一种基于配位功能化的抑菌碳点及其制备方法与应用

本发明属于新型抗菌剂，具体涉及一种金属配位功能化抑菌碳点、该抑菌碳点的制备方法以及该碳点在水产品保鲜中的应用，尤其是三文鱼鲜肉保鲜中的应用。

背景技术：

1、铁是几乎所有细菌生长发育过程中不可缺少的元素。铁元素参与细菌诸多的生物过程，如三羧酸循环、电子传递链、氧化磷酸化、固氮和芳香化合物的生物合成。同时，它还参与卟啉、毒素、抗生素、细胞色素、色素和嗜铁素等代谢产物的合成。过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶通过消除有害自由基来维持细胞，它们也含有铁。此外，铁阳离子作为多种酶的辅助因子，直接参与并影响细胞的组成。在缺铁的情况下，dna和/或rna合成减少，细菌生长和孢子发生也被抑制，导致细菌的形态学变化。

2、虽然地壳富含铁，但由于铁(iii)的低溶解度，铁的生物用途在有氧环境中是不可能实现的。因此，细菌已经进化出用于从活生物体(植物和动物)、淡水、海水和土壤等中去除和吸收铁的方法。在铁限制条件下，细菌存活和铁摄取的主要方法之一是产生用于铁吸收的低分子量的铁螯合分子，即嗜铁素(siderophore)。在铁稀有的情况下由细菌产生的嗜铁素对三价铁离子具有比亚铁离子更高的亲和力，因此有利于细菌从铁稀环境中摄取铁元素。倘若细菌的嗜铁素无法从自身环境周围吸收到三价铁离子，那么大部分细菌将丧失生命。

3、碳点(cds)作为一种新型碳基纳米材料，因具有多种物理化学特性和良好的生物相容性、独特的光学特性、极低的成本、较佳的生态友好性、丰富的官能团、高稳定性和电子迁移率等优点，近些年备受材料、光学、生物、医学、食品安全等多个领域的研究者关注。在食品安全领域，尤其是抑菌研究方面，碳点是制备碳点基纳米酶的重要原料。碳点或碳点基纳米酶可通过自身具备特性促进活性氧产生，对细菌细胞壁、细胞膜造成破坏，或者抑制细菌dna和rna转录等破坏细胞结构的方式实现对细菌生长的抑制乃至杀灭。这种方式的抑菌方法针对的是菌体本身，随着使用时间的延长，菌体容易产生耐药性。

4、例如，现有技术cn 114259005a公开了一种具有抑菌性能碳点的制备方法。该方法是将葡萄糖、生物胺和氯化钠三种原料按照一定质量比配比溶解后，再通过水热反应处理，最后经过离心分离、纯化、干燥等步骤后最终获得产品。又如，现有技术cn 114304249a公开了一种基于洋葱源的抑菌碳点，以及该碳点的制备方法和在水产品保鲜中的应用。该抑菌碳点是将洋葱与水按比例混合后经过水热反应，再经醇沉，纯化和干燥等步骤获得。虽然其制备原料廉价且容易获得，制备过程也较为简单。但其对假单胞菌的最小抑菌浓度(mic值)仅为2mg/ml。

5、水产品因富含的蛋白质以及脂肪酸等营养物质而被人们认为是优质的营养物质来源，然而正因为其富含的营养物质以及大量的水分，导致新鲜水产品比其他食品更容易腐败变质。经研究，在水产品的腐败变质中，一种或几种微生物会表现出以较低的数量存在,但随着腐败过程的不断加深，繁殖速率会变得更快且致腐能力更强，逐渐在腐败终期占领主导地位，成为水产品的优势或特定腐败菌(specific spoilage organisms,ssos)。其中假单胞菌(pseudomonas spp.)、不动杆菌属(acinetobacter spp.)、腐败希瓦氏菌(shewanella putrefaciens)等嗜冷性微生物是冷藏条件下水产品的特定腐败菌。莓实假单胞菌具有较强的耐冷能力，能够在低温下维持较高的生长速率。这使得莓实假单胞菌成为低温储藏食品中的优势微生物区系，主要存在于低温冷藏下的肉及肉类产品、乳及乳制品以及水产品中，并且具有成为以上食品中常见特定腐败菌的能力。在以鱼肉为代表的冷鲜水产品中，三文鱼、金枪鱼和虹鳟鱼等水产食品的主要特定腐败菌是莓实假单胞菌。目前针对莓实假单胞菌的抑菌方式还不够普遍，比如天然抗菌剂、化学合成的抗菌膜以及气调贮藏等，且抑菌效果不够突出和明显。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、本发明旨在解决现有技术或相关技术中存在的如下技术问题之一：

3、为解决现有抑菌制剂主要针对菌体本身，容易造成细菌耐药性，以及抑菌碳点抑菌效果不够理想的问题，本发明通过采用不同于现有抑菌碳点抑菌原理的技术思路，制备一种效果更佳的抑菌碳点，并将其应用到水产品保鲜中。

4、(二)技术方案

5、为解决上述技术问题，本发明提供一种基于配位功能化的抑菌碳点的制备方法以及在水产品保鲜过程中的应用，所采取的具体技术方案如下：

6、一种基于配位功能化的抑菌碳点tm-cds，其特征在于，是以茶氨酸和苹果酸为原料，通过微波加热法制备而成，所述抑菌碳点tm-cds对多种水产优势腐败菌的生长产生抑制作用。

7、优选地，所述水产优势腐败菌包括莓实假单胞菌(pseudomonas fragi，p.fragi)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens，p.fluorescens)、温和气单胞菌(aeromonassobria，a.sobria)、蜂房哈夫尼亚菌(hafinia alvei，h.alvei)、沙雷气单胞菌(serratiamarcescens，s.marcescens)。

8、更优选地，对莓实假单胞菌、荧光假单胞菌、温和气单胞菌、蜂房哈夫尼亚菌、沙雷气单胞菌莓实假单胞菌的最低抑菌浓度分别不高于0.25mg/ml、0.50mg/ml、0.25mg/ml、0.50mg/ml、0.50mg/ml。

9、优选地，所述抑菌碳点tm-cds对三价铁离子的螯合吸附能力不低于150mg/g，通过与细菌所分泌的嗜铁素竞争性吸附三价铁离子抑制细菌生长繁殖。

10、优选地，所述苹果酸为d-苹果酸、l-苹果酸及dl-苹果酸的至少一种；所述的茶氨酸为l-茶氨酸。

11、本发明所提供的上述抑菌碳点tm-cds的制备方法为：首先配置茶氨酸溶液；再向配制好的茶氨酸溶液中加入苹果酸形成混合溶液；将混合溶液混匀后进行微波处理，微波处理结束后冷却获得粘性液体；将所得粘性液体溶解后分离冻干，即获得抑菌碳点tm-cds。

12、优选地，所述方法的步骤如下：

13、1)将茶氨酸溶解到去离子水中，配制成浓度为0.8g/10ml-1.2g/10ml的茶氨酸溶液；

14、2)将苹果酸溶解到步骤(1)所获得的茶氨酸溶液中，并将所得的混合溶液混合均匀；所述混合溶液，其中苹果酸的浓度为0.8g/10ml；

15、3)将步骤(2)所得的溶液进行微波处理，微波处理后冷却至室温获得粘性液体；

16、4)向步骤(3)所获得的粘性液体中加入去离子水，充分溶解后过滤，再对滤液进行透析后，冻干，即获得抑菌碳点tm-cds。

17、优选地，步骤(3)所述微波处理：微波功率为：300w-800w；处理时间为2min～8min。

18、优选地，步骤(4)过滤采用0.22μm的水系过滤器过滤；透析采用200da-500da的透析袋，透析处理4h。

19、优选地，上述任一抑菌碳点tm-cds在水产品保鲜中的应用。

20、更优选地，上述应用是指在冷鲜鱼肉保鲜中的应用。

21、更优选地，所述鱼肉为三文鱼、金枪鱼、虹鳟鱼。

22、优选地，上述应用方法为：在无菌条件下将鱼肉分割成块，在无菌条件下晾干表面，将鱼块进入到碳点tm-cds溶液中，浸透后将其晾干，放置到无菌保鲜盒中贮藏。其中，抑菌碳点tm-cds溶液浓度为0.50mg/ml。

23、(三)有益效果

24、与现有技术相比，本发明获得的有益效果为：

25、一、本发明采用了不用于现有针对细菌菌体本身的抑菌原理，为新型抑菌制剂的制备提供了一种新思路。根据细菌在造成污染过程中对嗜铁素的依赖，制备一种对三价铁离子的吸附能力更强的碳点，形成对细菌生长过程中对三价铁离子的竞争性抑制，从而达到抑制细菌生长的目的。所采用的抑菌原理与现有针对细菌菌体的抑菌原来完全不同，不会造成细菌的耐药性。具体地，本发明以茶氨酸和苹果酸为原料微波加热合成碳点tm-cds，该碳点tm-cds具有良好的三价铁离子螯合能力，经过langmuir等温线模型预测出最大三价铁离子吸附量为154.56mg/g，并且根据吸附动力学模型证明该碳点螯合三价铁离子能力及速率比莓实假单胞菌分泌的嗜铁素更强，进而对其生长繁殖产生抑制作用。同时，经实际测定该碳点tm-cds对莓实假单胞菌的最小抑菌浓度为0.25mg/ml，最小抑菌浓度较现有抑菌碳点提高了一个数量级。

26、二、通过将小鼠胚胎成骨细胞以及大鼠血细胞与碳点tm-cds共培养后，未发现小鼠胚胎成骨细胞的生长受到抑制以及大鼠红细胞受到破坏，说明该碳点具有良好的生物相容性。

27、三、通过对比碳点tm-cds、碳点tm-cds-嗜铁素混合物以及嗜铁素三者的吸附三价铁离子的动力学模型，比较三者吸附三价铁离子的吸附过程可以证明碳点tm-cds比嗜铁素螯合铁能力更强且比嗜铁素更优先地结合三价铁离子。

28、四、本发明所制备的碳点tm-cds因其具有优异的广谱抑菌性能，将其应用到水产品保鲜中，实验结果表明碳点tm-cds可有效延长三文鱼的货架期3-4天，并且优于传统食品保鲜剂—脱氢乙酸钠(1-2天)。此外，该抑菌碳点tm-cds具有良好的生物兼容性，且抑菌效果良好，在水产品保鲜领域具有良好的应用前景。