非豆科植物中的生物固氮的制作方法

专利名称:非豆科植物中的生物固氮的制作方法
1.发明领域本发明公开了一种根瘤菌转化株，它们能在非豆科植物中进行侵入、形成根瘤和固氮，栽培该非豆科植物的种子预先用对此根瘤菌转化株具有专一性的物质进行过包膜。这些有根瘤的非豆科植物可以在不使用氮肥的情况下生长;收割后植物的剩余部分和秸杆比它们未形成根瘤的对比植株具有更高的蛋白含量、干物质含量和氮含量。
本发明通过一些具体的实例来说明。在这些实例中，用根瘤菌的转导结合体使禾本科植物(Poaceae)小麦、大麦、高梁、水稻和芸香属(Brassicas)中的油菜(十字花科Cruciferae)形成根瘤。在实例中还说明了能在桉属植物(桃金娘科Myrtaceae)中固氮的根瘤菌转导结合体。
2.发明背景植物代谢的一个基本特点是利用硝酸盐和其它无机氮化合物合成氨基酸、蛋白质、叶绿素、维生素、激素和生物碱等这样一些对于植物的生长发育必不可少的有机化合物。虽然植物从土壤中吸收硝酸盐和其它的氮化合物，但是，氮的基本来源仍然是大气中游离的二氮(N2)，而游离的二氮必须被固定和转化成可被植物利用的形式。
2.1.生物固氮生物的二氮固定作用(通常称为生物固氮作用)是一个复杂的过程，其中包括使游离氮通过一系列的中间产物还原成氨，这是通过固氮微生物来实现的，它们中有些是与某些维管植物共生的。最重要的共生固氮菌是根瘤菌属，它有许多种，每一种都与豆科植物的一个或几个近缘种共生(例如豌豆、菜豆、三叶草等)，其结果是与其它不能固氮的植物不同，豆科植物生长时不需要氮肥。事实上，豆科植物可以丰富土壤中的氮含量，鉴于许多豆科植物具有这样的经济价值，已经有了用于为豆科种子接种的细菌培养物。此外，含有可生存的固氮菌的豆科植物种子的包膜已有过公开(US3，499，748和4，149，869)。
共生固氮包括以下过程一种专一于一种具体的豆科植物宿主的根瘤菌侵染该豆科植物宿主的根，然后在根上形成根瘤，根瘤菌以称为类菌体的内共生状态生活在根中，这种类菌体与该豆科植物宿主密切配合起着固氮这样的独特作用;这种类菌体的特性非常象一个细胞器。有趣的是，根瘤菌在植物体外一般不固氮。对豆科植物中共生固氮各方面的综述参见《植物基因研究-涉及微生物与植物相互作用的基因》的第3、4和5章(D·P·S·Verma，T·H·Hohn，SpringerVerlag，N·Y·1984)。
侵染、形成根瘤和固氮都包含了根瘤菌及其专一的豆科植物宿主之间复杂的相互作用。为了发生最初的侵染，根瘤菌和豆科植物必须彼此“识别”，这种非常专一的识别据信是涉及到豆科植物宿主的外源凝集素(一种在根毛中发现的糖蛋白)与细菌表面的多糖之间的相互作用;这种相互作用可以认为是一种很专一的“锁和钥匙”类型的机制。已把这种专一性比拟成抗体-抗原的相互作用。没有这个相互作用，侵染就不会发生。在这种专一的“识别”后，根瘤菌就附着到特定的豆科植物宿主的根上，侵染是通过宿主对入侵根瘤菌的反应来控制的一种非致病形式进行的。通常，根瘤菌通过根毛进入豆科植物，并且细菌侵染是以由宿主植物形成的称为侵入线的管状结构为媒介的，该侵入线深入到根部皮层的内部细胞。根瘤菌从侵入线中释放，但关闭在宿主形成的称为类菌体周膜的膜状包裹体中;因此，这些类菌体被限制在细胞外的间隔里。破坏此过程的这种微妙的顺序会导致对宿主的致病性侵入。
在宿主豆科植物被根瘤菌侵入之后，只在对该过程复杂的相互作用的反应中才会发生随后的根瘤形成。在该过程中，豆科植物影响了根瘤菌基因的表达，而根瘤菌反过来影响了形成根瘤所要求的豆科植物基因的活性。根瘤组织中的细胞在植物的特殊结构区域中高度地组织化，在把细菌排斥在表皮和分生组织区之外的类菌体周膜中照常有细菌。在为了对类菌体输入氧和氮及为宿主植物输入氨必须解决的扩散问题上，根瘤的组织和形态是具有生化意义的。有效的根瘤(即实际上固氮的根瘤)的一个区别特征是存在豆血红蛋白，一种看来在根瘤呼吸中起作用的氧结合蛋白(也就是这种蛋白质的高浓度促使氧扩散到类菌体区域)。这种蛋白也与保护固氮酶(固氮过程中一种必不可少的酶)不因过量的氧而中毒有关。豆血红蛋白显然是一种真正的共生产物-其球蛋白由植物基因编码，而其血质合成主要依靠细菌。
最后，根瘤中发生的共生固氮是一种协同作用，类菌体具有固氮机制而豆科植物同化产生的氨使之成为有机物形式，然后作为整株植物及这些类菌体的养分而被利用;豆科植物提供了一个使类菌体能够固氮的合适环境和能量来源。在整个过程中会发生很多问题如果宿主植物的细菌被“错配合”，侵入就不会成功，因而形成根瘤的整个过程和共生固氮就不会发生;此外，成功地形成了根瘤也不意味着固氮必定会发生，因为得到的根瘤可能是有缺陷的。
2.1.1.在共生中涉及的豆科植物基因宿主基因产品的两个主类，豆血红蛋白和根瘤素在共生固氮期间被特异地诱导。虽然根瘤中的豆血红蛋白的结构和功能是比较清楚的，但对根瘤素了解不多。但有趣的是，最近有一篇文章报道了豆血红蛋白植物的DNA序列可在非豆科植物中检测到。因此表明这些氧结合蛋白的基因的存在领域比以前认为的更为广泛(Hattori和Johnson，1985，PlantMol·Biol·4∶285-292)。
2.1.2.共生中涉及的根瘤菌基因几年前就发现，形成根瘤所需的根瘤基因是处在其本身也携带固氮基因的一种大的质粒中(称为共生质粒)。自那以后，已发现很多根瘤菌可以通过把具有不同宿主专一性的另一个根瘤菌属的共生质粒转移到该根瘤菌中来引导根瘤菌识别一个新的豆科植物共生体。没有迹象表明从一个根瘤菌得到的根瘤菌共生质粒转移到另一个根瘤菌可以使宿主的范围扩大到非豆科植物。有趣的是，将根瘤菌的共生质粒引入到根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(一种导致称为冠瘿瘤的植物肿块生长的细菌)中会赋予土壤杆菌在豆科植物中产生根瘤的能力;可是，这些小瘤是有缺陷的，它们不能固氮(Hooykaas，《细菌-植物相互作用的分子遗传学》A.Puhler，eds，SpringerVerlag，NY·1983，229-239)。
这几年中，各种迹象表明，根瘤菌在豆科植物中形成根瘤的效果能通过接触某些植物分泌物而增加，也许这种接触刺激了形成根瘤的基因的表达，所有的豆科植物分泌物都产生这种效果，但是来自各非豆科植物的分泌物则不产生这种效果。
2.1.3生物固氮和非豆科植物一种称为法兰克氏菌(Frankia)的非根瘤菌属的细菌能与一些如赤杨属(Alnus)(桤木)、木麻黄属(Casuarina)(食火鸡树)、蓟木属(Ceanothus)、胡秃子属(Eleagnus)、杨梅属(Myrica)(番樱桃)和吐根属(Psychotria)、(一种热带木本植物)等维管非豆科植物共生。一篇基于在试管内联合烟草细胞培养系和根瘤菌的数据的报道指出，一些非豆科植物可以提供能被根瘤菌利用的因子(Gibson等，1976，Planta128∶233-239);但是，没有指出和观察到专一的识别关系、共生关系或专一的相互作用。事实上在豆科种类之外，唯一知道的在非豆科植物种子植物和根瘤菌之间稳定共生的例子是Parasp-onia。它是一种热带大马来亚科(Malayan)(榆树)，发现在澳大利亚被分离的天然存在的根瘤菌种在Parasponia中具有形成根瘤和固氮的作用(Trinick，1980，NewPhytol·85∶37-45和86∶17-26;Trinick，1981，《固氮作用的现代观点》Gibson等编，ElsevierPress，p480;Trinick等人，1976，Arch·Microbiol·108∶159-166;并参见Bender等人，1985，植物科学，38∶138-140)。
3.发明的概要本发明描述了可以在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化株，更具体地说，本发明的根瘤菌转化株可以(a)侵入到用一种专一于该根瘤菌转化株的蛋白质混合物包膜种子生长得到的非豆科植物的根;(b)使这些非豆科植物的根形成根瘤，以及(c)在这些根瘤中固氮，因而不需要使用氮肥来加速这些非豆科植物的生长发育。还描述了用于鉴别各种根瘤菌和本发明的转化株的营养培养基。
还描述了包膜的非豆科植物种子，这些种子部份地可以通过本发明的根瘤菌转化株在非豆科植物中建立共生固氮，这种种子的包膜物质包括豆科植物提取物、豆科提取物的层析组分、专一于该根瘤菌转化株的结晶或纯化蛋白，该种子的包膜物质也可以包含根瘤菌转化株本身以作为其中的一个组份。
还描述了生产根瘤菌转化株、非豆科植物种子包膜和在根瘤菌转化株和非豆科植物之间建立共生的方法。
3.1.定义在本文中所使用的术语“根瘤菌转化株”被定义为一种含有插入DNA的根瘤菌，该DNA可以通过若干方法中的任一种而产生，包括但不限于转化(即用质粒DNA感染)、转染(即用游离DNA、噬菌体DNA或病毒DNA感染)或结合(即从一种细菌得到的一个复制质粒转移到另一种细菌上);由结合得到的细菌转化株是本发明转化株的一个子集，并可以专门称之为转导结合体。
在此所使用的术语“亲代根瘤菌”被定义为可结合产生本发明根瘤菌转导结合体的那些亲代种，以及这样一些根瘤菌种，从它们中可分离出质粒或DNA序列并且可用来转化根瘤菌从而产生本发明的根瘤菌转化株。
4.图1是表示在播种后各个时期收割的小麦作物的干物质量(A)和氮含量(B)的曲线图，三组小麦是代表由根瘤转化株形成根瘤的小麦(+R-N)，用氮肥施肥但不用根瘤菌转导结合体处理的小麦(-R+N)，及既不用根瘤菌的转导结合体形成根瘤又未用氮肥处理的小麦(-R-N)。
图2是表示播种后各个时期收割的大麦作物的干物质量(A)和氮含量(B)的曲线图。三组大麦分别代表由根瘤菌的转导结合体形成根瘤的大麦(+R-N);用氮肥但未用根瘤菌的转导结合体处理过的大麦，以及既不用根瘤菌的转导结合体形成根瘤又未用氮肥处理的大麦(-R-N)。
5.本发明的详细描述本发明涉及在非豆科植物中形成根瘤和固氮的根瘤菌转化株。这种形成根瘤的非豆科植物可以在没有氮肥的情况下生长，并且与施用氮肥而不形成根瘤的对比株相比具有相同或者更高的蛋白含量、干物质量和氮含量。在形成根瘤的非豆科植物收割后剩下的秸杆中也含有较高的蛋白质。
更具体地说，本发明的根瘤菌转化株具有能使从专一于该转化株的材料包膜的种子生长出来的非豆科植物形成根瘤的能力。本发明涉及这些根瘤菌转化株，生产这些根瘤菌转化株的方法，用于非豆科种子包膜的物质，包膜种子本身，用根瘤菌转化株使非豆科植物形成根瘤的方法以及产生具有高蛋白含量的形成根瘤的非豆科植物。
为了更清楚地叙述起见，本发明按下列顺序进行讨论(a)根瘤菌转化株;(b)非豆科植物的包膜物质;(c)在非豆科植物中实现共生固氮以及(d)形成根瘤的非豆科植物。
5.1根瘤菌转化株本发明根瘤菌转化株的生产和鉴定是以下述最初的发现为基础的，即各种不同的根瘤菌菌种当它在其豆科宿主之外的营养介质中生长时产生一种具有特征颜色的菌落，只要这种营养介质除了含有维持细菌生长必需的养分外，还含有从与该根瘤菌种的专一配对的豆科植物宿主中得到的未变性的提取物。菌落的颜色可作为鉴定特定的根瘤菌种的手段。事实上，不同种的根瘤菌可以在一个含有专一于每个菌种的各个豆科植物宿主的未变性提取物的混合物的营养介质上培养，各个菌种将形成具有其特征颜色的菌落。
本发明还以另外的发现为基础，即这些能够侵染非豆科植物而形成根瘤并固氮的根瘤菌转化株在含有该转移株的亲代根瘤菌的豆科宿主共生体提取物的营养介质中形成雪白色菌落;而那些可以从该非豆科的根瘤中分离并在上述还含有该非豆科宿主提取物的介质中培养的转化株类菌体会形成灰白色菌落。因此，这种营养介质提供了一种比较简单的鉴定本发明转化株的手段。这种营养介质在下一小节中给予描述。
5.1.1.用于鉴别根瘤菌转化株的营养介质这种营养介质应含有根瘤菌生长所必需的营养成分，包括但不限于任何一种公知的碳源、氮源和盐类以及B类维生素和可以以单独的氨基酸、三肽或寡肽等形式存在的基本氨基酸如L-丙氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸等。豆科植物提取物成分对于根瘤菌种的鉴定是有用的，而不是作为根瘤菌的营养所必需的，也就是说，如果在一种不含有豆科宿主提取物或含有变性的豆科宿主提取物(例如在加入豆科植物提取物后对该介质高压灭菌使该提取物变性)的营养介质中培养一种根瘤菌，则仍会形成菌落，但是每个根瘤菌种的菌落在颜色上各不相同。下面的表Ⅰ列入了各个根瘤菌种形成的特征菌落的颜色，它们是在含有与划线接种在平板上的各个菌种的豆科植物宿主共生体提取物的营养介质上培养的。应该指出，本发明这些例子中所用的介质在温度32℃以上进行培养时，在介质上生长的一切根瘤菌落都形成红色菌落;这是一种可逆的颜色变化，因为当温度降低时，例如到18°-30℃之间的某个温度时每个菌落都将变回其特征颜色。此外该营养介质可以通过加入半胱氨酸和苯丙氨酸加以改变，以产生具有对这些菌种特定颜色的不同色调的菌落。
表Ⅰ在含有专一配对豆科宿主提取物的营养介质中培养的不同根瘤菌种的菌落颜色＊根瘤菌豆科植物宿主共生体菌落颜色豇豆根瘤菌豇豆属(花生，含羞草属Mimosa，棕灰色(R·Cowpea)(Vigna)金合欢属Acacia，银合欢属Leucaena)R·japohicum大豆属(黄豆)桔红色(Glycin)豆科根瘤菌山黧豆属(豌豆)金黄色(R·leguminosarum)(Lathyrus)羽扇豆根瘤菌羽扇豆属(白羽扇豆)淡黄色(R·lupini)(Lupinus)草木犀根瘤菌草木犀属(甜三叶草)棕黄色(R·meliloti)(Melilotus)菜豆根瘤菌菜豆属(菜豆)深棕色(R·Phaseoli)(Phaseolus)三叶草根瘤菌三叶草属(三叶草)淡棕色(R·trifoli)(Trifolium)
＊在32℃以下的温度(即18℃-30℃之间)，在第6.1节中要详述的营养介质中培养的菌落。
营养介质中的豆科植物提取物可以从豆科宿主植物的任何部分产生，包括但不限于苗、茎、根或种子;幼苗的提取物似乎产生最快的颜色反应。豆科植物提取物可以如下制备，先把植物部分粉碎成细颗粒，将这些粉碎物在含有pH约7.2的缓冲液的乙醇中匀浆，通过离心使不溶物质沉淀，上清液可用蒸馏水透析，直到再次离心时很清彻为止。为了使植物物质的分解降至最低，整个过程在4℃下进行。
可以按照Allen等人改进的方法(Allen等人，1973，Biochem.J.131∶155-162;Allen等人，1975，FEBSLetters50(3)∶362-364;Gordon等，1972，FEBSLetters24(2)∶193-196;Peomans等人，1982，Planta.156∶568-572;Trowbridge，1974，J.Biol.Chem.249∶6004-6012)用层析法分离这种豆科植物提取物。简要地说，用一个半乳糖衍生的CH-琼脂糖凝胶(Sepharose)4B(瑞典Pharmacia公司)和DEAE-52(Whatman公司)柱对该提取物如下述进行层析分离(a)首先将提取物加到半乳糖衍生的CH-Sepharose4B柱上，去除不结合的物质，并通过用缓冲液洗脱进行收集，按5ml组分收集，并用分光光度法测定280nm波长处的光吸收;继续洗脱直到洗脱液中测不到吸收值为止。合并在280nm处显示出吸收值的组分留作在DEAE-52上进行层析。那些与半乳糖衍生的Sepharose4B柱床结合的物质通过在柱上加入4%的葡萄糖而洗脱;洗脱液按5ml组分收集，也通过在280nm处的吸收进行分析;(b)将含有不与半乳糖衍生的Sepharose4B结合的组分加到DEAE-52柱上，它先在pH7.2下然后在pH9.2下被洗脱，按5ml收集组分进行280nm处的光吸收检测。合并在pH7.2下含有吸收峰值的组分，并将在pH9.2下含有吸收峰值的组分也合并。一个特定豆科宿主的这三种组分(即用葡萄糖洗脱的组分和在pH7.2及pH9.2下洗脱的组分)可以合并起来，并可用来代替上述营养介质中的完整提取物。事实上，这三种组分中的有效成分可以结晶保存。这些由豆科宿主得到的晶体可以用来代替豆科宿主提取物而作为用于鉴别本发明根瘤菌转化株的营养介质的一个成分。
虽然，我们并不限于任何一种理论或对发明的解释，但是层析组分可能含有蛋白质，也可能含有糖蛋白。对衍生的Sepharose4B的亲和性表明该蛋白质中有可能至少有一个是外源凝集素。这一点可能是很有意义的，因为豆科植物的外源凝集素被认为在根瘤菌共生体的最初识别中是重要的。一旦这些蛋白质的氨基酸序列被确定，这些蛋白质就能够通过化学合成方法或者DNA重组技术、利用原核细胞或真核细胞的宿主载体表达系统来表达这些蛋白质而制备。最好是在真核细胞宿主载体表达系统中表达蛋白质，因为真核细胞可以以更相似于天然蛋白的方式得到该蛋白质，这在蛋白质是外源凝集素时尤为重要。此外，这些被识别的蛋白质，可以从与豆科宿主不同的来源中分离出来。按照这种理论，我们并不排除这种可能性，即在提取物中存在的象碳水化合物、生物碱、激素等这样的其它因子可能是该提取物具有活性的一个重要因素。
虽然前面所述的营养介质对鉴定本发明转化株提供了一个方便的检测方法，但是，还是对转化株DNA的特征作了初步鉴定。本发明的在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化株似乎具有其结合转化株的亲代根瘤菌中不包含的质粒。虽然我们并不限于任何一种理论或对发明的解释，但是注意到这些质粒可能包含对这些根瘤菌转化株的新宿主范围起作用的DNA序列是有意义的。
产生本发明根瘤菌转化株的方法将在下面详细讨论。
5.1.2.产生根瘤菌转化株的交错划线培养法产生本发明根瘤菌转化株的交错划线培养法包括以下步骤，将两种不同的根瘤菌菌种(亲代)以交错划线方式接种到一个固体培养基上，该介质除了含有细菌生长必需的养分外，还含有无论是(a)每个根瘤菌菌种豆科宿主共生体的未变性提取物的混合物;(b)如上面5.1.1节所述的由每个豆科宿主提取物得到的三种层析组分;(c)由每个豆科宿主层析组分得到的晶体;或(d)与其相关的蛋白质(包括糖蛋白)。以后将称这些成分为豆科植物提取物、层析组分、晶体或蛋白质。每个亲代根瘤菌菌种将形成一些沿划线具有特征颜色的菌落。在亲代菌落的交替行之间产生了根瘤菌的转导结合体(这里称为根瘤菌F1转导结合体)。根瘤菌F1转导结合体与其亲代不同，形成乳白色菌落，并且不能使任何植物形成根瘤。
从乳白色菌落中分离出根瘤菌F1转导结合体，并与一个第三亲代根瘤菌以交替行方式在固体培养介质上培养，该介质除了含有用于产生F1转导结合体所用的豆科提取物、层析组分、晶体或蛋白质外，还含有由该第三亲代根瘤菌的豆科宿主共生体得到的第三种未变性豆科提取物、层析组分、晶体或蛋白质。在根瘤菌F1转导结合体形成的乳白色菌落和第三亲代根瘤菌形成的有色菌落的交错行之间产生根瘤菌F2转导结合体。通过它们雪白的颜色鉴别出这种根瘤菌F2转导结合体，它们能够侵入到经本文所述那样处理和播种生长的非豆科植物中，并能形成根瘤和固氮。
由于采用了专门化的介质，就可能鉴别和挑选上面产生的根瘤菌F1和F2转导结合体。在进行每一种交叉时，在配对的各行之间出现两种类型的菌落(a)含有其亲代菌落混合颜色的一个有色菌落和(b)乳白色的F1转导结合体或雪白色的F2转导结合体。这种混合颜色的菌落含有不稳定的根瘤菌;这些根瘤菌只有第一代能够在它两个亲代根瘤菌的豆科宿主共生体中形成根瘤。换句话说，由每个豆科宿主的根瘤中回收的细菌只能再次使该特定的豆科宿主形成根瘤。乳白色菌落的F1转导结合体是稳定的，但不能使任何植物形成根瘤。令人惊异的是雪白色菌落的F2转化株竟是能使非豆科植物形成根瘤和共生固氮的稳定根瘤菌。
用来产生F2转导结合体的亲代根瘤菌可以是根瘤菌的一个第三菌种。另一个F1转导结合体或者也可以是另一个F2转导结合体。如果该第三亲代含有另一个F1转导结合体，那么其营养介质至少要含有四种豆科提取物、层析组分、晶体或蛋白质;即用于产生两个F1转导结合体的二个亲代根瘤菌的每个豆科宿主共生体的那些提取物、层析组分、晶体或蛋白质。如果该第三亲代包括了一个F2转导结合体，那么其营养介质要至少含有五种宿主豆科的提取物、层析组分、晶体或蛋白质;即用于产生F1转导结合体的两个亲代根瘤菌每一个的豆科宿主共生体以及用于产生F2转导结合体的三个亲代根瘤菌每个的豆科宿主共生体的那些提取物、层析组分、晶体或蛋白质。
亲代菌落的交错划线法是产生这种转导结合体的一个方便的方法;但是，任何形式的接种或接种方法都可用来在彼此靠近的地方培养亲代菌落，结果就能出现结合作用。可以采用圆、椭圆、波浪或螺旋图形。事实上，一些不同的亲代可以用划线接种到培养板上，以在同一板上产生一些不同的转导结合体。
5.1.3.产生根瘤菌转化株的另一些方法虽然交错划线培养法是产生根瘤菌F2转导结合体的一个方便的方法，但是本发明并不限于这种方法。事实上除了结合之外，用对增大根瘤菌的宿主范围专一性起作用的适当质粒进行转化也考虑在本发明的范围之内，此外，DNA重组技术、包括利用适当序列进行根瘤菌感染的噬菌体和其它载体也考虑在本发明的范围中。
例如，根瘤菌的一个特别有用的系统是能用于转化根瘤菌的Tn5转座子。共生质粒可以通过用一个含有nif基因的标记DNA探针的杂交作用来鉴别。这种共生质粒的转移可以通过以下方式实现(a)通过利用Tn5将一个标志基因结合到该共生质粒中去，例如一个对抗菌素有抗性的基因可以利用转座子Tn5通过一个结合供体和受体细菌被结合到该共生质粒中，并根据所要求的抗性来选择杂交体;(b)通过在大肠杆菌中对该共生质粒或其蛋白进行克隆并用该质粒本身转化根瘤菌;(c)通过重组具有例如象Pvw5jl或Tn5-Mob这样的与标志基因(例如抗菌素的抗性)一起的转移基因的质粒;以及(d)通过将包含有具有其被结合的标志基因的质粒与该受体细菌，同时与一个促进转移的辅助细菌杂交。
5.2非豆科植物种子的包膜及包膜的种子为了在本发明的根瘤菌转化株之间实现共生现象，非豆科种子应当用一种专一于该根瘤菌转化株的物质处理或包膜。这些包膜物质可以包括或不包括该根瘤菌转化株本身。在包膜物质中有无根瘤菌转化株只是影响到后来实现在该生长植物中共生所采用的方法。
5.1.2非豆科植物种子的包膜包膜物质包括但不限于其中含有或不含有根瘤菌转化株的以下物质(a)由根瘤菌转化株每个亲代共生体的豆科宿主植物得到的提取物的混合物;(b)由转化株的每个亲代根瘤菌共生体的豆科宿主植物得到的层析组分;(c)由豆科提取物和/或层析组分得到的晶体或(d)与其相关的蛋白质。如前面解释过的那样，这些蛋白质可以由化学合成方法、DNA重组技术或一些另外的来源分离产生。
虽然我们不限于任何一种理论或对发明的解释，前面所述的这些包膜物质可以包含一些对非豆科植物与根瘤菌转化株之间实现共生现象是重要因子中的任何一个，包括但不限于外源凝集素、黄酮等。
根瘤菌(Rhizobium)的根瘤基因与正常根毛的卷曲有关，并因此与共生体/宿主的识别和根瘤形成有关，最近有报道指出，豆科植物根部的渗出物可诱导此基因的表达(Rossen等，1985，EMBO4(13A)∶3369-3373)。更最近有报道指出，一组由豆科植物根部分泌的称为黄酮的物质可诱导根瘤菌中形成根瘤的基因的表达(见Redmond等，1986，Nature323∶632-635)。黄酮通常是由各种植株的花和叶产生，已知只有豆科植物在根部能分泌或含有黄酮。根据Redmond等人的报道，豌豆、菜豆、大豆、苜蓿和三叶草等根部分分泌物中的某种黄酮能诱导三叶草根瘤菌(R·trifoli)的nodA基因的表达，而非豆科植物玉米、水稻和Parasponia的根部分泌物不能。从共生的观点看来，根瘤菌的刺激不是豆科植物宿主专一性的，即所诱导出的根瘤菌中nod A的表达是对于若干种不同豆科植物分泌物的反应。因此，黄酮可能是根瘤菌与豆科植物之间的早期信号之一，在那之后发生宿主专一性更高的第二步识别(如外源凝集素-多糖的识别系统)，从而建立特异的宿主-共生体联合。黄酮诱导系统可能是一个早期现象，它使得用豆科植物提取物处理的非豆科植物种子能够接受本发明F2根瘤菌转化体的感染。存在于豆科植物提取物中的黄酮也许在吸胀或预萌发期间由非豆科植物种子所吸收，然后转移到幼苗的根部，这样在分泌时便可吸引根瘤菌转化体。
本发明种子包膜包含的豆科植物提取物中的其它因子，在非豆科植物宿主F2转导结合体的建立中也许是很重要的。例如，种子包膜中可能含有外源凝集素，它被认为与根瘤菌及其豆科植物宿主间的专一性识别反应有关。最近有一份报告描述了一种粒状外源凝集素三叶草素A(Trifolin A)，它可从三叶草根部的分泌物中分离出来，它专一性地与三叶草根瘤菌相结合(Truchet等，1986，Physiol·Plant 66∶575-582)。有趣的是，含有外源凝集素的豆科植物根部分泌物能使根瘤菌突变体恢复识别其豆科植物宿主并形成根瘤的能力(见Halverson等人，1984，Plant Physiol·74∶84-89及1985，Plant Physiol·77∶621-625)。在本发明的种子包膜中，很有可能存在着一种或更多的外源凝集素，它可使根瘤菌转化体及其非豆科植物共生体之间发生专一性识别。
5.2.2.包膜非豆科植物种子的方法非豆科植物种子可通过多种方法进行包膜，这些方法包括但不限于浸渍及空气干燥、喷洒、包封(如在聚合体中)、浸渍及在鼓形容器中干燥等。所选方法根据所用包膜而定。例如，如果根瘤菌转化体是包含在包膜混合物中，所用方法和成分应当保证细菌的成活性;这些混合物包括，但不限于含有凝胶以维持较高温度的包膜混合物;另外，可用含有杀菌剂的碾成粉末的种皮包裹种子。在任何一种方法中，都应当保证包膜中的活性物质不变性或不受到破坏。
在本发明的实例中，通过在豆科植物提取物中浸渍及空气干燥对非豆科植物种子进行包膜，最好是进行三次。两次浸渍使根瘤菌转化体的穿透性很低，而四次浸渍似乎並不能改善穿透性。
5.3.在非豆科植物中建立共生固氮可用若干方法保证根瘤菌转化体对非豆科植物的感染;所选择的方法一部分根据所用非豆科植物种子包膜的性质而定。
例如，用上述包膜处理过但不含根瘤菌转化体的非豆科植物种子，可用根瘤菌转化体的悬浮液浇灌。种子、幼苗或植株也可象这样用一定体积的细菌悬浮液浇灌。如果种子包膜中含有根瘤菌转化体，则只需要种植和浇水就可以了。
根据植物种类、土壤或环境条件等，最好是加入不含氮素的肥料。实际上，我们在实验室的试验中已发现，在播种初期加入2mM氮素已足以提高植株的初始生长而不伤害或“关掉”根瘤菌转导结合体。这样就更贴切地模仿了自然条件，因为在大多数土壤中(即使是没有施肥的)含有一定数量的氮素(不多于2mM)，不需要向土壤中加入氮素。
5.4.形成根瘤的非豆科植物通过本发明的根瘤菌转化体形成根瘤的非豆科植物含有一定的氮素，其干物质的含量等于或大于没有根瘤但施过氮肥的相应植株，有根瘤植株的氮素和干物质含量高于没有根瘤也没有施过氮肥的相应植株。有根瘤植株的氨基酸组成的分析表明，在大多数情况中，每种氨基酸的比例不变，但每个植株的总浓度有所上升。而在某些情况下，观察到了较高水平的色氨酸和亮氨酸。
有趣的是，我们发现在某些种的有根瘤非豆科植株收获后的秸杆残留物中，一致地含有大约6%至大约9%的蛋白;这与通常在其无根瘤的相应植株中发现的1.5%至2%的蛋白含量相比是一个鲜明的对照。这种高蛋白秸杆可有利地作为蛋白质源使用，例如，用于农业或家养动物的饲料混合物中。
本发明的能在非豆科植物中形成根瘤并固氮的根瘤菌转化体，能够减少使用费用昂贵的氮肥并最终能够改善土壤。
5.4.1.根瘤的特点通过本发明根瘤菌转化体形成的非豆科植物根瘤的形态在外观上是相当正常的，然而，所形成的小根瘤较多。根瘤菌似乎是通过侵入线进入根部的，而类菌体似乎是保留在间隔中。实际上，在根瘤中观察到了一种带红色的颜色，它可能是豆血红蛋白或与其密切相关的一种蛋白。根瘤的电子显微照片表明，皮层中的维管束成圆周状排列，而侧根中的维管束位于中央。根瘤中心部分的大多数细胞充满了类菌体。
6.实例产生根瘤菌转导结合体及使非豆科植物形成根瘤的材料和方法下述实例描述了利用本发明根瘤菌转化体在下列属于禾本科的非豆科植物中形成根瘤的方法小麦、大麦、高梁和水稻。此外，不属于禾本科的芸苔属中的一员(属于十字花科)也通过本发明根瘤菌转化体使之形成了根瘤。有趣的是，在禾本科之外的另一种植物上也观察到了正效应，即桉属(Eucalyptus)(它是桃金娘科中的一员)在每个实例中，都使用交错划线培养法产生根瘤菌转导结合体。使非豆科植物的种子在豆科植物的提取液中浸渍，从而在非豆科植物的种子上形成一层包膜，用来制备上述提取液的豆科植物是专一于用于使非豆科植物形成根瘤的特异根瘤菌转导结合体的。通过播种包膜种子，使它们萌发并用根瘤菌转导结合体的悬浮液浇灌籽苗，从而使非豆科植物的包膜种子感染上根瘤菌转导结合体;在8-12星期内发育出固氮根瘤。
在实例中进行了实验室研究，将非豆科植物分成三组并如下述进行处理(a)第一组用根瘤菌转导结合体处理而不施加氮肥(+R-N);(b)第二组用氮肥处理而不用根瘤菌转导结合体(-R+N);(c)第三组既不用根瘤菌转导结合体也不用氮肥处理(-R-N)。在生长的一定阶段，从植株上取样，测定每个植株有机氮的总含量、每个植株的干物质量、在某些实验中还测定每个植株的蛋白含量及其氨基酸组成。在某些实例中还进行了大田研究。结果表明，每一种通过根瘤菌转导结合体形成根瘤的非豆科植物的植株都能够固氮，在生长中不需要氮肥。实际上，在许多例子中，有根瘤的非豆科植物(+R-N)比之施肥的无根瘤组(-R+N)或未处理组(-R-N)，氮含量和干物质含量都要高。
除非特别指出，下述材料和方法用于后面的每个实例中。
6.1.交错划线培养法后面的每个实例中所用的交错划线培养法包括如下步骤在琼脂营养培养基上，以交错线条(相距3mm)划线培养两种不同的根瘤菌(亲代)，该培养基中除了生长必要的养分外，还含有专一于各种亲代根瘤菌的各种豆科植物宿主的未变性的提取物。在低于32℃的生长温度下如18℃和30℃之间保温后，各种亲代根瘤菌形成了具有该种特征颜色的菌落;在有色的亲代菌落的交错线条之间，产生了根瘤菌转导结合体(F1转导结合体)。根瘤菌的F1转导结合体与其亲代不同，它形成乳白色菌落而且不能使植物形成根瘤。应当注意，在32℃以上的温度在此处所用的琼脂培养基上保温，导致在平板上划线的所有根瘤菌种都形成红色菌落，但如果温度降到32℃以下(如最好是在18℃至30℃之间)，则将会出现各种菌落的具有特征的颜色。
从乳白色菌落中分离出根瘤菌的F1转导结合体，如上述与第三种根瘤菌亲代在琼脂营养培养基上进行交错划线培养(相距3mm)，该培养基中除了用于产生乳白色菌落的豆科植物的未变性的提取物外，还含有第三种豆科植物的未变性的提取物，它来自对第三种亲代根瘤菌具有专一性的豆科植物宿主。在根瘤菌的F1转导结合体的乳白色菌落和第三亲代根瘤菌形成的有色菌落的交错线条之间，产生了根瘤菌的F2转导结合体。根瘤菌的F2转导结合体菌落可通过其雪白色加以鉴别这些F2转导结合体在对非豆科植物进行前述的处理和种植后，能够使它们感染，形成根瘤并能够固氮。下面更详细地描述了用于产生根瘤菌转导结合体的材料和方法。
6.1.1.亲代根瘤菌的分离用作亲代的根瘤菌种从土壤样品中分离得到，或从已发育到高级阶段的豆科植物根瘤中分离得到。
从土壤中分离亲代根瘤菌，是通过将由该根瘤菌形成根瘤的宿主豆科植物的种子置入土壤样品中而达到的。通常情况在3-4星期后收获植株，如生长缓慢则在10-12星期后收获。
从豆科植物根瘤中分离亲代根瘤菌的方法如下从豆科植物的根部切下根瘤，并连带着切下大约1cm的围绕该根瘤的根部组织，通过浸入3%HgCl2中进行灭菌处理，然后在80%乙醇中洗涤。将根瘤从根部组织上分离下来，在无菌条件下在研钵中研碎。将研碎的材料铺在下述的琼脂营养培养基上。通过在同样组成的培养基上再培养以纯化菌落，直到形成两次单菌落为止。将从纯化的单菌落上分离的根瘤菌在所述琼脂营养培养基上进行交错划线培养，以培养出亲代根瘤菌菌落的交错线条。
6.1.2.琼脂营养培养基用于以交错线条培养根瘤菌的琼脂培养基，是通过将下列养分以所指出的数量加到100ml蒸馏水中制备而成的KH2PO40.15gK2HPO40.15gKNO32.50g(NH4)2SO40.135gMgSO4·7H2O 0.25g甘露醇10.00g琼脂12.00g溶液11.00ml酵母提取物5.00ml溶液1的组成如下MnCl2·4H2O 500mg
H3BO3300mgZnSO4·2H2O 200mgNaMoO4·2H2O 20mgCuSO4·5H2O 2mgCoCl2·6H2O 2mg蒸馏水加至最终体积为100ml然后将上述定义的琼脂培养基在2巴下高压灭菌20分钟，冷却至55℃至60℃之间的温度，再加入下列物质溶液2、溶液3和溶液4各1.0ml;从对于各种待培养的亲代根瘤菌具有专一性的宿主豆科植物中产生的未变性的豆科植物提取物各20ml;下列氨基酸各15mg;L-丙氨酸、L-丝氨酸和L-色氨酸。为避免豆科植物提取物中的蛋白变性，不应当对最终的培养基组合物进行高压蒸汽灭菌。
溶液2、溶液3和溶液4的组成如下所示。都是用无菌蒸馏水制备的。
溶液2烟酸50mgHCl硫胺素50mgHCl吡哆醇50mg肌醇50mg生物素50mg加入无菌蒸馏水至最终体积100ml溶液3碘化钾75mg
无菌蒸馏水100ml溶液4CaCl2·H2O 15mg无菌蒸馏水100ml6.1.3.豆科植物提取物用于琼脂培养基及包膜非豆科植物种子的豆科植物提取物如下述制备。
将整个植株或所选择的部分植株如洗净的根部、灭菌的种子或气生部分、或者最好是幼茎破碎成细小的颗粒，用80%乙醇在研钵中研磨成稀匀浆，在其中加入等体积的钾-钠盐缓冲液，pH7.2，该缓冲液组成如下K2HPO40.430gNaH2PO41.469gNaCl7.200g加入无菌蒸馏水至最终体积为1000ml将植物提取液匀浆和缓冲液的混合物在4℃下静置48小时后，以大约5000xg离心30分钟使其沉淀。然后，使上清液在4℃下在无菌蒸馏水中透析48小时，其间换水5至6次，直至得到澄清无色的提取液。将提取液保存在4℃下。
6.1.4.根瘤菌转导结合体的分离将两种亲代根瘤菌在32℃以下的温度以交错线条(相距3mm)在含有上述合适的豆科植物提取物的琼脂培养基中培养时，亲代根瘤菌形成具有各自特征颜色的菌落。而在有颜色的亲代菌落线条之间产生了两种菌落(a)具有亲代菌落的混合颜色的菌落和(b)根瘤菌的F1转导结合体的乳白色菌落。有色菌落和F1转导结合体的乳白色菌落之间的比例多少有些变化，但平均范围为大约100∶3(混合色菌落∶乳白色菌落)。混合颜色菌落可以感染两种宿主豆科植物，但只是一代有效;即混合色菌落的根瘤菌可使两种亲代根瘤菌的豆科植物宿主共生体形成根瘤，但从各种豆科植物宿主的根瘤中回收的根瘤菌只能使那一种特异的豆科植物宿主再次形成根瘤。与之相反，F1转导结合体的乳白色菌落不能感染任何一种植株。
由于很难将单个杂交菌落转移到新的培养基上而不沾染上一个或更多的有色菌落的污染，因此，通过将乳白色菌落转移至另一个琼脂培养基上(组成相同)而进行一次或多次的生物清除，一般大约在10至12星期后，直至得到了具有稳定而均一的乳白色的F1转导结合体的纯培养物。
然后，将形成乳白色菌落的F1转导结合体的纯培养物，以交错划线的方式(相距3mm)与另一种根瘤菌在低于32℃的温度下在与用于F1转导结合体组成相同的琼脂培养基上培养，但该培养基中还另外含有第三种豆科植物提取物，它来自对第三种亲代根瘤菌具有专一性的豆科植物宿主。F1转导结合体产生具有其乳白色特征的菌落，而亲代根瘤菌产生具有其特征颜色的菌落。在乳白色菌落和有色菌落的线条之间产生了两种菌落有色菌落和雪白色菌落。雪白色菌落中含有根瘤菌的F2转导结合体，它能在非豆科植物上形成固氮根瘤。用乳白色菌落的清除和分离中所用方法同样处理F2转导结合体的雪白色菌落，并用于感染非豆科植物。
在非豆科植物中形成根瘤后，可从根瘤中分离得到根瘤菌的F2转导结合体的类菌体并在琼脂培养基中培养。如果琼脂培养基具有与用于产生转导结合体的琼脂培养基的同样组分(即含有来自专一于用于产生F2转导结合体的各种亲代根瘤菌豆科植物宿主的三种豆科植物提取物)，并加有一种其非豆科植物宿主的提取物，则从非豆科植物的根瘤中分离得到的F2转导结合体将形成一种灰色菌落。
6.2非豆科植物种子的制备将非豆科植物种子在20℃下在含有3%的硫酸钙和低於10%的三种豆科植物提取物的混合物的水溶液中浸渍三次，每次三小时，使之包膜，该豆科植物提取物的制备如6.13部分所述。该提取物是用来生产根瘤菌F2转导结合体，在每次浸渍后，将种子在40℃下空气干燥12小时。
6.3 用根瘤菌F2转导结合体侵染非豆科植物用根瘤菌F2转导结合体侵染非豆科植物的作用是通过播种包膜的非豆科植物种子並用根瘤菌F2转导结合体浇灌发芽的籽苗来完成的，在下面的实例中描述了实验室研究及大田研究情况，其中，发芽的籽苗用以下三者之一的方法处理(a)用根瘤菌F2转导结合体处理而不加无机氮肥(+R-N)，(b)施加无机氮肥而不用根瘤菌F2转导结合体处理(-R+N)，(c)既不用根瘤菌F2转导结合体，也不用无机氮肥(-R-N)处理。在最后的植物中测定了每株植物的氮含量。干物重量，而且有时也测定其氨基酸组成。
所用的材料和方法具体描述如下6.3.1实验室研究在实验室研究中，将包膜的非豆科植物种子播种在一升填有3毫米的“Fibo”(R)一烧结块的容器(JydskPapirVaerk，Arhus)中，每个容器中播种4-5个种子。“Fibo”烧结块就是直径约3毫米，充有空气的、煅烧过的粘土砾石，一般是用作绝热材料。
当发芽的种子在“Fibo”一烧结块表面上长出几厘米时，按下述灌烧每只容器中的籽苗(a)+R-N组，浇入50毫升根瘤菌F2转导结合体的悬浮液，然后每星期在每只容器中对植物浇灌50-80毫升的无氮肥料溶液;(b)-R+N组，不用根瘤菌F2转导结合体处理而施加无机氮肥;以后每星期在每只容器中向植物浇灌50-80毫升的同样的无机氮肥;(c)-R-N组，在每只容器中浇入50-80毫升的无氮肥料。所用的无机氮肥和无氮肥料规定如下肥料标准溶液的毫升数/升最后容积标准溶液氮肥无氮肥料NH4NO3(1.0M) 20 0CaSO4·2H2O(0.012M) 65 65KH2PO4(0.10M) 20 20MgSO4·7H2O (0.20M) 15 15Fe(EDTA)FeSO4·7H2O(2.490g) 10 10Na2EDTA(3.716g)最终容积为一升
(续)标准溶液氮肥无氮肥料MnCl3·4H2O(106.1mg/l) 10 10H3BO3(142.2mg/l) 10 10ZnSO4·7H2O(110.7mg/l) 10 10CuSO4·5H2O(8.0mg/l) 10 10Na2MoO4·2H2O(11.1mg/l) 10 10用以浇灌籽苗的根瘤菌F2转导结合体悬浮液是通过在含有200毫升的下列营养介质的300毫升烧瓶中培养根瘤菌转导结合体制得的KH2PO41.0 gK2HPO41.0 gMgSO4·7H2O 0.36 gCaSO4·2H2O 0.17 gFeCl3·6H20.005 gKNO30.7 g酵母提取物1.0g甘露醇3.0g加入蒸馏水到最终体积为1000毫升细菌在28℃下生长2-3天直到培养物中的细菌密度用分光光度计测量(620nm处的光吸收)已达到0.8。这就表明细菌已进入对数生长期，培养过程还没有达到稳定，此后细胞在约5000×g的条件下离心30分钟而沉淀。并在无菌水中再悬浮而洗涤，这样的洗涤重复1-2次，以除去细菌细胞上全部含氮化合物。最后的细胞沉淀在1.8升无菌水中再悬浮。将最后的悬浮液用来浇灌非豆科植物籽苗。
6.3.2大田研究在大田研究中，将包膜的非豆科植物种子播种在从未耕种过的土壤中。开垦土地，并分割成宽30英尺、长90英尺的田块，为了防止化学试剂从一块地中泄漏而进入并沾染另一块地，种子相间地播入田中，(即在播种的田块块间留一块未播种的田块)。在田块中，种子播成6行，每行相间60英寸，而在每行中种子相隔8英寸。
每一块地中含有下列各组之一(a)+R-N组，用根瘤菌F2转导结合体处理，并用前面规定的无氮肥料浇灌，(b)-R+N组，不用根瘤菌F2转导结合体处理而用前面规定的无机氮肥浇灌;(c)-R-N组，既不用根瘤菌F2转导结合体也不用无机氮肥处理而施以无氮肥料。
以下的步骤是用根瘤菌F2转导结合体侵染+R-N组在每粒播种的种子下面4英寸处接种根瘤菌F2转导结合体培养物。播种和接种过程都可以由机器完成，该机器带有一只装有按上述大规模制备的根瘤菌F2转导结合体悬浮液的300加仑储罐(即根瘤菌F2转导结合体在10000加仑罐中生长到对数期时再稀释到O.D.620为0.8)，大约在每粒种子下的土坯中接种1.5毫升的根瘤菌F2转导结合体培养物，然后种子和籽苗如前所述进行浇灌。
6.4.非豆科植物的干物质重量、氮含量以及蛋白质含量的分析方法在实验室研究中定期地从每组植物的许多容器中取出植株，使每只容器只剩3株植物，将它们移出用凯氏定氮法分析而测定每只容器中(即3株植物)有机氮的总含量和干物质重量。为此，将这些植物的气生部分分离，在80℃温度下干燥48小时，称重、粉碎并在研钵中研磨，将研磨过的料样按标准方法进行凯氏定氮分析。每个分析要重复4-6次，根据每株植物的氮含量及干物质量记录结果。在每种情况下，由根瘤菌形成根瘤的植物的干物质量及氮含量都比施加氮肥组或未处理组的要高。
在大田研究中，定期地收获许多植物，用凯氏定氮法分析每株植物的氮含量，将氮含量的百分率乘以6.25因子而确定每株植物的蛋白质量。在某些研究中，也测定了蛋白质的氨基酸组成。在各种情况下，由根瘤菌形成根瘤的非豆科植物的蛋白质量要比用无机氮肥处理和用无氮肥料处理的植物要高。
7.实例，使小麦形成根瘤的小麦根瘤菌(RhizobiumTritici)使小麦生成根瘤的小麦根瘤菌是根据第6部分所述方法制备的，先用菜豆根瘤菌(R·Phaseoli)和豇豆银合欢根瘤菌(R·Cowpea Leucaena)杂交，以生成F1转导结合体，然后再将它和三叶草根瘤菌(R·trifoli)杂交。用生成的小麦根瘤菌(R·tritoli)使四种小麦Anja、Kraka、Vuka和Williams生成根瘤。
7.1.小麦根瘤菌的制备为了制备小麦根瘤菌，要用下列亲代根瘤菌来制备F1转导结合体乳白菌落(a)菜豆根瘤菌是由长在Aarhus，MS-1附近发现的土样中的菜豆裁培品种Prospector中分离得到，(b)豇豆银合欢根瘤菌，是由新几内亚、巴布亚(Papua，NewGuinea)热带树银合欢(LeucaenaLeucocephala)〔属於蝶形花科属(Fabaceae)〕分离而得到。
亲代根瘤菌是在前面所述的琼脂培养基上交错培养，介质中所用的豆科植物提取物是分别从菜豆的气生部分和银合欢(LeucaenaLeucocephala)的叶子提取。由菜豆根瘤菌形成的菌落具有特征的深棕色，而由豇豆银合欢根瘤菌所形成的菌落则有特征的棕灰色。
清洗由乳白菌落制得的根瘤菌F1转导结合体，并用三叶草根瘤菌(R·trifoli)按前面所述进行交错划线培养。该三叶草根瘤菌是由长在Randers附近土壤中发现的红三叶草(red Clover)中分离而得的。用在介质中的豆科植物提取物可以由菜豆的气生部分、银合欢叶子和红三叶草的气生部分分离得到。由F1转导结合体形成的菌落有特征的乳白色，而由三叶草根瘤菌形成的菌落则有特征的浅棕色。
由在划线中间得到的雪白菌落所制得的根瘤菌F2转导结合体，这里又称为小麦根瘤菌，按上述方法清洗、分离，此过程需20周，然后将F2转导结合体用於使小麦生成根瘤。
7.2.用小麦根瘤菌使小麦生成根瘤利用小麦根瘤菌使四种小麦Anja、Kraka、Vuka和Williams生成根瘤，将小麦种子在如前所述的含有3%硫酸钙和约10%以下用以产生小麦根瘤菌的豆科植物提取物的溶液中浸渍处理三次。用以包膜种子的三种豆科植物提取物是由菜豆的气生部分、银合欢叶子和红三叶草的气生都分制得的。种子在每次浸渍后，空气干燥，并按下述播种。
7.2.1.实验室研究对三种小麦(Anja、Kraka和Vuka)进行如前所述的实验，即在每个填有“Fibo”-烧结块的一升容器中种入4-5粒包膜的种子，并使之发芽。将三种小麦中每一种都分成三组(a)+R-N组，用50毫升如前制备的小麦根瘤菌悬浮液，灌浇籽苗以后每星期用无氮肥料浇灌，(b)-R+N组，不用小麦根瘤菌而用无机氮肥浇灌籽苗，(c)-R-N组，既不用无机氮肥，也不用小麦根瘤菌而用如前所述的无氮肥料浇灌籽苗。用小麦根瘤菌处理的植物在8-10周之间发育根瘤。将每只容器中的植物减少到3株。将每组中十只容器中的植物用来分析其干物量及氮含量。
7.2.2.大田研究在大田研究中，包膜的麦种按前面6.3.2.部分中所述的方法播种。(a)+R-N组种子，如前所述，用小麦根瘤菌的悬浮液处理并用无氮肥料浇灌，(b)-R+N组种子，不用小麦根瘤菌处理而用无机氮肥浇灌，(c)-R-N组种子，既不用小麦根瘤菌，也不用无机氮肥处理，而只简单地用无氮肥料浇灌。
7.3.生有根瘤小麦的干物重量、氮含量及蛋白质量的分析按6.4.部分所述的分析方法分析生有根瘤小麦植物的性能。
7.3.1.实验室研究的结果分别将在播种后56、70、87、100和118天的小麦从容器中收获，用前面所述的方法分析每株植物的干物质量及氮含量(凯氏定氮法)。
分析结果示於图1，图中每株植物的干物质量(A)和每株植物的氮含量(B)都是按对应的播种天数标志的。
下面列出的三类麦种的平均干物质量和平均氮含量数据是有助于理解示图。
小麦种类干物质量氮含量克/100种子毫克/种子Anja4.4031.103Kraka3.6110.896Vuka4.0520.819不同时间收获的植物数如下收获的植物数植物组播种后天数567087100118试验1+R-N3330212325-R+N2430202120-R-N2426222635试验2+R-N1110788-R+N810777-R-N897912图1中的结果表明，在生长期间，用根瘤菌处理的小麦植物比施氮肥的植物有更高的氮含量和干物量。在实验结束时，+R-N组植物的干物量几乎比-R+N组植物高出40%而这两组植物又比未处理的-R-N组植物要高。
7.3.2.大田研究的结果在大田研究的小麦植物经过一个生长季节后收获，如前所述分析每株植物的蛋白质量。结果列于表Ⅱ中。清楚地表明，用小麦根瘤菌处理过的植物(+R-N)要比无论是用无机氮肥(-R+N)还是用无氮肥料(-R-N)处理的植物都有较高的蛋白质量。
表Ⅱ小麦的蛋白质量植物组蛋白质量/每株植物+R-N22-28%-R+N12-14%-R-N ND＊＊ND无数据，这些未处理的植物8周以后已死亡。
8.实例使大麦生成根瘤的大麦根瘤菌(RhizobiumHordei)使大麦生成根瘤的大麦根瘤菌，是按第6节中所述方法生成的，先用菜豆根瘤菌和豆科根瘤菌杂交，以产生F1转导结合体，然后再将它与豇豆银合欢根瘤菌杂交，生成的大麦根瘤菌用於使四种大麦Hasso，Cerise，Harry和Igri，生成根瘤。
8.1.大麦根瘤菌的制备为了制备大麦根瘤菌，要用下列亲代根瘤菌来制备F1转导结合体乳白菌落(a)菜豆根瘤菌是由长在Aarhus附近土壤中发现的菜豆植物栽培品种，Prospector，中分离得到，(b)豆科根瘤菌，是由菜园豌豆中分离而得。
亲代根瘤菌在前述的琼脂介质上交错划线培养。用于介质中的豆科植物提取物分别由菜豆和菜用豌豆的气生部分获得。由菜豆根瘤菌形成的菌落具有特征的深棕色，而由豆科根瘤菌形成的菌落则具有特征的金黄色。
按前面所述，清洗由乳白菌落制得的根瘤菌F1转导结合体，並用豇豆银合欢根瘤菌交错划线培养，豇豆银合欢根瘤菌是由热带树木银合欢(Leucaena Leucocephala)分离而得。用在介质中的豆科植物提取物分别由菜豆和菜用豌豆的气生部分和银合欢的叶子中分离而得的。由F1转导结合体形成的菌落是乳白色而由豇豆银合欢根瘤菌生成的菌落则有特征的棕灰色。
将由在划线中间得到雪白菌落所制得的根瘤菌F2转导结合体，这里又称大麦根瘤菌，按上述方法清洗、分离。将F2转导结合体用於使大麦形成根瘤。
8.1.1.大麦根瘤菌的性能三种亲代菌株的质粒DNA，F1转导结合体和F2转导结合体(大麦根瘤菌)是采用Hirsh等人的改进方法(1980，J.Gen.Microbiol，120∶403-412)分离得到的。该法包括通过在4℃温度下，在40%SDS(十二烷基硫酸钠)中经过夜培养使根瘤溶解。利用在0.7%琼脂糖凝胶中的电泳作用使质粒DNA分离。分析结果表明，大麦根瘤菌具有一个低分子量的其他质粒，该质粒在三种亲代根瘤菌或F1转导结合体中都没有观察到。
8.2.用大麦根瘤菌使大麦形成根瘤用大麦根瘤菌使四种大麦Hasso、Cerise、Igri和Harry形成根瘤。将大麦种子在前述含有3%硫酸钙和约低于10%的用以产生大麦根瘤菌的豆科植物提取液中，浸渍三次。用以包膜种子的豆科植物提取物是由菜豆、菜园豌豆的气生部分以及银合欢的叶子得来的，种子在每次浸渍后，空气干燥，并按下法播种。
8.2.1.实验室研究对所使用的每一种大麦进行如前所述的实验，即在每个填有“Fibo”一烧结块的一升容器中种入4-5粒包膜种子。将每一种大麦都分成如下三组(a)+R-N组，用50毫升如前所述制备的大麦根瘤菌悬浮液浇灌籽苗，以后每周再用无氮肥料浇灌，(b)-R+N组，不用大麦根瘤菌处理而用无机氮肥浇灌籽苗，(c)-R-N组，既不用大麦根瘤菌，也不用无机氮肥，而用非氮肥浇灌籽苗。用大麦根瘤菌处理的植物在8-10周间就发育根瘤。将每只容器中植物减少到三株，将每组中十只容器中的植物用来分析其干物质量和氮含量。
8.3.形成根瘤大麦的干物质量、氮含量及蛋白质量的分析按6.4部分中所述的方法来分析形成根瘤的大麦植物的性能。
8.3.1.实验室研究结果从容器中收获分别播种59、71、85、108、128天的植物，如前述分析每株植物的干物量及氮含量(凯氏定氮法)。
分析结果示於图2中，图中每株植物的干物量及氮含量都按相应的播种天数标志。
下面所列的每种大麦的平均干物量及平均氮含量有助於理解示图
干物量氮含量大麦克/100种子毫克/种子Hasso3.9220.732Cerise4.2170.792Igri3.9320.775Harry5.0680.826不同时间收获的植物量如下收获的植物数播种天数植物组597185108128试验1+R-N2323273137-R+N1714302340-R-N1418282032试验2+R-N8891012-R+N6510813-R-N569711图2结果表明，在生长期间，用根瘤菌处理的植物其氮含量和干物量都要比施加氮肥的植物要高。在实验结束时，+R-N组植物的干物质量要比-R+N组植物几乎高出18-22%。而这两组植物的干物质量又比施加无氮肥料的-R-N组大麦植物要高。
8.4.在形成根瘤的大麦中15N的富集将大麦植物在有15N的大气中进行培养，然后对部分植物分析其15N量以表示其固氮作用。更具体的是，将有小根瘤的大麦(95天的)放入一个小室中，使其根部在有15N的大气下培育23小时。根部培养室中的大气含有80%的N2(其中15N占12.85原子%)和20%的O2。培养期后，分析样品中15N的含量，并用凯氏定氮法测定植物中的总氮含量。结果列于表Ⅲ中。
表Ⅲ部分形成根瘤大麦的氮含量干物质量N总N植物部分(克)(毫克/克)(毫克)根0.4488.93.99芽1.0177.57.63整株植物1.4657.9311.62部分形成根瘤大麦的15N量样品数目原子%15N＊根40.450±0.011芽30.392±0.003＊大气中15N含量约为0.370原子%。
表Ⅲ中的数据表明，形成根瘤的大麦植物的根和芽比大气中含有更多的15N。这些结果说明形成根瘤的大麦植物具有固氮作用。
8.5.形成根瘤大麦的形态学用电子显微镜观察某些大的根瘤，包括用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色的超薄横截面。大麦根瘤的细胞组织和Newcomb(1976，Can.J.Bot54;2163-2186)报导的豌豆根瘤的组织一样，即维管束位于皮层的四周，而根瘤的中心部分是充满了类菌体的植物细胞。
进一步的研究包括对小的大麦根瘤表面以及大的大麦根瘤的表面进行光学显微镜和电子显微镜分析(扫描和透射二种)，将观察到的形态与豌豆、白三叶草(WhiteClover)和黄豆(Soybean)的进行比较。当植物长到50天，长成植物的75%左右时，可以看到小的大麦根瘤(对小麦也进行了这种观察)。长到89-110天就能看到大的大麦根瘤。大的大麦根瘤虽少但不会弄错。测出其大小约为2-4毫米长，直径为1～2毫米，长在主根上，位置约在原种子位以下2-6厘米。在切开的十三只大根瘤中，有十一只内部呈红棕色，就是说，和长了20-35天的豆科植物根瘤中豆血红蛋白的颜色一样，剩下剖开的两只大根瘤中，一只呈白色，就象一只年幼未成熟的豆科植物根瘤，另一只则呈绿色，象变老的豆科植物根瘤。大麦感染过程可能是分两个阶段进行的。第一阶段是大麦根瘤菌进入根部，而没有诱发根瘤反应，而在第二阶段中在滞后一段时期后开始形成根瘤。
8.6.重新分离的大麦类菌体的抗抗生素作用将细菌从大的大麦根瘤中重新分离出来并进行抗抗生素试验。此重新分离的细菌能抵抗400μg/ml浓度以下的壮观霉素二盐酸。最初用来诱发大麦植物(即培养剂)的大麦根瘤菌F2转导结合体也具有同样的抗性。当在普通的酵母甘露醇琼脂上生长时，培养剂和重新离析的菌种都能形成白色不透明的菌落。
大麦根瘤菌F2转导结合体的亲代之一也能抵抗同样浓度的壮观霉素二盐酸(Spectinomycin dihydrochloride)。这种亲代就是豆科根瘤菌菌株MAI，当它在普通的酵母甘露醇琼脂上生长时就形成淡黄色不透明的菌落。因此壮观霉素的抗基因并不是在共生质粒上，大麦根瘤菌F2转导结合体似乎是含有一个非共生质粒或亲代豆科植物根瘤菌MAI的主要染色体的杂种。但这并不排除大麦根瘤菌F2转导结合体会使MAI的共生质粒停留的可能。
9.实例使高梁形成根瘤的高梁根瘤菌(RhizobiumSorghi)使高梁形成根瘤的高梁根瘤菌，是按第6部分所述而制备的。先用羽扇豆根瘤菌(R·Lupini)和豇豆银合欢根瘤菌杂交产生F1转导结合体，然后再将它和草木犀根瘤菌(R·metiloti)杂交。由此生成的高梁根瘤菌用於使三种高梁Safra、Dabar和Feterita形成根瘤。
9.1.高梁根瘤菌的制备为制备高梁根瘤菌，要用下列亲代根瘤菌来制备F1转导结合体乳白菌落(a)羽扇豆根瘤菌，是由在Jutland中心发现的羽扇豆分离而得，(b)豇豆银合欢根瘤菌，由在新几内亚、巴布亚发现的热带树银合欢(属於蝶形花科族)分离得到。
亲代根瘤菌在如前所述的琼脂介质上进行交错划线培养，用於介质中的豆科植物提取物分别由羽扇豆和银合欢叶子获得。由羽扇豆根瘤菌形成的菌落具有特征的浅黄色而由豇豆银合欢根瘤菌形成的菌落则有特征的棕灰色。
按上述方法清洗由乳白色菌落得到的根瘤菌F1转导结合体并与由在Stahr发现的紫苜宿(alfalfa)分离得到的草木犀根瘤菌的菌株交错划线培养。用在介质中的豆科植物提取物是羽扇豆、银合欢和紫苜蓿的叶子中获得的。由F1转导结合体形成的菌落是乳白色的而由草木犀根瘤菌形成的菌落则有特征的黄棕色。
将由在划线中间得到的白色菌落获得的根瘤菌F2转导结合体，这里也称高梁根瘤菌，按上述清洗、离析。並将F2转导结合体用於使高梁形成根瘤。
9.2.用高梁根瘤菌使高梁形成根瘤用高梁根瘤菌使三种高梁，Safra、Dabar和Feterita形成根瘤。将高梁种子在上述的含有3%硫酸钙和低于约10%的用於形成高梁根瘤菌的豆科植物提取物的溶液中浸渍三次。用以包膜种子的豆科植物提取物是由羽扇豆、银合欢和紫苜蓿的叶子中获得的。种子在每次浸渍后空气干燥，并按下述播种。
9.2.1.实验室研究对三种高梁Safra、Dabar和Feterita进行如前所述的实验，即将在每个填有“Fibo”一烧结块的一升容器中种入4-5粒包膜种子，并使之发芽。每一种高梁分成三组(a)+R-N组，用50毫升如前制备的高梁根瘤菌悬浮液浇灌籽苗，以后每星期用无氮肥料浇灌，(b)-R+N组，不用高梁根瘤菌，而用无机氮肥灌浇籽苗，(c)-R-N组，既不用高梁根瘤菌，也不用无机氮肥，而用无氮肥料浇灌。用高梁根瘤菌浇灌的植物在10周内根部发育根瘤。将每只容器中植物减少到3株，将每组中10只容器中的植物用来分析。
9.2.2.大田研究在大田研究中，包膜高梁种子(Feterita菌株)按6.3.2.部分中所述的方法播种。(a)+R-N组，种子如前所述，用高梁根瘤菌悬浮液处理并用无氮肥料浇灌，(b)-R+N组，种子不用高梁根瘤菌处理，而用无机氮肥灌浇，(c)-R-N组，种子既不用高梁根瘤菌，也不施用无机氮肥，仅简单地浇灌无氮肥料。
9.3.形成根瘤高梁的干物质量、氮含量及蛋白质量的分析按6.4.部分所述的方法分析高梁植物的性能。
9.3.1.实验室研究结果收获播种了76-152天后的高梁，按上述分析每株植物的干物质量及氮含量(凯氏定氮法)。
下列高梁的平均干物质量及平均氮含量结果是有用的干物质量氮含量高梁克/100种子%/种子Safra3.7242.32Dabar2.9442.17Feterita3.8401.42不同时间收获的植物数量如下植物组播种76-152天后收获的植物总数+R-N121-R+N62-R-N709.3.2.大田研究的结果大田研究的高梁植物经过一个生长季节后进行收获。如前述分析每株植物的蛋白质量以及氨基酸组成。列在表Ⅳ中的结果清楚地表明，用高梁根瘤菌处理过的植物无论比用氮肥处理的组(-R+N)或用无氮肥料处理的组(-R-N)都含有更高的蛋白质量。
氨基酸组成分析表明，用根瘤菌处理的植物和施加氮肥的植物具有相同的氨基酸组成，但在用根瘤菌处理的植物中的色氨酸和亮氨酸似乎有所提高。
表Ⅳ高梁的蛋白质含量植物每株植物种子的蛋白质含量+R-N34-52%-R+N16%-R-N 4%＊＊由于-R-N组在14周后就死亡，所以没有获得种子。植物的氮含量和蛋白质含量如上述测定。
10.实例使水稻形成根瘤的水稻根瘤菌(RhizobiumOryzae)使水稻形成根瘤的水稻根瘤菌是按第6部分所述而制备的。先用草木犀根瘤菌(R.meliloti)与豇豆银合欢根瘤菌杂交以产生F1转导结合体，然后将它再和三叶草根瘤菌杂交，生成的水稻根瘤菌用於使水稻形成根瘤。
10.1.水稻根瘤菌的制备为制备水稻根瘤菌，要用下列亲代根瘤菌来制备F1转导结合体乳白色菌落(a)草木犀根瘤菌，由在Victoria附近发现的草木犀分离得到，(b)豇豆银合欢根瘤菌，由在新几内亚、巴布亚的热带树银合欢(属于蝶形花科族)分离得到。
亲代根瘤菌在如前述的琼脂介质上进行交错划线培养。用于介质中的豆科植物提取物分别是由紫苜蓿、银合欢的叶子获得。由草木犀根瘤菌形成的菌落具有特征的黄棕色而由豇豆银合欢根瘤菌形成的菌落则有特征的棕灰色。
按上述方法清洗由乳白色菌落得到的根瘤菌F1转导结合体并用在Randers发现的红三叶草分离得到的三叶草根瘤菌菌株交错划线培养。用在介质中的豆科植物提取物是由紫苜蓿、银合欢和红三叶草的叶子获得的。由F1转导结合体形成的菌落是乳白色的而由三叶草根瘤菌形成的菌落则有特征的淡棕色。
将由在划线中间得到的雪白菌落获得的根瘤菌F2转导结合体，这里也称水稻根瘤菌，按上述清洗、分离。将F2转导结合体用於使水稻形成根瘤。
10.2.用水稻根瘤菌使水稻形成根瘤将稻种在前述的、含有3%硫酸钙和低于10%的用於产生水稻根瘤菌的豆科植物提取物的溶液中，浸渍三次。用以包膜种子的豆科植物提取物是由紫苜蓿和银合欢及红三叶草的叶子获得的。种子在每次浸渍后，空气干燥，并按下述播种。
10.2.1.大田研究大田研究中，包膜稻种按6.3.2部分所述的方法播种，(a)+R-N组种子，如前述，用水稻根瘤菌的悬浮液处理，并用无氮肥料浇灌，(b)-R+N组种子，不用水稻根瘤菌处理，而用无机氮肥浇灌，(c)-R-N组种子，既不用水稻根瘤菌也不用无机氮肥处理，而只简单地用无氮肥料浇灌。
10.3.形成根瘤水稻的蛋白质及氮含量分析按6.4.部分所述的方法来分析有根瘤水稻的性能。
10.3.1.大田研究的结果在两年半期间，每4个半月收获植物(一年二次)并如前述分析水稻的蛋白质量。
列在表Ⅴ中的结果清楚地表示，用水稻根瘤菌处理的水稻(+R-N)无论比用无机氮肥(-R+N)处理或者未处理的(-R-N)植物都含有更高的蛋白质量表Ⅴ水稻的蛋白质含量植物组每株植物的蛋白质含量+R-N12.0-18%-R+N1.5-3%-R-N0.5-1%11.实例在桉属中用作氮肥的根瘤菌在一种不属於禾本科植物的桉属(桃金娘科)〔Eucalyptus(familyMyrtaceae)〕中观察到用根瘤菌作为氮肥是有正效果的。在试验的两种植物中，蓝桉(E·globulus)在生物量增加方面反应很明显，而没观察到根瘤。
11.1.根瘤菌081324的制备根据第6部分中的方法制备对桉属有效的根瘤菌081324，先将豇豆银合欢根瘤菌和豆科根瘤菌杂交，产生F1转导结合体，然后将它与三叶草根瘤菌杂交，产生的F2转导结合体，菌种081324，用於处理两种桉属植物。这种根瘤菌不感染任何其他本实例中所述的植物。
11.2.用根瘤菌081324处理桉属植物将桉属种子，如前在谷物中所述一样，在豌豆(Pea)、蚕豆(beans)、羽扇豆(lupin)、三叶草(clover)、紫苜蓿(alfalfa)和银合欢(leucaena)的一种豆科植物的提取物中予先萌发。处理过的种子播在粗砂中，而播种没有处理过的种子作为对照。
萌发后，予处理的幼苗用无氮肥料和六个不同的根瘤菌F2转导结合体之一的悬浮液灌浇(+R-N)。萌发后，一组未处理的幼苗施以氮肥(-R+N)而另一组则施加无氮肥料(-R-N)。四周后，用六种根瘤菌中的五种处理的幼苗都死亡，而用根瘤菌081324处理的幼苗则存活。存活的植株分别转移到有土的六升的钵中，土上层是“Fibo”一烧结块，以保存钵的潮湿並防止真菌的生长。钵的底部有孔隙，以便流出过量的水。调节所施加的无氮肥料量，使之不可能有滞留水或细菌的污染。一共有28个钵，14个是+R-N，而另14个是-R+N。14个+R-N是用根瘤菌081324再接种的。
生长四个月之后，+R-N组的桉属植物比+R-N植物多1-2倍的生物量。检查一株-R+N植物，没有发现根瘤。然而，由於根在土壤中生长，因土壤粒子粘到根上，污染了细根，要检测小瘤是很困难的。尽管在这种+R-N桉属植物中不能看到瘤，但结果表明，增加的生物量是由於根瘤菌的固氮作用。
12.实例使芸台属(Brassicas)形成根瘤的根瘤菌R1另一种非禾本科的植物的云台属成员，对根瘤菌处理也起正反应。用根瘤菌R1(010824)处理油菜(rape)(Brassicanapus)导致植物的增长並出现了根瘤。
12.1.根瘤菌R1010824的制备使油菜生成根瘤的根瘤菌R1(010824)是根据第6部分中所述的方法制备的，先将菜豆根瘤菌与豇豆银合欢根瘤菌划线培养产生F1转导结合体，然后将F1转导结合体与三叶草根瘤菌杂交。
12.2.用根瘤菌R1010824处理油菜油菜籽，如前用于谷物所述一样，在一种蚕豆、银合欢、三叶草的豆科植物提取物中予先萌发。将处理过的油菜种子播种在一个2升容器中，萌发后，一组正常施肥(-R+N)，另一组仅施加无氮肥料(-R-N)，第三组也施加无氮肥料，並用六种不同的根瘤菌的菌株处理(+R-N)。3 1/2 月后，-R-N植物只有三个最初的幼叶，而+R-N组植物，用三种标为R4、R5和R6根瘤菌处理，也长得同样不好，然而，用根瘤菌转导结合体之一的，即菌种R1或010824的一组是有益的。用R1 010824处理的植株几乎和最大的-R+N组的植株一样大小，並看到了小根瘤。
13.实例形成根瘤的非豆科植物的总氮含量为证实由本发明的根瘤菌转化体在非豆科植物中诱发的根瘤是有固氮活性。用凯氏定氮法分析植物的有机氮含量。
13.1.材料和方法实验的每种非豆科植物都分成三组(a)一组用根瘤菌转导结合体和无氮肥料处理(+R-N)，(b)第二组施加氮肥，而不用根瘤菌转导结合体处理(-R+N)，而(c)第三组，既不用根瘤菌转导结合体，也不施用氮肥处理(-R-N)。这三组植物在其他条件都一样的情况下在生长室生长，並在直到成熟的整个生长期间收割多次。每个容器中生长3-5株植物。收获时，其苗株都收集在一起。从这些材料中取出一个样品，用于分析总有机氮含量，列于以下各节的结果，证明了形成根瘤的非豆科植物有固氮作用。
13.2.小麦和大麦植物两种小麦，Cornette和Ralle，如前第7部分所述，用小麦根瘤菌形成根瘤。分析了氮含量，以每株植物顶部的毫克氮含量表示，和植物顶部的干物质量。结果列于表Ⅶ表Ⅶ有根瘤小麦的干物质量和氮含量试验1天数毫克/株植物＊+R-N -R+N -R-N(n＝4)(n＝2)(n＝2)30DW56.05±28.590.89±26.339.69±6.3N1.14±0.52.67±0.60.51±050DW120.49±27.8257.56±62.382.61±13.6N2.26±0.33.99±1.40.66±0.364DW244.78±21.8331.99±5.872.21±8.7N3.03±0.35.01±0.40.44±0.176DW314.38±112.5400.64±83.2117.53±44.6N4.28±1.36.56±2.10.69±0.297DW431.47±68.5666.71±60.3117.0±54.2N5.19±0.77.52±1.40.6±0.2115DW523.49±38.6668.55±113.482.96±3.2N5.98±1.29.94±3.50.42±0.1
(续)试验1天数毫克/株植物＊+R-N -R+N -R-N(n＝4)(n＝2)(n＝2)124DW565.11±23.2700.77±79.4113.94±12.3N8.15±0.411.43±1.90.67±0试验2+R-N-R+N-R-N(n＝4)(n＝2)(n＝2)54DW158.85±36.3304.91±72.390.30±12.4N3.59±0.57.46±0.80.51±0.171DW447.88±83.1705.64±37.089.54±23.0N6.28±1.212.48±1.90.54±0.280DW513.37±120.7871.57±205.5117.04±2.6N7.61±1.112.15±2.40.71±0.192DW903.53±25.61128.85±166.4131.18±11.8N11.81±0.4514.56±1.890.72±0.1＊DW＝干物质量实验1的植物是生长在次优的光照条件下。
表Ⅶ中的结果表明，+R-N植物的干物质量约为-R+N组植物的82%，而+R-N组植物的氮含量约为-R+N植物的80%。
5种大麦，Jenny、Taarn、Lina、Grith和Triumph，如前第8部分所述，用大麦根瘤菌形成根瘤。分析氮含量，以每株植物顶部的毫克氮含量表示，並分析植物顶部的干物质量。结果列于表Ⅷ。
表Ⅷ生有根瘤大麦的氮含量和干物质量试验1天数毫克/植株＊+R-N -R+N -R-N(n＝10)(n＝5)(n＝5)31DW43.85±9.271.84±21.719.15±5.2N0.99±0.22.15±0.90.27±0.150DW121.53±28.7224.95±44.535.40±4.2N2.56±0.54.03±1.30.41±0.164DW198.41±50.7269.92±36.841.87±7.1N2.61±0.54.05±1.10.35±0.176DW301.04±56.1296.76±76.949.58±4.8N4.09±0.65.22±2.90.61±0.396DW499.23±106.9506.33±106.555.19±15.7N5.34±1.49.90±1.20.35±0.1123DW535.47±123.7556.38±124.364.10±11.55.55±1.110.34±3.70.44±0.1试验2+R-N-R+N-R-N(n＝6)(n＝3)(n＝3)54DW118.89±20.6264.84±38.449.76±11.8N3.30±0.47.78±0.70.45±0.1
(续)试验2天数毫克/植株＊+R-N -R+N -R-N(n＝6)(n＝3)(n＝3)71DW313.06±46.1405.53±120.853.49±9.9N5.81±0.67.78±0.80.41±0.180DW711.29±279.6617.75±94.368.42±2.6N7.85±1.210.26±2.40.53±0.192DW802.30±147.3837.08±196.457.07±19.5N10.08±1.611.99±1.60.46±0.2＊DW＝干物质量用根瘤菌形成根瘤的大麦植物与施用正常氮肥的植物长得同样大小，並有同样的干物质量。+R-N大麦的含氮量约为-R+N植物的83%，而为-R-N植物含氮量的20倍。在-R-N植物分析的氮含量是由种子测得的，在生长期间並没有增加氮量。
显然，根瘤菌的转导结合体作为氮肥取代物的有效性是由于75%的植物上长有小根瘤的作用。因为每个容器中生长3-5个植株，不可能将根分开並仅分析有根瘤的植株。考虑到100%的植物形成根瘤，並长成大根瘤的则作用会更有效。
为了排除这样的可能性，即+R-N，长有根瘤的非豆科植物使用了根瘤菌接种物或细菌，而这些接种物和细菌在以后可能在容器中增生而作为氮源，进行了下列实验将小麦Cornette和大麦Taarn各用豆科根瘤菌菌株M1接种，所用的方法、量和条件都与这些非豆科植物分别用根瘤菌转导结合体、小麦根瘤菌或大麦根瘤菌接种中所述一样。用豆科植物根瘤菌接种的植物施以无氮肥料，氮的累积量与-R-N植物的比较。用豆科根瘤菌接种的植物和-R-N植物都无氮的积累。得出的结论是一种非专一性的细菌接种物，因此，不用给植物施加氮肥。相反，在表Ⅶ和表Ⅷ中所示的，发生在对各用小麦根瘤菌或大麦根瘤菌形成根瘤的反应所积累的氮量，一定是由于固氮作用引起的。
13.3.高梁和水稻植物三种高梁，Dabar、Safra和Feterita，如前第9部分所述，使用高梁根瘤菌形成根瘤。分析氮含量，以每株植物顶部的毫克量氮表示，和植物顶部的干物质量，结果示於表Ⅸ中表Ⅸ形成根瘤高梁的干物质量和氮含量天数毫克/植物＊+R-N -R+N -R-N(n＝6)(n＝3)(n＝3)30DW38.83±10.149.60±22.525.60±4.2N0.40±0.11.42±0.70.26±059DW102.93±15.2329.51±87.742.84±8.0N1.00±0.25.93±2.30.31±080DW179.84±62.2602.34±44.943.77±21.5N2.00±0.89.86±2.70.31±0101DW439.83±95.8576.18±75.453.71±12.4N4.40±0.911.02±0.90.31±0125DW1242.94±391.41198.99±596.056.76±7.8N11.65±2.412.44±6.80.27±0＊DW＝干物质量水稻的M-201菌种如前第10部分所述的，使用水稻根瘤菌形成根瘤。分析氮含量，以每株植物顶部的毫克氮含量表示，和植物顶部的干物质量，结果示於表Ⅹ中表Ⅹ有根瘤小麦的干物质量和氮含量天数毫克/植物+R-N-R+N-R-N62DW32.2848.8723.44N0.321.100.1674DW48.0494.7321.63N1.152.650.1698DW107.47115.4029.9N2.913.450.36128DW174.89130.8322.16N5.164.330.38＊DW＝干物质量结果表明，+R-N植物积累的干物质量最初低於-R+N植物，然而，在实验的后期，由+R-N积累的干物质量与-R+N植物相等，而且还可以超过。+R-N植物含氮的积累量和-R+N植物似乎相同。
13.4.油菜两种油菜，Hanna和Topas，如前第12部分所述，使用根瘤菌010824形成根瘤，分析氮含量，以每株植物顶部的毫克氮含量表示，和植物顶部的干物质量，结果示於表Ⅺ
表Ⅺ形成根瘤的油菜的干物质量和氮含量天数毫克/植株＊+R-N -R+N -R-N47DW67.25±17.4344.91±31.69.71±0.2N0.89±0.36.71±0.10.22±0.259DW99.40±14.3477.07±62.813.90±4.5N1.64±0.47.03±0.20.11±0.173DW248.56±24.3766.47±72.714.92±9.9N2.00±0.710.25±1.90.10±0.0498DW424.80±72.5704.73±12.11±7.9N3.42±1.117.66±5.10.10±0.05110DW547.37±22.21049.77±388.617.86±12.1N5.73±1.924.33±7.90.26±0.2129DW1013.59±241.81955.60±330.015.39±6.0N10.24±0.933.21±8.60.16±0.09147DW2231.55NDNDN16.66NDND＊DW＝干物质量n＝每个样品4个植株ND＝未测结果表明+R-N植物的干物质量的累积量约为-R+N植物的50%，而+R-N植物的含氮量约为-R+N植物的30%。虽然累积量低於施加氮肥的植物，但在油菜植株中观察到的小根瘤说明有根瘤的植物在没有氮肥的情况下也能生长成活。(比较+R-N植物与-R-N植物的结果，其中-R-N植物既无干物质量又无氮素积累)。
14.微生物的保藏下列根瘤菌已经保藏在美国典型培养物收集中心〔AmericanTypeCutfureCollection(ATCC)〕，Rockville，MD，並以下列保藏号注册根瘤菌保藏号小麦根瘤菌(R·tritici)53407大麦根瘤菌(R·hordei)53404高梁根瘤菌(R·Sorghi)53405水稻根瘤菌(R·Oryzae)53406R1(010824)根瘤菌本发明不限於保藏的微生物的范围，因为保藏的具体事打算作为发明的一个单独说明，而且功能上相等的任何微生物都是在本发明的范围内。实际上，除了本发明所列出的和描述的以外，各种改变，从说明书和附图的技术来看，对本领域的专业人员都是显而易见的，这些改变也都落在所附的权利要求
范围内。
权利要求
1.一种在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化体。
2.权利要求
1的根瘤菌转化体，还包括转导结合体。
3.权利要求
1的根瘤菌转化体，其特征为在与一种非豆科宿主共生体进入共生前，在营养介质上培养形成雪白的菌落，该营养基除了生长所必需的营养外，还有根瘤菌转化株的每种亲代根瘤菌的每个豆科宿主共生体的提取物。
4.权利要求
1的根瘤菌转化体，其特征为在与非豆科宿主共生体进入共生后，在营养介质上培养时形成灰色菌落，该营养介质中除了生长必要的营养外，还含有根瘤菌转化体的每个亲代根瘤菌种每个豆科宿主共生体的提取物和根瘤菌转化体的非豆科宿主共生体的提取物。
5.权利要求
1的根瘤菌转化体，能在属于禾本科(Poaeceae)的一种非豆科植物中共生固氮。
6.权利要求
5的根瘤菌转化体，能在小麦中共生固氮。
7.权利要求
6的根瘤菌转化体，能在小麦Anja品种中共生固氮。
8.权利要求
6的根瘤菌转化体，能在小麦Kraka品种中共生固氮。
9.权利要求
6的根瘤菌转化体，能在小麦Vuka品种中共生固氮。
10.权利要求
5的根瘤菌转化体，能在大麦中共生固氮。
11.权利要求
10的根瘤菌转化体，能在大麦Hasso品种中共生固氮。
12.权利要求
10的根瘤菌转化体，能在大麦Cerise品种中共生固氮。
13.权利要求
10的根瘤菌转化体，能在大麦Harry品种中共生固氮。
14.权利要求
10的根瘤菌转化体，能在大麦Igri品种中共生固氮。
15.权利要求
5的根瘤菌转化体，能在高梁中共生固氮。
16.权利要求
15的根瘤菌转化体，能在高梁Safra品种中共生固氮。
17.权利要求
15的根瘤菌转化体，能在高梁Dabar品种中共生固氮。
18.权利要求
15的根瘤菌转化体，能在高梁Fcterita品种中共生固氮。
19.权利要求
5的根瘤菌转化体，能在水稻中共生固氮。
20.权利要求
1的根瘤菌转化体，能在属于芸台(Brass-ica)科的一种非豆科植物中共生固氮。
21.权利要求
20的根瘤菌转化体，能在油菜中共生固氮。
22.小麦根瘤菌(R·tritici)，保藏在ATCC中，保藏号为53407，或突变体、重组体或其遗传工程的衍生物。
23.大麦根瘤菌(R·hordei)，保藏在ATCC中，保藏号为53404，或突变体、重组体或其遗传工程的衍生物。
24.高梁根瘤菌(R·Sorghi)、保藏在ATCC中，保藏号为53405，或突变体、重组体或其遗传工程的衍生物。
25.水稻根瘤菌(R·Oryzae)，保藏在ATCC中，保藏号为53406，或突变体、重组体或其遗传工程的衍生物。
26.R1(010824)根瘤菌，保藏在ATCC中，保藏号为，或突变体、重组体或其遗传工程的衍生物。
27.一种用于处理非豆科植物种子的材料，包括在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化体的每种亲代根瘤菌的豆科宿主共生体的豆科植物提取物。
28.一种用于处理非豆科植物种子的材料，包括来自在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化体的每种亲代根瘤菌的豆科宿主共生体的豆科植物提取物的层析组分。
29.一种用於处理非豆科植物种子的材料，包括来自在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化体的每种亲代根瘤菌的豆科宿主共生体的豆科植物提取物的晶体。
30.根据权利要求
27、28或29中处理非豆科植物种子的材料，其中还包括在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化体。
31.用于处理非豆科植物种子的一种材料，包括和权利要求
27、28或29的材料有关的一种蛋白质。
32.根据权利要求
31的用於处理非豆科植物种子的一种材料，其中还包括在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌转化体。
33.一种用对根瘤菌转化体专一的材料处理的非豆科植物种子，该根瘤菌转化体能在由非豆科种子萌发的非豆科植株中共生固氮，其中所用的材料包括(a)根瘤菌转化体的每个亲代根瘤菌的豆科宿主共生体的豆科植物提取物，(b)每种豆科植物提取物的层析组分，(c)来自每种豆科植物提取物的层析组分的晶体，或(d)一种蛋白质或和每种豆科提取物有关的蛋白质。
34.根据权利要求
33处理非豆科植物种子，其中的材料还包括在从非豆科植物种子萌发的非豆科植物中共生固氮用的根瘤菌转化体。
35.权利要求
33的非豆科植物种子，包括来自属于禾本科(Poaeceae)的一种非豆科植物种子。
36.权利要求
35的非豆科植物种子，包括小麦种子。
37.权利要求
36的小麦种子，包括Anja小麦品种。
38.权利要求
36的小麦种子，包括Kraka小麦品种。
39.权利要求
36的小麦种子，包括Vuka小麦品种。
40.权利要求
35的非豆科种子，包括大麦种子。
41.权利要求
40的大麦种子，包括Hasso大麦品种。
42.权利要求
40的大麦种子，包括Cerise大麦品种。
43.权利要求
40的大麦种子，包括Harry大麦品种。
44.权利要求
40的大麦种子，包括Igri大麦品种。
45.权利要求
35的非豆科植物种子，包括高梁种子。
46.权利要求
45的高梁种子，包括Safra高梁品种。
47.权利要求
45的高梁种子，包括Dabar高梁品种。
48.权利要求
45的高梁种子，包括Feterita高梁品种。
49.权利要求
35的非豆科植物种子，包括水稻种子。
50.权利要求
35的非豆科植物种子，包括芸苔科(Brassica)种子。
51.权利要求
49的云苔科种子，包括油菜种子。
52.一种由根瘤菌转化体形成根瘤的非豆科植物，该根瘤菌转化体能在非豆科植物中共生固氮。
53.权利要求
52的非豆科植物，使用在非豆科植物中能共生固氮的根瘤菌转导结合体形成根瘤。
54.权利要求
52的非豆科植物，包括禾本科(Poaeceae)的成员。
55.权利要求
54的非豆科植物，包括小麦植物。
56.权利要求
55的小麦植物，包括Anja品种。
57.权利要求
55的小麦植物，包括Kraka品种。
58.权利要求
55的小麦植物，包括Vuka品种。
59.权利要求
54的非豆科植物，包括大麦植物。
60.权利要求
59的大麦植物，包括Hasso品种。
61.权利要求
59的大麦植物，包括Cerise品种。
62.权利要求
59的大麦植物，包括Harry品种。
63.权利要求
59的大麦植物，包括Igri品种。
64.权利要求
54的非豆科植物，包括高梁植物。
65.权利要求
64的高梁植物，包括Safra品种。
66.权利要求
64的高梁植物，包括Dabar品种。
67.权利要求
64的高梁植物，包括Feterita品种。
68.权利要求
54的非豆科植物，包括水稻植物。
69.权利要求
54的非豆科植物，包括芸台科植物。
70.权利要求
69的芸台科植物，包括油菜植物。
71.在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌F2转化结合体的制备方法，包括(a)在固体营养基上，将第一种根瘤菌亲代和第二种根瘤菌亲代交错划线培养，所用培养介质除了含有生长必要的营养以外，还含有(ⅰ)每种亲代根瘤菌的豆科宿主共生体的非变性提取物，或(ⅱ)来自每种亲代根瘤菌的豆科宿主共生体的非变性提取物的层析组分，或(ⅲ)由每种亲代根瘤菌的豆科宿主共生体的非变性提取物层析组分得到的晶体，或(ⅳ)和提取物、层析组分或晶体有关的蛋白质，(b)在约18至约30℃温度下，培养根瘤菌亲代，以至使根瘤菌亲代形成一种具有特征颜色的菌落，(c)选择生长在根瘤菌亲代菌落中间的乳白色菌落的根瘤菌F1转导结合体，(d)将根瘤菌F1转导结合体与第三个根瘤菌亲代在培养基上交错划线培养，培养基除了含有(a)步中所含的营养外，还含有一种豆科植物提取物、层析组分、结晶体或第三种根瘤菌亲代的蛋白质，和(e)在约18℃至约30℃的温度下，培养根瘤F1转导结合体和第三种根瘤菌亲代以至根瘤菌形成菌落，(f)选择生长在根瘤菌F1转导结合体和第三种根瘤菌亲代之间的一种根瘤菌F2转导结合体的雪白色菌落。
72.根据权利要求
71的方法，其中第三种根瘤菌亲代包括一种第三种根瘤菌品种，第二种根瘤菌F1转导结合体或第二种根瘤菌F2转导结合体。
专利摘要
本发明是涉及在非豆科植物中形成根瘤固氮的根瘤菌转化体。长有根瘤的非豆科植物能在无氮肥料中生长，并比其施加氮肥的无根瘤的对应物有更高的蛋白质含量、干物质量和氮含量，有根瘤的非豆科植物收获后留下的秸杆也有高的蛋白质含量。
文档编号A01G1/00GK86107988SQ86107988
公开日1987年12月2日 申请日期1986年12月30日
发明者斯文—埃里克·尼尔森, 格雷特·莫奇·塞伦森 申请人:斯文-埃里克·尼尔森, 格雷特·莫奇·塞伦森