150 u m,点的直径约为100 u m,每个样品在芯片上重复3次。
[0035]3、cDNA芯片杂交确定桔小实蝇成虫抗敌百虫和抗高效氯氰菊酯抗性相关基因片段
分别采用构建SSH文库时使用的抗性品系总RNA和敏感品系总RNA为检测样，进行cDNA芯片杂交，去除假阳性差异基因；选择在基因芯片上杂交后上调信号值大于等于2的样品为抗性差异表达片段；以重组质粒为模板，上述Nested PCR Primer IF和Nested PCRPrimer 2R引物进行PCR扩增，扩增体系与反应参数同步骤(2)所述，对产物进行纯化回收并测序，序列采用DNAstar软件进行拼接组装，去除重复和冗繁序列，挑取出单一非重叠序列序列作为抗性相关特异性靶片段。
[0036]芯片杂交:探针RNA样品的荧光标记采用晶芯? cRNA扩增标记试剂盒(博奥生物有限公司，产品目录号:360060-10)，具体操作按照说明书进行。标记的DNA溶于80 ill杂交液中(3XSSC，0.2%SDS, 5 X Denhart’s，25%甲酰胺)，于42 °C杂交过夜。杂交结束后，先在42°C左右含0.2% SDS, 2 X SSC的液体中洗5 min，而后在0.2 X SSC中室温洗5 min。玻片甩干后即可用于扫描。
[0037]芯片扫描:芯片用LuxScan IOKA双通道激光扫描仪进行扫描。
[0038]芯片图像的采集与数据分析:采用LuxScan 3.0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像(图1)进行分析，把图像信号转化为数字信号；根据cy5和cy3总体信号的整体平均值(global mean)对各芯片进行片间线性校正；使用Lowess方法进行片内归一化；每个基因有三个以上重复比值，即用SAM软件进行分析，FDR控制在5%以内，再以2倍标准筛选差异表达基因。
[0039]4、检测cDNA芯片的制备
对3中选取的差异表达片段的重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增引物、体系与反应参数同步骤2 (2)所述，产物纯化后片段点制成cDNA芯片，方法同上述初始基因芯片的制备。
[0040]实施例2本发明制备的cDNA芯片对桔小实蝇抗性品系抗药性的检测 1、桔小实蝇抗性品系的选育
用试验室饲养保留的敏感品系作为抗药性品系筛选的亲代H)，在室内同一条件下饲养，采用药膜法，分别用敌百虫和高效氯氰菊酯进行逐代筛选。具体步骤同前述。结果分别获得了抗敌百虫3.21倍、18.23倍和69.5倍抗性品系；抗高效氯氰菊酯6.8倍、16.2倍和160.74倍品系。冋时，测定了抗闻效氣氛菊酷160.74倍品系对敌百虫的交互抗性为21.20倍。
[0041]2、結小实妮抗性品系和敏感品系样品总RNA的提取
分别取选育的每一个抗性品系和敏感品系羽化后3飞天的成虫提取总RNA (雌雄各8头)，总RNA提取采用Trizol ( Invitrogen)试剂法,具体操作参照试剂说明。样品破碎采用玻璃珠研磨法,研磨器为MiniBeadbeater-16研磨珠均质器(Biospec,美国)。
[0042]总RNA质量检测:RNA提取完成后，取2 U L用微量紫外分光光度计测定RNA样品的浓度与纯度，高质量的RNA样品0D26(i/28(i应在1.9^2.1之间。取5 ii L用1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，桔小实蝇RNA质量判定标准:28S条带亮度较弱，18S、5S条带较明亮，符合昆虫物种中大部分总RNA存在隐裂现象。
[0043]3、荧光标记及杂交
各抗性品系和敏感品系总RNA的反转录、荧光标记和杂交方法同前述。芯片扫描和图像采集与数据分析均同前述，检测结果见图2。
[0044]4、cDNA芯片检测结果
(I)抗敌百虫品系cDNA芯片检测结果
抗敌百虫3.21倍品系相对于敏感品系，其上调差异表达基因共有12个，抗敌百虫18.23倍品系相对于敏感品系，其上调差异表达基因共有50个，抗敌百虫69.5倍品系相对于敏感品系，其上调差异表达基因共有51个(如表1和表2所示)。
[0045]抗高效氯氰菊酯160.74倍品系(对敌百虫的交互抗性为21.20倍)相对于敏感品系在抗敌百虫特异性表达基因芯片中的上调表达基因有43个(如表1和表2所不)。
[0046]表1桔小实蝇成虫抗敌百虫差异上调表`达基因
【权利要求】
1.一种检测桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗药性水平的cDNA芯片，其特征在于，包含221个靶基因DNA探针；其中118个靶基因DNA探针为桔小实蝇抗敌百虫抗性相关特异性基因片段，103个靶基因DNA探针为桔小实蝇抗高效氯氰菊酯抗性相关特异性基因片段。
2. 根据权利要求1所述cDNA芯片，其特征在于，所述的118个桔小实蝇抗敌百虫抗性相关特异性基因片段是:S004(4)-A9、S004(4)_B7、S004(4)-D6、S004(4)_H9、S004(5)-BIO、S004(5)-B5、S004(5)-C10、S004(5)_C7、S004(5)_D1、S004(5)_D10、S004(5)_D11、5004(5) -GU S004(5)-H3、S004 (5)_H7、S004(6)_10、S004 (6)_12、S004(6)_18、S004(6)-21、S004 ⑴-100、S004(7)_109、S004(7)_138、S004(7)_156、S004(7)_165、S004(7)-183、S004(8)-197、S004(8)_199、S004(8)_217、S004(8)_225、S004(8)_240、S004(8)-248、S004(9)-293、S004(9)_308、S004(9)_328、S004 (10)-394、S004 (10)-401、S004(10)-443、S004(10)-471、S005(1)_A1、S005(1)_B2、S005(1)_C1、S005(1)_D12、5005(I) -G8、S005 (2) -A8、S005 (2) -C7、S005 (2) -E8、S005 (2) -Gl、S005 (3) -A5、S005 (3) -A9、S005⑶-All、 S005(3)-C11、 S005⑶-D12、 S005⑶-D8、 S005⑶-H12、 S005⑷-A2、S005 (4) -A3、S005 (4) -A8、S005 (4) -B8、S005 (4) -Gl、S005 (4) -G2、S005 (5) -A5、S005 (5) -B7、S005 (5)-E11、S005 (5)-G6、S005 (5)_G9、S005 (5)_H2、S005 (6)_13、S005 (6)_17、S005(6)-49、S005(7)-98、S005(7)_100、S005(7)_103、S005(7)_116、S005(7)_107、S005(7)-131、S005(7)-176、S005(7)_178、S005(7)_181、S005(7)_188、S005(7)_189、S005(8)-200、S005(8)-194、S005(8)_211、S005(8)_212、S005(8)_213、S005(8)_216、S005(8)-224、S005(8)-235、S005(8)_236、S005(8)_254、S005(8)_259、S005(8)-26US005(8)-286、S005(8)-264、S005(9)_293、S005(9)_299、S005(9)-304, S005(9)_308、S005(9)-310、S005(9)-312、S005(9)_317、S005(9)_329、S005(9)_333、S005(9)_350、S005(9)-355、S005(9)-357、S005(9)_358、S005(9)_359、S005(9)_371、S005 (10)-388、S005(10)-390、S005(10)-401、S007 ⑶-Gil、S007(6)_34、S007 (7)-107, S007 (7)-178,S007(8)-192、S007(8)-259、S007(10)-420，序列如 SEQ ID N0.5" SEQ ID N0.122 所示; 所述的103个桔小实蝇抗高效氯氰菊酯抗性相关特异性基因片段是:S002(1)-A3、5002⑴-B4、S002 ⑶-D9、S002 ⑶-E7、S002 ⑷-CIO、S002 ⑷-E4、S002 (4)_F8、S002(5)-E5、S002(6)-16、S002 (6)-19, S002(6)_82、S002(8)_270、S002 (10)-416、S002(10)-452、S002(10)-444、S008(1)_B2、S008(1)_D11、S008(1)_D5、S008(1)_D6、S008⑴-E3、 S008⑴-F10、 S008⑴-F12、 S008⑵-B1、 S008(2)_F10、 S008⑵-F12、S008⑵-Gl、 S008⑶-BIO、 S008(3)_C11、 S008⑶-DIO、 S008(5)_B12、 S008(5)_B8、S008 (5)-C7、S008 (5)-E5、S008 (5)_G11、S008 (5)_H2、S008 (6)_14、S008 (6)_29、S008 (6)-42、S008 (6)-58, S008 (6)_64、S008 (6)_77、S008 (6)_85、S008 (6)_93、S008(7)-130、S008(7)-135、S008 (8)-276, S003(1)_A10、S003(1)_B6、S003(1)_D7、5003(I) -El、S003 (I) -E9、S003 (I) -F2、S003 (I) -F5、S003 (I) -F9、S003 (I) -G4、S003 (2) -C6、S003(2)-D4、 S003⑵-D5、 S003⑵-E7、 S003⑵-F3、 S003⑵-G5、 S003⑶_F1、S003(3)-H10、S003 ⑷-A8、S003 ⑷-Cl、S003 ⑷-C12、S003 ⑷ _F1、S003 ⑷-G6、S003 (5) -BH、S003 (5) -B2、S003 (5) -B8、S003 (5) -E6、S003 (5) -H5、S003 (6) -8、S003 (6) -32、S003(6)-51、S003(6)-74、S003 (6)-81, S003 (6)_92、S003 (7)_151、S003 (7)_160、S003(7)-165、S003(7)-167、S003(7)_175、S003(8)_196、S003(8)_204、S003(8)_220、S003(8)-224、S003(8)-23U S003(8)_249、S003(8)_271、S003(8)_284、S003(8)_288、S003(9)-311、S003(9)-312、S003(9)_321、S003(9)_352、S003 (10)-395、S003 (10)-404、S003(10)-405、S003(10)-406、S003(10)-432、S003(10)-469 ;序列如 SEQ ID N0.123~SEQID N0.225 所示。
3.权利要求1所述DNA芯片的构建方法，其特征在于，步骤如下: 51.抑制性消减杂交(suppressionsubtractive hybridization, SSH)分别构建桔小实蝇抗敌百虫和抗高效氯氰菊酯抗性品系SSH文库； 52.从SI构建的两个文库中分别随机挑选差减重组克隆子，提取重组质粒DNA； 53.分别以S2获得的重组质粒DNA为模板，以NestedPCR Primer IF (SEQ ID N0.1)和Nested PCR Primer 2R (SEQ ID N0.2)为接头引物进行PCR扩增，检测各PCR产物浓度和片段的单一性，纯化回收得到产物； 54.将纯化回收得到的产物点样于化学修饰的载体上，同时设置阳性和阴性对照，得到初始基因芯片； 55.分别采用步骤SI构建文库时使用的抗性品系总RNA和敏感品系总RNA为检测样，进行DNA芯片杂交，去除假阳性差异基因，选择在基因芯片上杂交后上调信号值大于2的样品为抗性相关差异表达基因片段； 56.以S5得到的抗性 相关差异表达基因片段的重组质粒为模板进行PCR扩增，引物同S3所述，对产物进行纯化回收、测序、拼接组装，去除重复和冗繁序列，挑取出单一非重叠序列作为特异性抗性靶标基因； 57.将S6得到的特异性抗性靶标基因点样于化学修饰的载体上，同时设置阳性和阴性对照，构建得到检测桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯的抗性水平的cDNA芯片。
4.根据权利要求3所述cDNA芯片的构建方法，其特征在于，S4和S7所述的载体为载玻片材料。
5.根据权利要求3所述cDNA芯片的构建方法，其特征在于，S7所述的化学修饰是指通过化学反应在载体表面上引入氨基官能团，使DNA能够与表面官能团能共价结合，稳定地固化于支持物表面。
6.权利要求1所述cDNA芯片在检测桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯的抗性水平方面的应用。
【文档编号】C40B50/06GK103614473SQ201310609364
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】曾玲, 姜建军, 陆永跃, 何晓芳, 梁广文, 温硕洋 申请人:华南农业大学