草莓专用抗枯萎病生物有机肥的制备方法与流程

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥的制备方法。

背景技术：

化肥的大规模使用对过去30年我国农业生产的快速增长起到了重要作用。化肥大量使用在提高农业生产的同时，也对环境产生了严重的负面影响，并威胁到我国农业的可持续发展。化学肥料的不合理施用使得农作物品质降低，引起土壤板结、有机质下降、土壤及作物根系微生态结构被破坏，并导致土传作物病害泛滥。为了保证农产品质量安全及农业可持续性发展，研究新型有机肥料来取代或减少化肥的施用迫在眉睫。生物有机肥养分全面，既有多种无机元素，又有多种有机养分，还含有大量的微生物和酶，可以提高作物产量、改善作物品质和土壤微生态系统、减少和降低作物病虫害的发生。

草莓枯萎病是严重影响草莓产业经济效益与可持续发展的主要病害之一，以往使用化学杀菌剂控制草莓枯萎病，但化学杀菌剂的大面积使用易带来环境污染、生态失衡、药物残留、食品安全等问题，所以利用低成本、高效率、环境友好和无药物残留的生物学方法防控草莓枯萎病倍受关注。

技术实现要素：

本发明的目的在于通过建立静态好氧堆肥体系，实现农业废物的无害化处理和资源化利用，制备一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥，优化生物有机肥的生产工艺，降低生产成本。

为了达到上述目的，本发明提供了一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥的制备方法，以猪粪及玉米秸秆为堆料，接种由枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌及胶质芽孢杆菌组成的复合微生物发酵菌剂和地衣芽孢杆菌ABTNL-1号生防菌剂，发酵，制得具有抗草莓枯萎病功能的生物有机肥。

所述枯草芽孢杆菌ABTNL-2号保藏编号：CGMCC NO.10038，苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号保藏编号：CGMCC NO.10036，地衣芽孢杆菌ABTNL-1号保藏编号：CGMCC NO.10037；巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得，也可以通过自行分离得到，除特殊菌株情况外，普遍的这2种菌剂都适用于本发明。

优选方式下，上述草莓专用抗枯萎病生物有机肥的制备方法，具体步骤为：

S1、堆肥原材料的预处理：将猪粪与粒径≤1cm玉米秸秆按3～4.5:1～1.5的质量比混合均匀，控制C/N为20～25:1，晾晒2～3天，至含水率达50～60％，得到堆料，备用；

S2、复合微生物发酵菌剂和生防菌剂的制备：

将枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌ABTNL-1号分别单独进行发酵生产，至菌液浓度达到10⁸～10⁹CFU·ml^-1；

将发酵后的枯草芽孢杆菌ABTNL-2号菌液、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号菌液、巨大芽孢杆菌菌液及胶质芽孢杆菌菌液按体积百分比1～2:1～2：0.5～1:0.5～1混合，得到复合微生物发酵菌剂；

所述地衣芽孢杆菌ABTNL-1号菌液即为生防菌剂；

S3、静态好氧堆肥体系的建立及生物有机肥的制备：

将步骤S2制得的复合微生物发酵菌剂和生防菌剂，同时接种到步骤S1制得的堆料中，建立静态好氧堆肥体系，腐熟发酵20～30天，得到草莓专用抗枯萎病生物有机肥；

所述复合微生物发酵菌剂体积与所述堆料质量比为2.0～5.0:100(g/ml)；

所述生防菌剂体积与所述堆料质量比为2.0～5.0:100(g/ml)。

进一步优化，步骤S2所述发酵过程的培养基分别为：

复合微生物发酵菌剂中枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌及胶质芽孢杆菌的培养基成分为蛋白胨10.0g/L、牛肉浸出粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.4；

生防菌剂地衣芽孢杆菌ABTNL-1号的培养基成分为氯化钠10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉提取物5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.0。

进一步优化，步骤S3腐熟发酵的具体过程为：当堆料温度首次出现明显下降时进行翻堆，并补充水分至含水率为35～45％，堆料温度再一次升高，堆料温度再次明显下降时，再次翻堆，如此反复2～3次，直至堆料温度接近或稍高于室温、无异味，且经测定堆料发芽指数大于等于80％、含水率为30％、虫卵含量为0％时，即得到复合发酵产物。

堆料发芽指数大于80％时，表明堆肥已腐熟，堆料含水率约为30％；堆料作为生物有机肥前期产品，保存备用；本发明腐熟发酵20-30天即可。

本发明堆料温度下降≥5℃认为为明显下降；当翻堆后，堆料温度不再升高时，就无需再翻堆了。

本发明方法主要包括两个步骤：

一是复合微生物发酵菌剂和生防菌剂的应用，充分提高了发酵效率、缩短生物有机肥制备周期；同时提高了肥料的抗草莓枯萎病效果。

二是静态好氧堆肥体系的建立和生物有机肥的制备，将上述制备的复合微生物发酵菌剂和生防菌剂在堆肥体系建立初期同时接入，通过一步贯通的生产工艺完成发酵过程，从而制得具有抗草莓枯萎病的生物有机肥。

综上，与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、利用新鲜猪粪和玉米秸秆作为生产生物有机肥的原材料，可以同步实现农业废弃物的无害化处理和资源化利用，避免其处理不当对环境造成的二次污染。

2、本发明在堆肥初期同时接种自制的复合微生物发酵菌剂和生防菌剂，其中，复合微生物发酵菌剂能够加快静态好氧堆肥体系的腐熟进程、缩短生物有机肥的制备周期；而且地衣芽孢杆菌是一种具有广谱抑菌活性的细菌，具有较强的次生代谢产物产生能力，能产生多种抑菌物质，本发明加入生防菌所产生的次级代谢产物，可以有效对草莓枯萎病进行生物防治，避免了使用化学杀菌剂所带来的环境问题和食品安全问题。

3、本发明通过一步贯通堆肥发酵工艺制备生物有机肥，即在建堆初期同时接种复合微生物发酵菌剂和生防菌剂，相比二次发酵工艺，生产工艺更加简单，将大大降低生物有机肥的生产成本。

4、本发明制得的生物有机肥具有改良土壤、增进肥效、改善草莓根际微生态和草莓品质、增强草莓抗逆性等优点，对草莓种植产业的可持续发展提供有力的保障。

附图说明

图1是静态好氧堆肥体系温度变化图；

图2是对比例3生物有机肥对草莓枯萎病的生防实验结果

图3是本发明实施例2生物有机肥对草莓枯萎病的生防实验结果

保藏说明

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ABTNL-1，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.10037。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ABTNL-2，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.10038。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ABTNL-4，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.10036。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

下面结合具体实施例和对比例，进一步阐明本发明的具体效果。

实施例1

一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥，通过包括以下步骤的生产方法制得：

(1)堆肥原材料的预处理

将新鲜猪粪与粒径≤1cm玉米秸秆按3:1的质量比混合均匀，使其C/N为20，平摊在地面晾晒至含水率达50％备用(用手紧握一团堆料，在手指间没有液体流出，且松手后堆料呈团状不松散即可)。

(2)复合微生物发酵菌剂和生防菌剂的制备

将枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌ABTNL-1号分别单独利用发酵罐进行发酵生产，使菌液浓度达到10⁸～10⁹CFU·ml^-1，发酵后的枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌菌液按体积百分比2：2：1:1混合作为复合微生物发酵菌剂，地衣芽孢杆菌ABTNL-1号发酵菌液作为生防菌剂。

复合微生物发酵菌剂的制备所需培养基成分为蛋白胨10.0g/L、牛肉浸出粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.4；生防菌剂的制备所需培养基成分为氯化钠10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉提取物5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.0。

(3)静态好氧堆肥体系的建立及生物有机肥的制备

将(1)预处理的堆肥原料人工充分混匀，装入放有通气管的堆肥反应箱中(100cm×80cm×80cm)建立静态好氧堆肥体系，同时接种(2)所制备的液态菌剂，复合微生物发酵菌剂和生防菌剂分别按2％和5％(体积质量比)接种到静态好氧堆肥体系中，具体方法如下：在堆肥反应器中分层放置物料，并均匀喷洒液态菌剂后充分混合进行微生物好氧发酵，温度随之上升，达到并维持60～75℃的高温；当堆料温度首次出现明显下降时进行翻堆，并补充一定的水分，堆料温度再一次升高，同样，温度明显下降时，再次翻堆，如此反复2-3次，等到堆料温度接近或稍高于室温且无异味，测定发芽指数大于80％、含水率约为30％、虫卵含量为0％时，表明生物有机肥前期产品已制备成功，将堆料进行粉碎、过筛，制成粉料，可根据商业需要进行造粒等，制得一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥。

经检测，本实施例得到的成品草莓专用抗枯萎生物有机肥的成分指标如表1所示：

表1

实施例2

步骤1：堆肥原材料的预处理

将新鲜猪粪与粒径≤1cm玉米秸秆按4.5:1.5的质量比混合均匀，使其C/N在25，平摊在地面晾晒至含水率达60％备用。

步骤2：复合微生物发酵菌剂和生防菌剂的制备

将枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌ABTNL-1号分别单独利用发酵罐进行发酵生产，使菌液浓度达到10⁸～10⁹CFU·ml-1，发酵后的枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌菌液按体积百分比1：1：0.5:0.5混合作为复合微生物发酵菌剂，地衣芽孢杆菌ABTNL-1号发酵菌液作为生防菌剂。

复合微生物发酵菌剂的制备所需培养基成分为蛋白胨10.0g/L、牛肉浸出粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.4；生防菌剂的制备所需培养基成分为氯化钠10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉提取物5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.0。

步骤3：静态好氧堆肥体系的建立和生物有机肥的制备

将预处理过的堆肥原材料加入到带有搅拌功能的固态发酵仓中，通过机械搅拌使其充分混匀，在机械搅拌混匀的同时分别往固态发酵仓中接种5％(体积质量比)复合微生物发酵菌剂和4％(体积质量比)生防菌剂，进行半封闭好氧发酵。

检测堆肥温度，检测结果如图1所示，堆肥第3d温度即达到55℃以上，并在第5d达到最高的61.34℃，温度55℃以上持续11d，达到了我国《粪便无害化卫生标准(GB7959-87)》的标准(55℃以上持续3d以上)，23d左右堆肥完全腐熟。测定发芽指数大于80％、含水率约为30％时、虫卵含量为0％时，表明生物有机肥前期产品已制备成功，将堆料进行粉碎、过筛，制成粉料，可根据商业需要进行造粒等，制得一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥。

生产得到的成品草莓专用抗枯萎病生物有机肥的成分指标如表2所示：

表2

对比例1(实施例2缺少枯草芽孢杆菌ABTNL-2)：

步骤1：堆肥原材料的预处理

将新鲜猪粪与粒径≤1cm玉米秸秆按4.5:1.5的质量比混合均匀，使其C/N在25之间，平摊在地面晾晒至含水率达60％备用。

步骤2：复合微生物发酵菌剂和生防菌剂的制备

将苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌ABTNL-1号分别单独利用发酵罐进行发酵生产，使菌液浓度达到10⁸～10⁹CFU·ml-1，发酵后的苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌菌液按体积百分比1：0.5:0.5混合作为复合微生物发酵菌剂，地衣芽孢杆菌ABTNL-1号发酵菌液作为生防菌剂。

复合微生物发酵菌剂的制备所需培养基成分为蛋白胨10.0g/L、牛肉浸出粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.4；生防菌剂的制备所需培养基成分为氯化钠10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉提取物5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.0。

步骤3：静态好氧堆肥体系的建立和生物有机肥的制备

将预处理过的堆肥原材料加入到带有搅拌功能的固态发酵仓中，通过机械搅拌使其充分混匀，在机械搅拌混匀的同时分别往固态发酵仓中接种5％(体积质量比)复合微生物发酵菌剂和4％(体积质量比)生防菌剂，进行半封闭好氧发酵。

堆肥第5d温度即达到55℃以上，并在第6d达到最高的60.98℃，温度55℃以上持续7d，达到了我国《粪便无害化卫生标准(GB7959-87)》的标准(55℃以上持续3d以上)，27d左右堆肥完全腐熟。测定发芽指数大于80％、含水率约为30％、虫卵含量为0％时，表明生物有机肥前期产品已制备成功，将堆料进行粉碎、过筛，制成粉料，可根据商业需要进行造粒等，制得一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥。

总结：通过上述对比可知：缺少枯草芽孢杆菌ABTNL-2号菌的复合菌剂使堆肥的高温持续时间缩短了4d，腐熟时间延长了4d，说明其在复合菌剂中发挥重要作用。

对比例2(实施例2缺少苏云金芽孢杆菌ABTNL-4)：

步骤1：堆肥原材料的预处理

将新鲜猪粪与粒径≤1cm玉米秸秆按4.5:1.5的质量比混合均匀，使其C/N在25，平摊在地面晾晒至含水率达60％备用。

步骤2：复合微生物发酵菌剂和生防菌剂的制备

将枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌ABTNL-1号分别单独利用发酵罐进行发酵生产，使菌液浓度达到10⁸～10⁹CFU·ml-1，发酵后的枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌菌液按体积百分比1：0.5:0.5混合作为复合微生物发酵菌剂，地衣芽孢杆菌ABTNL-1号发酵菌液作为生防菌剂。

复合微生物发酵菌剂的制备所需培养基成分为蛋白胨10.0g/L、牛肉浸出粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.4；生防菌剂的制备所需培养基成分为氯化钠10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉提取物5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.0。

步骤3：静态好氧堆肥体系的建立和生物有机肥的制备

将预处理过的堆肥原材料加入到带有搅拌功能的固态发酵仓中，通过机械搅拌使其充分混匀，在机械搅拌混匀的同时分别往固态发酵仓中接种5％(体积质量比)复合微生物发酵菌剂和4％(体积质量比)生防菌剂，进行半封闭好氧发酵。

堆肥第4d温度即达到55℃以上，并在第7d达到最高的60.48℃，温度55℃以上持续6d，达到了我国《粪便无害化卫生标准(GB7959-87)》的标准(55℃以上持续3d以上)，26d左右堆肥完全腐熟。测定发芽指数大于80％、含水率约为30％、虫卵含量为0％时，表明生物有机肥前期产品已制备成功，将堆料进行粉碎、过筛，制成粉料，可根据商业需要进行造粒等，制得一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥。

总结：通过上述对比可知：缺少苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号的复合菌剂使堆肥的高温持续时间缩短了5d，腐熟时间延长了3d，说明其在复合菌剂中发挥重要作用。

对比例3(实施例2其他地衣芽孢杆菌代替地衣芽孢杆菌ABTNL-1)：

步骤1：堆肥原材料的预处理

将新鲜猪粪与粒径≤1cm玉米秸秆按4.5:1.5的质量比混合均匀，使其C/N在25，平摊在地面晾晒至含水率达60％备用。

步骤2：复合微生物发酵菌剂和生防菌剂的制备

将枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和普通地衣芽孢杆菌分别单独利用发酵罐进行发酵生产，使菌液浓度达到10⁸～10⁹CFU·ml-1，发酵后的枯草芽孢杆菌ABTNL-2号、苏云金芽孢杆菌ABTNL-4号、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌菌液按体积百分比1：1：0.5:0.5混合作为复合微生物发酵菌剂，普通地衣芽孢杆菌发酵菌液作为生防菌剂。

复合微生物发酵菌剂的制备所需培养基成分为蛋白胨10.0g/L、牛肉浸出粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.4；生防菌剂的制备所需培养基成分为氯化钠10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉提取物5.0g/L，用5mol/L NaOH调pH至7.0。

步骤3：静态好氧堆肥体系的建立和生物有机肥的制备

将预处理过的堆肥原材料加入到带有搅拌功能的固态发酵仓中，通过机械搅拌使其充分混匀，在机械搅拌混匀的同时分别往固态发酵仓中接种5％(体积质量比)复合微生物发酵菌剂和4％(体积质量比)生防菌剂，进行半封闭好氧发酵。

堆肥第3d温度即达到55℃以上，并在第5d达到最高的62.04℃，温度55℃以上持续10d，达到了我国《粪便无害化卫生标准(GB7959-87)》的标准(55℃以上持续3d以上)，23d左右堆肥完全腐熟。测定发芽指数大于80％、含水率约为30％时、虫卵含量为0％时，表明生物有机肥前期产品已制备成功，将堆料进行粉碎、过筛，制成粉料，可根据商业需要进行造粒等，制得一种草莓专用抗枯萎病生物有机肥。

应用例1

将对比例3制得的生物有机肥与本发明实施例2含有相同量的地衣芽孢杆菌ABTNL-1制得的生物有机肥分别均匀拌入接有草莓枯萎病菌的病土中，盆栽实验为期2个月，观察发病率和生物防治效果如图2、图3所示，发现施用本发明有机肥的草莓没有呈现发病症状，而施用含有对比例3普通地衣芽孢杆菌的生物有机肥的草莓，地上部分表现为心叶变黄绿、卷曲呈船形、两边不对称，叶片无光泽，叶柄及根部维管束变褐色或黑褐色，地下根系黑褐色，不长新根，呈现草莓枯萎病症状。

对比例3普通地衣芽孢杆菌通过自行提取获得，通过多次提取，进行多次试验，效果均类似，与本发明使用的地衣芽孢杆菌ABTNL-1，在效果上有显著区别。

通过对生防菌剂中的地衣芽孢杆菌ABTNL-1号体内抗生素合成基因进行检测发现，该菌株有合成Fengycin、Iturin或Bacillomycin的潜力，而Fengycin、Iturin和Bacillomycin均是强烈的真菌抑制剂，所以地衣芽孢杆菌ABTNL-1号可以有效的对草莓枯萎病进行生物防治。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。