专利名称：水稻等植物结生固氮根瘤的方法
技术领域：
本发明属于水稻、玉米、小麦、油菜、棉花等植物结生固氮根瘤的方法。可用来培育水稻等作物的带有根瘤菌的固氮良种和培育优良的根瘤菌株。适用于固氮良种公司、良种繁殖场及根瘤菌肥厂。
现有技术，水稻、玉米、小麦、油菜、棉花等非豆科植物其生长后期必须追加适量氮肥，既需要生产大量合成氨而消耗无数煤资源并造成环境污染。又因后期追肥难，追肥不好出现倒伏，诱发病虫害，反而带来农业减产。豆科植物的共生固氮根瘤菌能否转移到水稻等非豆科植物上来，是当今世界生物固氮研究者一大目标。植物根瘤的共生固氮作用是根瘤菌和豆科植物协同作用的结果。豆科植物共生固氮根瘤是根瘤菌和宿主豆科植物两者基因表达的结果。多数快生型根瘤菌的这些基因定位于根瘤菌的共生质粒上，虽然根瘤菌的共生质粒可以从一种根瘤菌转移到另一种根瘤菌，从而使后者能识别前者的宿主植物，但至今，还没有将根瘤菌共生固氮范围扩大到非豆科植物上。根瘤菌在非豆科植物上结瘤固氮的唯一例子是在澳大利亚的某一树种上，但这种条件至今不明。近年来，英国人在实验室内用酶法去除水稻、小麦根毛的细胞壁，也可使根瘤菌在这些植物根上结瘤，但不能固氮，在油菜上结瘤，有微弱的固氮活性，这种处理方法在农业生产上没有应用前景。几年前，丹麦人声称用根瘤菌转化子能在非豆科植物小麦、大麦、高粱、水稻等植物上结瘤，并测出植株含氮量增加，已申请了专利。〔专利申请号PCT/DK86/00137〕本发明目的是提供一种能克服上述缺陷的技术方案将根瘤菌共生固氮范围扩大到水稻等非豆科植物上来，不仅在固氮分子生物学理论上有重要意义，而且在农业生产上具有很大的经济效益。
为实现上述目的，本发明所提供的技术内容是，水稻等植物结生固氮根瘤的方法，其具体操作步骤是(一)选高效固氮的豆科植物种子。对水稻、玉米、小麦、油菜、棉花等植物，最好选用紫苜蓿或田菁种子。(二)对水稻等非豆科植物进行品种杂交，获得优良的杂交品种。(三)播种水稻等杂交品种和豆科植物种子，同步开花。(四)用豆科植物花粉加花粉培养液对水稻等杂交品种进行诱变杂交，获得带有豆科植物的根瘤菌能识别的因子的水稻等突变种子。得率约5×10-4～2×10-4。最好采用紫苜宿花粉或田菁花粉，采用花朵∶作物种子的最佳比例为3～4∶1。最好加花粉特殊培养液(即磷酸二氢钾600倍液加微量钼酸钠、硼酸等)2～3份。(五)播种突变种子，并接种相应豆科植物根瘤菌，结生出水稻等共生固氮根瘤，结瘤率为10～60%。从上述根瘤中分离作物本身根瘤菌，重复回接，结瘤率可达70～90%、对水稻、玉米、小麦、油菜、棉花等植物结生根瘤，最好在幼苗时接种紫苜蓿或田菁根瘤菌。(六)从水稻等植物根瘤分离和纯化根瘤菌，回接到水稻等作物，其中最好采用特殊培养基进行接种，重复回接数次，获得水稻等植物优良根瘤菌株和带根瘤菌的水稻等作物的固氮良种。
本发明的验证如下所述(一)水稻等植物上结了典型根瘤。(附
图1是二叶期水稻秧苗上的固氮根瘤，图2是水稻根系上的固氮根瘤)经电镜观察瘤内有根瘤菌类菌体存在。其结构与豆科植物的相似。(附图3是水稻根瘤电镜照片，附图4是供对照的豆科植物紫云英根瘤电镜照片)(二)用气相色谱片测得水稻根瘤有乙块还原峰，(附图5是气相识谱乙块还原图谱，a为水稻根瘤、b为田菁根瘤)说明根瘤内有固氮酶存在，虽然固氮活性较典型豆科植物根瘤低几十倍，但比联合固氮植物高几倍到十几倍。
(三)接种本发明的根瘤菌剂的水稻根系含氮量比同样条件下不接种菌剂的水稻根系含氮量提高2-8倍。(表一)(四)从水稻根瘤中分离出的细菌做DNA杂交，发现这种细菌中有固氮酶的结构基因同源序列存在。
(五)大田试验的初步结果表明，接种该发明的根瘤菌剂的水稻比不接种的对照水稻增产10-20%(表二)。
试验表明，按照发明的方法其优点是，水稻等共生固氮根瘤菌剂经过示范应用，结果增产显著。水稻大面积栽培使其结生根瘤的，增产10-21%(后附表二)，玉米小区栽培，增产20%，小麦、油菜增产20-30%，棉花增产25%。按照发明方法的另一个优点是，水稻等作物结生固氮根瘤后可免用后期追肥，节约尿素每亩10-15公斤。中国耕地面积16亿亩，全世界当有更多的耕地面积，意义重大，又生产一吨合成氨要化两吨半标准煤，这对节约能源，减少环境污染所获的效益更大。
实验得出的最佳实施例如下所述(一)选田菁种子。
(二)对水稻进行品种杂交，获优良杂交品种。
(三)播种水稻杂交品种和田菁种子，同步开花。
(四)当水稻开花时，采用田菁临开花的花朵，(花朵∶水稻颖谷数量为3～4∶1)用研钵研细，加花粉特殊培养液(即磷酸二氢钾600倍液加微量钼酸钠、硼酸等)2～3份，搅拌后对水稻进行远缘杂交，获得杂交种子，得率为5×10-4～2×10-4。
(五)将上述远缘杂交种子播种，在幼苗时，接种田菁根瘤菌，尔后，结生水稻共生固氮根瘤，结瘤率为10-60%，从上述根瘤中分离根瘤菌，重复回接，结瘤率可达90%。
(六)用特殊培养基接种，从水稻根瘤分离和纯化根瘤菌，回接作物，连续数次，获得带根瘤菌的水稻固氮良种和水稻优良田菁根瘤菌株。
附件1水稻根瘤菌固氮三次固氮活性的测定
表一
权利要求
1.一种水稻等植物结生固氮根瘤的方法，其特征是，具体操作步骤包括有(一)选高效固氮的豆科植物种子，(二)对水稻等非豆科植物进行品种杂交，获得优良杂交品种，(三)播种水稻等杂交品种和豆科植物种子，同步开花，(四)用豆科植物花粉加花粉培养液对水稻等杂交品种进行诱变杂交，获得带有豆科植物的根瘤菌能识别的因子的水稻等突变种子，得率约5×10-4-2×10-4，(五)播种突变种子，并接种相应的豆科植物根瘤菌，结生出水稻等固氮根瘤，结瘤率可为10-60%，从上述根瘤中分离作物本身根瘤菌，重复回接，结瘤率可达70-90%，(六)从水稻等根瘤分离和纯化根瘤菌，回接到水稻等作物，重复数次，得水稻等优良根瘤菌株和带根瘤菌的水稻等固氮良种。
2.按权利要求1的方法，其特征是，最好选紫苜蓿或田菁及其根瘤菌作为水稻、小麦、玉米、油菜、棉花等作物共生固氮根瘤菌的原菌种。
3.按权利要求1的方法，其特征是，最好加花粉特殊培养液(即磷酸二氢钾600倍液加微量钼酸钠，硼酸等)2～3份。
4.按权利要求书2的方法，其特征是，紫苜蓿或田菁花朵作物颖谷的最佳比例是3～4∶1。
5.按权利要求2的方法，其特征是，最好在水稻等幼苗时，接种紫苜蓿或田菁根瘤菌。
6.按权利要求2的方法，其特征是，最好用特殊培养基，从水稻等根瘤分离和纯化根瘤菌，进行再接种。
全文摘要
一种水稻等植物结生固氮根瘤的方法。适用于固氮良种公司，良种繁殖场及根瘤菌肥厂。该法扩大了根瘤菌的宿主范围。用豆科植物花粉加花粉培养液和水稻等作物远缘杂交，使水稻等亲和根瘤菌共生，经分离和纯化，最后得带根瘤菌的水稻等固氮良种和优良根瘤菌株。该法所获根瘤菌剂经示范应用，结果增产显著，水稻一般可增产10-21％，并能免用后期追肥，节约尿素每亩10～15公斤，既节约能源又净化环境。
文档编号A01G16/00GK1056215SQ90102499
公开日1991年11月20日 申请日期1990年5月4日 优先权日1990年5月4日
发明者金国华, 荆玉祥, 陈旭眉, 李广善 申请人:浙江省瓯海县农业生产资料公司, 中国科学院植物研究所