金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法

本发明涉及免疫检测，具体涉及一种金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、沙门氏菌(salmonella)是一种革兰氏阴性肠道杆菌，可感染各种动物，引起以腹泻、肠道出血等胃肠道症状和败血症为主要临床特征的沙门氏菌病。此外，沙门氏菌也是一种最常见的食源性致病菌，可通过污染的肉、蛋、奶等动物性食品或饮用水传播给人类，造成中毒，危害人类健康。据统计，由沙门氏菌引起的食品中毒病例在世界各地食物中毒病例中屡居首位，在美国，每年就有超过1500万人因感染沙门氏菌而发生中毒。肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)隶属于肠杆菌科沙门氏菌属肠道亚种肠炎血清型，是引起动物疾病和食物中毒最主要的沙门氏菌血清型，全球每年约40％～60％的人类感染沙门氏菌案例是由肠炎沙门氏菌引起。据我国2015年食源性监测报告显示，肠炎沙门氏菌是我国微生物性食源性疾病暴发的主要致病因子之一，对人类健康和安全的影响非常大。

2、沙门氏菌拥有广泛的宿主性，根据其对宿主的嗜性可以分为仅对特定的动物或人产生疾病的专嗜性沙门氏菌以及对人和动物都具有普遍致病性泛嗜性沙门氏菌。肠炎沙门氏菌属于泛嗜性沙门氏菌，能够感染人和各种动物，是人畜共患病的重要病原菌。沙门氏菌的传播不需要中间宿主，能够在人与人、人与动物、动物与动物之间进行水平传播，也可以垂直传播。沙门氏菌感染动物后，主要引起畜禽抵抗力减弱、免疫力下降、怀孕母畜流产等，进而使动物继发其他感染，严重情况下会导致畜禽大量死亡。一旦感染沙门氏菌，患病动物的血液、粪便、分泌物等都会带毒而成为传染源。人类误食被沙门氏菌污染的食物或水，会造成腹痛、恶心以及腹泻等，严重者可引起发热、胃肠炎甚至败血症等，对于幼童、老人和免疫缺陷疾病患者等免疫力低下人群的影响尤其严重，甚至可能危及生命。

3、沙门氏菌传统检测是指采用国家强制性标准gb4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行沙门氏菌分离鉴定的方法，需要对样品进行前处理，经过预增菌、增菌、分离、生化实验、血清学鉴定、血清学分型等步骤才能判定检测结果。例如，蔡标等按照此标准成功从食品样品中分离到两株沙门氏菌并对其进行了鉴定。该方法是实验室常用的比较成熟的检测方法之一，但此方法需在专门实验室由专业检验人员开展，且存在操作步骤繁杂，耗时较长的缺点，鉴定阳性样品通常需要7天左右的时间。

4、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)是指在体外使用引物选择性扩增目的dna或rna的检测技术。研究人员曲识同时使用pcr检测法和传统检测方法对210个样本进行检测，发现沙门氏菌检出率为30.95％，且pcr检测方法的灵敏度、特异性等都优于传统法(p＜0.05)。陆瑶等人设计了一对特异性引物，经过反应条件的优化后，建立了一种能够特异性检测鸡白痢沙门氏菌的pcr方法，对鸡白痢沙门氏菌具有高度的特异性，且检测限低至1×102cfu/ml，具有较高的灵敏度。蒋玥等根据4种养禽业常见沙门氏菌血清型的特异基因位点设计引物，建立了一种可同时检测鉴别鸡白痢、肠炎、鼠伤寒和伤寒的多重pcr方法，对这四种沙门氏菌血清型的最低检测限分别达到13.1pg/ml、12.5pg/ml、13.7pg/ml和12.3pg/ml。传统pcr检测法和荧光定量pcr能够在10h内得到检测结果，具有良好的特异性和灵敏度，但是此方法操作相对复杂，还需要专业人员操作和专门实验室及实验设备，且容易出现污染导致假阳性。

5、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method，lamp)是在pcr技术基础上改进而来在反转录酶和聚合酶的作用下以恒定的温度就能进行体外核酸扩增的一种新技术。吴佳林等针对沙门氏菌侵袭蛋白基因(inva)设计引物，建立了快速检测肠炎沙门氏菌的lamp检测方法，该方法具有优异的灵敏度，检测限能够达到1×101cfu/ml。郭澍强等建立的lamp检测方法对沙门氏菌纯培养物的灵敏度可达到1×101cfu/ml，灵敏度比普通pcr高10倍，且操作更加简单，反应结果易于观察。lamp检测方法虽有着高灵敏度和高特异性，但是此方法需要提取细菌总dna并且容易出现气溶胶污染，造成假阳性，而且检测成本较高。

6、酶联免疫吸附测定(elisa)是先将抗体或者抗原固定到载体表面，将待测物与酶标抗体或抗原按照不同步骤与固定到载体表面的抗原或抗体反应，加入酶反应的底物后，底物被催化为有色底物，根据底物颜色反应进行定性或定量分析。伍燕华等使用抗沙门氏菌多抗与单抗建立了一种检测沙门氏菌的双抗体夹心elisa方法，该方法可以检测多种类型的沙门氏菌，检测限为1×104cfu/ml，且不与其他菌产生非特异反应。张帅等利用基于杂交瘤技术制备的鼠源单克隆抗体，建立了一种可以检测6种沙门氏菌的双抗体夹心elisa检测方法，检测模拟肉样中的沙门氏菌，检测限为800cfu/ml。elisa检测法虽耗时短，具有良好的特异性与灵敏性，但操作步骤复杂，且需要酶标仪等精密仪器设备。

7、核酸探针技术是基于核苷酸碱基互补的原理，在已知序列的核苷酸片段上进行标记作为探针，并识别待测样品中的一段互补的分子片段。almeida等建立了一种新颖的肽核酸探针结合荧光原位杂交方法对沙门氏菌进行了检测。应用该方法对血液、粪便、水以及婴儿奶粉样品中的沙门氏菌进行了检测，准确度高达100％。但由于核酸探针需要标记，技术要求较高，且沙门氏菌血清型众多，相关探针研究难度较大，目前尚未在临床上广泛推广与应用。

8、基因芯片技术是将分子生物学与计算机芯片技术相结合，根据分子杂交信号检测目标物的一种新型技术，可以同时对大量样品基因进行分析。许俊钢等利用基因芯片技术对包括沙门氏菌在内的4种常见的致病细菌进行检测，30个临床样本的检测结果均比较准确，8h即完成了全部细菌的检测，大大提高了检测效率。王振全等采用点样法制备杂交芯片，建立了一种可同时检测多种致病菌的基因芯片检测方法，此方法无交叉反应，特异性良好，对沙门氏菌检测的灵敏度在1.38×10-5pg/μl-151pg/μl之间。但此方法存在技术成本昂贵，重复性差等缺点，阻碍了基因芯片技术的进一步发展。

9、因此，如何提供一种快速高灵敏度的肠炎沙门氏菌检测技术成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法，包含金核银壳纳米颗粒的试纸条能实现肠炎沙门氏菌的快速高灵敏度检测。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、一种金核银壳纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

4、将胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液混合均匀，离心，去离子水重悬，加入柠檬酸钠溶液，搅拌均匀，升温至50～75℃，加入抗坏血酸溶液，搅拌均匀，在搅拌下加入硝酸银溶液，搅拌均匀，得到金核银壳纳米颗粒溶液。

5、作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的体积比为10：(0.005～0.02)，所述4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的摩尔浓度为0.5～2mm。

6、作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与柠檬酸钠溶液的体积比为10：(0.5～2)，所述柠檬酸钠溶液的质量分数为0.5～2％。

7、作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与抗坏血酸溶液的体积比为10：(0.2～1)；所述抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.2m。

8、作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：(0.01～0.05)；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为5～20mm。

9、作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：0.04；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为10mm。

10、本发明还提供了一种肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

11、将金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液混合均匀，而后与肠炎沙门氏菌单克隆抗体ab2偶联，加入封闭剂封闭，离心，重悬，涂于结合垫上，得到固定有免疫标签的结合垫；

12、将样品垫、固定有免疫标签的结合垫、固定有t/c线抗体的nc膜、吸水纸与底板组装得到肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条；

13、所述金核银壳纳米颗粒溶液为上述所述的方法制备得到的金核银壳纳米颗粒溶液。

14、作为本发明的优选实施方案，所述金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液的体积比为1：(0.005～0.04)；所述碳酸钾溶液的摩尔浓度为0.05～0.2m。

15、作为本发明的优选实施方案，所述金核银壳纳米颗粒溶液与肠炎沙门氏菌单克隆抗体ab2的液固比为1ml：(1.9～15.2)mg。

16、作为本发明的优选实施方案，所述固定有t/c线抗体的nc膜的制备方法为：将肠炎沙门氏菌单克隆抗体ab1和羊抗鼠igg多克隆抗体用10mm的pb稀释至0.5～2mg/ml，在三维划膜仪上将肠炎沙门氏菌单克隆抗体ab1和羊抗鼠igg多克隆抗体分别固定于nc膜上作为t线和c线，得到固定有t/c线抗体的nc膜。

17、本发明的有益效果在于：(1)本发明将金与银结合起来制备的纳米颗粒，不仅能保留金的生物稳定性，还能获得银的sers特性，提高sers性能。在金纳米粒子表面连接拉曼信号分子后再包裹一层银壳形成金核-拉曼信号分子-银壳结构，具有较高的稳定性，不容易发生团聚，在纳米材料的尖端、夹缝、狭角等部位具有更多的热点(hot-spot)，有助于局域表面等离激元的共振，进而增强基底周围的电磁场，实现拉曼信号的显著提高。因此，在本研究制备的金核-拉曼信号分子-银壳(au@4-mba@ag)纳米材料中，银材料本身优良的sers加上金核-银壳中间的缝隙结构中存在的大量热点可显著增强纳米颗粒的sers性能，进而实现检测灵敏度的提高；(2)由本发明的金核银壳(au@4-mba@ag)纳米颗粒制备得到的试纸条，可在10min内完成对肠炎沙门氏菌的定性与定量检测，可视化最低检测限为1×105cfu/ml，通过拉曼信号测定的最低检测限为1×103cfu/ml。在1×103cfu/ml-1×107cfu/ml范围内，肠炎沙门氏菌浓度对数与t线拉曼信号强度的自然对数符合线性关系，线性方程为log(肠炎沙门氏菌浓度)＝1.737ln(拉曼信号强度+540.84)-9.965，r2为0.996。此外，该试纸对不同来源的肠炎沙门氏菌均能特异检出，但与鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌等其他沙门氏菌血清型和大肠杆菌、副溶血弧菌等其他常见病原无交叉反应，具有良好的特异性。同一批次的试纸条和不同批次的试纸条对相同样品的检测结果基本一致，对浓度为1×107cfu/ml和1×106cfu/ml的肠炎沙门氏菌检测的cv值为6.7％和7.1％，重复性良好，对粪便和蛋壳样品加标检测结果显示回收率在94.8％-104.7％之间，回收率良好。