氮应答性早期根瘤素基因的制作方法

专利名称：氮应答性早期根瘤素基因的制作方法
氮应答性早期根瘤素基因相关申请的交叉引用本申请要求提交于2008年9月25日的美国临时专利申请No. 61/099，％4的优先权，将其整体并入本文。
技术领域：
本发明总的涉及调节植物特征(例如氮使用效率(NUE))的组合物及方法。背景技术：
在下一个50年内，由多种因素(包括增加的人群，每人使用的作物的增加，及许多环境问题)的组合将对世界作物生产产生显著压力。给定当前趋势，在此时期将必要大致双倍世界产率，及付出显著的努力应对此经济上及环境上可持续的样式的挑战(Rothstein SJ Plant Cell 2007,19 =2695-2699) 0氮是植物生长的必要的元素，及被认为是水缺乏后植物产率的主要控制因子(Lea PJ, Morot-Gaudry J-F Plant nitrogen, 2001, Springer, Berlin London)。高产率作物的产率相关于大量的氮肥料的应用。这些大的氮输入目前被估计在90百万公吨，及成为世界作物产生的主要成本(Frink CR, et ah, PNAS 1999,96 1175-1180)。但是，合并入农业作物的氮罕见超过施加的氮的40%，表明氮利用中严重的 ^ (Raun WR, Johnson GV Agronomy Journal 1999,91 :357-363 ；Glass ADM Critical Reviews in Plant Sciences 2003，22 :453-470)。因此，有开发有改善的氮使用效率(NUE) 的作物的紧急需要。植物生命循环中有氮使用的2个主要阶段。第一是植物性阶段，当多数涉及氮同化时。第二是繁殖阶段，当涉及氮同化及再活动时。在测量NUE中，已经数年开发出几种定义及评估方法，那些之一是生物质或谷粒产率对比供给的氮量(Good AG, et al, Trends Plant Sci2004,9 :597-605)。一般而言，此NUE可进一步分为2部分，一种是同化效率，及其他是利用效率。为评定植物对氮的应答的分子基础及为鉴定氮-应答性基因，几个氮应答的研究已采用拟南芥的微阵列基因表达谱(Wang R，et al.，Plant Cell 2000，12 1491-1509 ; Wang RC, et al. ， Plant Physiology2003,132 :556-567 ；Price J, et al. ， Plant Cell 2004,16 :2128-2150 ；Scheible WR,et al. ,Plant Physiology 2004,136 :2483-2499)。其他研究研究了在慢性氮应激下的拟南芥的氮-应答性基因，以及该基因的短及长期氮利用度增加后瞬时的转录变化(Bi YM, et al.，BMCGenomics 2007,8 :281)。而且，将用于拟南芥的指定的氮土壤生长系统(Bi YM, et al.，Plant Journal 2005,44 :680-692)用于分离 NLA基因，其控制拟南芥对氮限制的适应性，及用于鉴定涉及氮应答的额外的基因(Peng Μ, et al. ,Plant J 2007' ,50 :320-337 ；Peng MS，et al. ,Plant Molecular Biology 2007， 65 :775-797)。也已在番茄根(Wang YH, et al. ,Plant Physiol 2001,127 :345-359)及稻幼苗(Lian X，et al. ,Plant Mol Biol 2006,60 :617-631)中进行对氮-应答性基因的研
尽管已从以上研究鉴定许多氮-应答性基因，至于如何使用此知识来操作基因表达以使植物更有效使用氮的报道一直以来缺少。为应对此需要，本发明提供氮应答性早期根瘤素基因(L0C_0s06g05010)，称为0sEN0D93，及过表达此氮应答性早期根瘤素基因的植物，其显示增加的NUE，包括增加的籽产率，应激耐受性，硝酸盐水平及氨基酸水平。也提供制备所述植物的方法，或者，使用氮应答性早期根瘤素基因的活化剂模拟过表达表型的方法。仍还提供了在公开的方法中有用的分离的核酸及蛋白。发明概述本发明提供分离的0sEN0D93核酸及蛋白，表达公开的核酸的载体及细胞，及特异性地结合公开的蛋白的抗体。本发明的代表性的0sEN0D93核酸包括如下核酸，所述核酸包括(a) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO=I的互补序列在严格杂交条件下特异性地杂交的核酸；(c) SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；(d)与SEQ ID NO :2的互补序列在严格杂交条件下特异性地杂交的核酸；(e)核苷酸序列，其编码包括SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白；及(f)互补于(a) (e)的核酸的核苷酸序列。附加地， 本发明的代表性的0sEN0D93核酸包括如下核酸，所述核酸包括(a)至少为80%同于SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)至少为80%同于SEQ ID NO 2的核苷酸序列；及，(c)编码包括至少为80%同于SEQ ID N0:3的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白的核苷酸序列。本发明的代表性的0sEN0D93蛋白包括如下蛋白，所述蛋白包括(a)至少80%同于SEQ ID NO 3的氨基酸序列；及(b)SEQ ID NO 3的氨基酸序列。也提供0sEN0D93过表达植物，包括单子叶及双子叶植物，及使用本文中公开的0sEN0D93基因的核苷酸序列产生所述植物的方法。0sEN0D93植物的特征在于增加的 0sEN0D93的表达及增加的氮使用效率。还提供了鉴定0sEN0D93结合剂及活化剂的方法。在本发明的一方面，方法可包括(a)提供0sEN0D93蛋白；(b)使0sEN0D93蛋白与一或多种测试试剂或对照试剂在对于结合而言足够的条件下接触；(c)测定测试试剂与分离的0sEN0D93蛋白的结合；及(d)选择展示特异性结合0sEN0D93蛋白的测试试剂。在本发明的另一方面，方法可包括(a)提供表达0sEN0D93蛋白的细胞；(b)使细胞与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定 0sEN0D93基因的表达；及(d)选择当相比对照试剂与测试试剂接触时诱导基因的升高的表达的测试试剂。在本发明的另一方面，方法可包括(a)提供表达0sEN0D93蛋白的植物；(b) 使植物与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定植物的硝酸盐含量，氮摄取，侧根生长，氨基酸含量，籽产率，或生物质；及(d)选择当相比对照试剂与测试试剂接触时诱导增加的硝酸盐含量，增加的硝酸盐摄取，增加的侧根生长，籽产率，和/或增加的生物质的测试试齐Ll。仍还提供了鉴定植物的0sEN0D93的增强剂的方法包括(a)提供表达0sEN0D93 蛋白的细胞；(b)使细胞与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定0sEN0D93靶基因的表达；及(d)选择当相比对照试剂与测试试剂接触时诱导基因的升高的表达的测试试剂，该基因正常经历0sEN0D93诱导。在本发明的另一方面，方法可包括(a)提供表达 0sEN0D93蛋白的植物；(b)使植物与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定植物的硝酸盐含量，氮摄取，侧根生长，氨基酸含量，籽产率，或生物质；及(d)选择当相比对照试剂与测试试剂接触时诱导增加的硝酸盐含量，增加的硝酸盐摄取，增加的侧根生长，籽产率，和/或增加的生物质的测试试剂。也提供使用根据本文中公开的方法鉴定的0sEN0D93结合剂及活化剂改良植物产率的方法。

图IA显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物中的平均芽干重 (士 SD，η = 3 5)。图IB显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物中的平均根干重 (士 SD，η = 3 5)。图IC显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物中的如以干重所测的平均芽根比(士SD，n = 3 5)。图ID显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物中的平均叶绿素含量(士 SD，n = 3 幻，表示为mg/g(鲜重)植物。图IE显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物中的平均花青苷含量(士SD，η = 3 5)，表示为单元/g (鲜重)植物。图2A显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物中的芽中的平均硝酸盐含量(士 SD，n = 3 幻，表示为mg/g (鲜重)植物。图2B显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物中的根中的平均硝酸盐含量(士 SD，n = 3 幻，表示为mg/g (鲜重)植物。图2C显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物中的芽中的平均总氨基酸(士 SD，n = 3 5)，表示为ymol mol/g (鲜重)植物。图2D显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物中的根中的平均总氨基酸(士 SD，n = 3 5)，表示为ymol mol/g (鲜重)植物。图2E显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物中的芽中的平均总可溶性蛋白(士 SD，n = 3 5)，表示为mg/g (鲜重)植物。图2F显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物中的根中的平均总可溶性蛋白(士 SD，n = 3 5)，表示为mg/g (鲜重)植物。图2G显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物中的芽中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示为植物干重的百分率。图2Η显示在lmM，5mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物中的根中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示为植物干重的百分率。图3Α显示在ImM硝酸盐中生长观天的野生型植物及在ImM硝酸盐中生长观天、 然后是在IOmM硝酸盐中生长2小时(诱导)的植物中芽中的平均硝酸盐含量(士SD，η = 3 5)，表示为mg/g (鲜重)植物。图;3B显示在ImM硝酸盐中生长28天的野生型植物及在ImM硝酸盐中生长28天、 然后是在IOmM硝酸盐中生长2小时(诱导)的植物中根中的平均硝酸盐含量(士SD，η = 3 5)，表示为mg/g (鲜重)植物。图3C显示在IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物及在IOmM硝酸盐中生长观天、然后是在ImM硝酸盐中生长2小时(降低)的植物中芽中的平均硝酸盐含量(士SD，η=3 5)，表示为mg/g (鲜重)植物。图3D显示在IOmM硝酸盐中生长28天的野生型植物及在IOmM硝酸盐中生长28 天、然后是在ImM硝酸盐中生长2小时(降低)的植物中根中的平均硝酸盐含量(士SD，η =3 5)，表示为mg/g (鲜重)植物。图4A显示在IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物及在IOmM硝酸盐中生长观天，在ImM硝酸盐中生长观天，在IOmM硝酸盐中、然后是在ImM硝酸盐中生长2小时(降低)及在ImM硝酸盐中28天然后是在IOmM硝酸盐中2小时的植物中如通过微阵列表达分析测定的根中的0sEN0D93的相对转录物丰度。图4B显示在不同的生长阶段及在野生型稻植物的不同的植物部分中0sEN0D93基因的表达。图4C显示在ImM硝酸盐及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物中如使用肌动蛋白作为内部对照通过定量实时PCR测定的芽及根中的0sEN0D93基因的相对表达水平。将表达水平标准化为在ImM硝酸盐中生长的野生型芽。图4D显示在ImM硝酸盐及IOmM硝酸盐中生长观天的过表达0sEN0D93基因的转基因植物中芽及根中如使用肌动蛋白作为内部对照通过定量实时PCR测定的0sEN0D93基因的相对表达水平。将表达水平标准化为在ImM硝酸盐中生长的野生型芽。图5A显示在lmM，3mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物及过表达0sEN0D93 基因的转基因植物中根中的平均总氨基酸(士 SD，n = 3 Q，表示为μπιο mol/g(鲜重) 植物。图5B显示在ImM，3mM及IOmM硝酸盐中生长观天的野生型植物及过表达0sEN0D93 基因的转基因植物中根中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示为植物干重的百分率。图5C显示在3mM及IOmM硝酸盐中生长60天的野生型植物及过表达0sEN0D93基因的转基因植物中根中的平均总氨基酸(士SD，n = 3 5)，表示为μ mol/g(鲜重)植物。图5D显示在3mM及IOmM硝酸盐中生长60天的野生型植物及过表达0sEN0D93基因的转基因植物中根中的平均氮含量(士SD，η = 3 5)，表示为植物干重的百分率。图6显示0sEN0D93基因的基因组序列(SEQ ID NO :1)。图 6B 显示 0sEN0D93 基因的 cDNA 序列(SEQ ID NO :2)。图6C显示由0sEN0D93基因编码的蛋白的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。图6D显示0sEN0D93的基因组序列之内的3个外显子(有下划线的)及2个内含子的位置。图6E显示以氨基酸序列的0sEN0D93结构域(有下划线的)。图7显示在ImM，3mM,及IOmM硝酸盐生长28天的野生型及过表达0sEN0D93基因的转基因稻植物中木质部汁液中的总氨基酸(士SD，η = 3 5)，表示为ymol/ml的木质部汁液。有不同字母的条表示以P < 0. 05的显著的差异(Fisher' s保护的最小显著差异测试)。发明详述I.OsENOD93核酸及蛋白本发明提供0sEN0D93核酸及蛋白，其变体，及其活化剂。之前描述的核酸及蛋白未教导如何使用用于促进植物的氮使用效率的分子，如本文公开。
代表性的0sEN0D93核酸如SEQ ID NO 1所示，其编码代表性的SEQ ID NO :3的 0sEN0D93蛋白。被本发明含盖的0sEN0D93变体包括具有0sEN0D93活性的变体蛋白。在豆科植物中，早期根瘤素(ENOD)基因在根瘤发育期间表达及可介导根瘤器官发生(Mylona等人，1995年)。但是也已假定ENOD基因的差异作用。EN0D40显示在根瘤起始的早期阶段期间表达(Kouchi及Hata，1993年；Yang等人，1993年)及其蛋白可涉及皮质细胞分裂(Charon等人1997)，维管束分化(Kouchi等人，1999年)及也可能在转运光合产物中作用(Kouchi及Hata, 1993年；Yang等人，1993年)。类似地，GmEN0D93的表达已见于大豆根瘤(Kouchi及Hata，1993年)及其在稻0sEN0D93a中具有同源物(Reddy等人， 1998年)，尽管其功能尚未表征。稻中本发明的0sEN0D93基因的同源性检索表明有至少5 种具有EN0D93结构域的家族的基因，及本发明的0sEN0D93基因编码与0sEN0D93a具有大致98 %氨基酸序列同一性的蛋白。本发明的0sEN0D93基因由3个外显子及2个内含子构成，及编码有分子量 12424Da及10. 95的pi的116个氨基酸的蛋白(图6C E及表6)。I.A. 0sEN0D93 核酸核酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及单链，双链，或三链形式的聚合物。除非特别限制，术语含盖含已知的与参照天然核酸具有类似性质的天然的核苷酸的类似物的核酸。术语核酸分子或核酸也可代替基因，cDNA，mRNA，或cRNA使用。核酸可合成，或可源于任何生物来源，包括任何生物。本发明的代表性的核酸包括SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 2的核苷酸序列及编码有基本上相同的活性的0sEN0D93蛋白的基本上相同的序列，例如，至少50%同于SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2的序列，例如至少55%相同的；或至少60%相同的；或至少65%相同的；例如至少70%相同的；或至少75%相同的；或至少80%相同的；或至少85%相同的； 或至少90%相同的，或如至少91%相同的；或至少92%相同的；或至少93%相同的；或至少94%相同的；或至少95%相同的；或至少96%相同的；或至少97%相同的；或至少98% 相同的；或至少99%相同的序列。如本文以下所述，使用SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2的全长序列作为查询序列，使用序列比较算法，或通过视觉观察比较序列的最大对应。基本上相同的序列可为多态序列，即，群中的替代性序列或等位基因。等位基因差异可小至1个碱基对。基本上相同的序列也可包括经诱变的序列，包括包含沉默突变的序列。突变可包括一或多个残基变化，缺失一或多个残基，或插入一或多个额外的残基。基本上相同的核酸也鉴定为与SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO 2的全长在严格条件下特异性地杂交或基本上杂交的核酸。在核酸杂交中，比较的2个核酸序列可指探针及靶。 探针是参照核酸分子，及靶是测试核酸分子，常发现于核酸分子的异质的群之内。靶序列与测试序列同义。用于杂交研究或测定的特定核苷酸序列包括与本发明的核酸分子的至少约14 40个核苷酸序列互补的探针序列。优选地，探针包括14 20个核苷酸，或如果需要甚至更长,例如 30，40，50，60，100，200，300，或 500 个核苷酸或达 SEQ ID NO :1，或 SEQ ID NO 2 的全长。所述片段可容易制备，例如通过片段的化学合成，通过应用核酸扩增技术，或通过将选定的序列导入用于重组产生的重组载体。
特异性杂交指当序列存在于复杂的核酸混合物(例如，总细胞DNA或RNA)中时， 分子仅与特定核苷酸序列在严格条件下结合，成双链，或杂交。特异性杂交可内藏探针及靶序列之间的错配，取决于杂交条件的严格度。在核酸杂交实验(例如DNA印迹和RNA印迹分析)中，严格杂交条件及严格杂交洗涤条件是序列-及环境-依赖性的。更长序列在更高温度特异性地杂交。对核酸杂交的更多指导见于 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，1993 年，部分 1、第 2 章，Elsevier, 纽约，纽约。一般而言，高度严格杂交及洗涤条件选择为以指定的离子强度及PH比特异性序列的热熔点(Tm)约低5°C。一般而言，在严格条件下探针将与其靶亚序列，但非其他序列特异性地杂交。Tm是50%的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在指定的离子强度及pH下)。 非常严格条件选择为等于特定探针的Tm。用于具有多于约100个互补残基的互补核酸的 DNA或RNA印迹分析的严格杂交条件之一例是在有Img的肝素的50%甲酰胺中于42°C过夜杂交。高度严格洗涤条件之一例是在0. IX盐水-柠檬酸钠(SSC)中于65°C 15分钟。 严格洗涤条件之一例是在0. 2XSSC缓冲液中于65°C 15分钟。有关SSC缓冲液的描述见 Sambrook et al. , eds. , Molecular Cloning :ALaboratory Manual,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York。常常，在高严格度洗涤之前先通过低严格度洗涤去除背景探针信号。多于约100个核苷酸的双链体的介质严格度洗涤条件之一例是在IX SSC中于45°C 15分钟。多于约100个核苷酸的双链体的低严格度洗涤之一例是在4X 6XSSC中于40°C 15分钟。对于短探针(例如，约10 50个核苷酸)，严格条件一般涉及在PH 7. 0 8. 3的小于约IM Na+离子的盐浓度，一般约0. 01 IM Na+ 离子浓度(或其他盐)，及一般至少为约30°C的温度。严格条件也可用添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。一般而言，与在特定杂交测定中从不相关的探针观察到的信噪比相比 2倍(或更高)的信噪比表示特异性杂交的检测。以下是可用于鉴定基本上同于本发明的参照核苷酸序列的核苷酸序列的杂交及洗涤条件之例探针核苷酸序列优选在7%十二烷基硫酸钠(SDS)，0. 5M NaPO4, ImM EDTA 中于50°C与靶核苷酸序列杂交，然后是在2XSSC，0. 1% SDS中于50°C洗涤；更优选地，探针和靶序列在7%十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4, ImM EDTA中于50°C杂交，然后是在 1XSSC，0. 1% SDS中于50°C洗涤；更优选地，探针及靶序列在7%十二烷基硫酸钠(SDS)， 0. 5M NaPO4, ImMEDTA中于50°C杂交，然后是在0.5X SSC，0. 1% SDS中于50°C洗涤；更优选地，探针及靶序列在十二烷基硫酸钠(SDS)，0. 5M NaPO4, ImM EDTA中于50°C杂交，然后是在0. 1XSSC，0. 1% SDS中于50°C洗涤；更优选地，探针及靶序列在7%十二烷基硫酸钠 (SDS) ,0. 5MNaP04, ImM EDTA 中于 50°C杂交，然后是在 0. 1XSSC，0. 1 % SDS T 65°C洗涤。2个核酸序列基本上相同的其他指标是由核酸编码的蛋白基本上相同，共享总体3-维结构，或是生物学有功能的相当体。这些术语在本文中以下进一步定义。不在严格条件下彼此杂交的核酸分子，如果相应蛋白基本上相同，则仍基本上相同。此可发生，例如， 当2个核苷酸序列包括如被遗传密码允许的保守地取代的变体时。术语保守地取代的变体指具有简并密码子取代的核酸序列，其中一或多个选定的(或全部)密码子的第三位置用混合的-碱基和/或脱氧肌苷残基取代。见Batzeret al.，Nucleic Acids Res.，1991，19 :5081 ；Ohtsuka et al.，J. Biol. Chem.，1985，260 2605-2608 ；and Rossolini etal. Mol. Cell Probes, 1994，8 :91_98。本发明的核酸也包括互补于SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 2的核酸。互补序列是包括在碱基对之间氢键形成之时能与另一个配对的反平行核苷酸序列的2个核苷酸序列。本文中的术语互补序列指基本上互补的核苷酸序列，如可通过以下所示相同的核苷酸比较方法评定，或定义为能与目标核酸段在相对严格条件下杂交，例如本文所述的那些。互补核酸段的特定实施例是反义寡核苷酸。本发明的核酸也包括SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 2的核酸，其表达已在不同于植物的生物中改变，以解释植物与其他生物之间的密码子利用的差异。例如，植物中的特异性密码子利用不同于某些微生物中的特异性密码子利用。克隆的微生物ORF之内的密码子利用与植物基因(及尤其是来自靶植物的基因)中的利用的比较将致使鉴定应特异性地变化的ORF之内的密码子。一般植物进化趋向于在单子叶植物的第三碱基位置强偏好核苷酸C 及G，然而双子叶植物在此位置常使用核苷酸A或T。通过修饰基因来合并用于特定靶转基因物种的特异性密码子利用，将克服以下描述的就GC/AT含量及非常规剪接的许多问题。植物基因一般具有多于35%的GC含量。富含A及T核苷酸的ORF序列可在植物中导致几个问题。首先，ATTTA基序被认为导致信使RNA的去稳定，及见于许多短-寿命的 mRNAs的3'端。其次，多聚腺苷酸化信号(例如AATAAA)在信使RNA之内的不适当的位置出现被认为导致转录的成熟前截短。此外，单子叶植物可识别富AT序列作为剪接位点(见以下)。术语亚序列指包括部分更长核酸序列的核酸序列。例示亚序列是本文以上所述的探针或引物。本文所用的术语引物指包括选定的核酸分子的约8或更多脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，优选10 20个核苷酸，及更优选20 30个核苷酸的连续的序列。本发明的引物含盖足够的长度及适当的序列的寡核苷酸，以提供本发明的核酸分子上的聚合起始。本发明的代表性的核酸也包括基本上由SEQ ID NO :1及SEQ IDNO :2构成的核酸， 由于核酸从可正常结合所述核酸的额外的核苷酸序列分离及不含可正常结合所述核酸的额外的核苷酸序列。附加地，本发明的核酸可在整个植物中表达，或可在植物的特定部分区别表达。而且，本发明的核酸可在贯穿植物发育的不同的时间(例如植物发育的繁殖阶段或植物性阶段期间)(例如，图4B中指定的发育阶段及植物部分)表达。本发明也提供包括公开的核酸的载体，包括用于重组表达的载体，其中本发明的核酸运作性连接到有功能的启动子。当运作性连接到核酸时，启动子与核酸功能性组合，以至于通过启动子区控制及调节核酸转录。载体指能在宿主细胞，例如质粒，粘粒，及病毒载体中复制的核酸。本发明的核酸可克隆，合成，改变，经诱变，或其组合。用于分离核酸的标准重组 DNA及分子克隆技术为本领域所知。位点-特异性诱变创建碱基对变化，缺失，或小的插入子也为本领域所知。见例如，Sambrook et al. (eds. )Molecular Cloning :A Laboratory Manual,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ； Silhavy et al. ,Experiments with Gene Fusions,1984,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ；Glover&Hames, DNA Cloning :A Practical Approach,2nd ed. ,1995, IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York ；
10Ausubel (ed. ) Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed. , 1995, Wiley, New York。在本发明的另一方面，提供检测编码0sEN0D93蛋白的核酸分子的方法。所述方法可用于检测0sEN0D93基因变体或改变的基因表达。通过本发明的方法检测的序列可检测， 亚克隆，测序，及通过本领域中熟知的任何测量使用通常应用到特异性DNA序列检测的任何方法进一步评估。由此，本发明的核酸可用于克隆包括公开的序列的基因及基因组DNA。 或者，本发明的核酸可用于克隆相关的序列的基因及基因组DNA。0sEN0D93核酸分子的水平可测量，例如，使用 RT-PCR 测定。见 Chiang，J. Chromatogr. A. ,1998,806 :209_218，及该文引用的参考文献。在本发明的另一方面，可进行使用0sEND093核酸的遗传测定用于定量特性座位 (QTL)分析及筛选遗传变体，例如通过等位基因-特异性寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner et al.，Proc. Natl. Acad. ScLUSA, 1983,80(1) :278-282)，寡核苷酸结扎测定(OLAs) (Nickerson et al. , Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1990,87(22) :8923-8927)，单链构象多态性(SSCP)分析(Orita et al. , Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1989,86(8) :2766-2770)，SSCP/ 异源双链体分析，酶错配切割，扩增的外显子的直接序列分析(Kestila et al. ,Mol. Cell, 1998，1 (4) :575-582 ；Yuanet al.，Hum. Mutat.，1999，14 (5) :440-446)，等位基因-特异性杂交(Stoneking et al.，Am. J. Hum. Genet. , 1991,48(2) :370-382)，及含特异性突变的扩增的基因组DNA的限制性分析。也可将自动化的方法应用于单核苷酸多态性的大规模表征(Wang et al.，Am. J. Physiol, 1998, 274 (4Pt 2) :H1132-1140 ；Brookes, Gene, 1999， 234(2) :177-186)。优选的检测方法是非-电泳，包括，例如，TAQMAN 等位基因区别测定， PCR-OLA,分子信标，闭锁探针，及良好荧光。见Landegren等人，Genome Res.，1998年，8 769 776及该文引用的参考文献。I.B. 0sEN0D93 蛋白本发明也提供分离的0sEN0D93多肽。多肽及蛋白各指由通过肽键连接的氨基酸单链构成的化合物。代表性的0sEN0D93多肽如SEQID NO :3所示。本发明的额外的多肽包括有基本上相同的活性的0sEN0D93蛋白，例如，至少50%同于SEQ ID NO :3，例如至少
相同的；或至少60%相同的；或至少65%相同的；例如至少70%相同的；或至少75% 相同的；或至少80%相同的；或至少85%相同的；或至少90%相同的，或如至少91%相同的；或至少92%相同的；或至少93%相同的；或至少94%相同的；或至少95%相同的；或至少96 %相同的；或至少97 %相同的；或至少98 %相同的；或至少99 %相同的序列。如本文以下所述使用SEQ ID NO :3的全长序列作为查询序列，使用序列比较算法或通过视觉观察比较序列的最大对应。本发明的代表性的蛋白也包括基本上由SEQ ID NO :3构成的多肽， 由于多肽从可正常结合所述多肽额外的氨基酸序列分离及不含可正常结合所述多肽额外的氨基酸序列。本发明还含盖由本文中公开的任一核酸编码的多肽。本发明的多肽可包括天然存在的氨基酸，合成的氨基酸，遗传编码的氨基酸， 非-遗传编码的氨基酸，及其组合。多肽可兼包括L-型及D-型氨基酸。代表性的非-遗传编码的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸； β -氨基丙酸；2-氨基丁酸；A-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4- 二氨基丁酸；锁链素；2，2’ - 二氨基庚二酸；2， 3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖氨酸；别-羟基赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链素；别-异亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基异亮氨酸； N-甲基缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；及鸟氨酸。代表性的衍生的氨基酸包括，例如，游离的氨基已衍生而形成胺盐酸盐，ρ-甲苯磺酰基，苄氧羰基，t_叔丁氧羟基，氯乙酰基或甲酰基的分子。游离的羧基可经衍生而形成盐， 甲基及乙基酯或其他类型的酯或酰胼。游离的羟基可经衍生而形成0-酰基或0-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可衍生而形成N-内-苄基组氨酸。本发明也提供0sEN0D93多肽的功能片段，例如，具有类似于全长0sEN0D93蛋白的活性的片段。也提供长于公开的序列的有功能的多肽序列。例如，可将一或多个氨基酸加入多肽N-端或C-端。可在各种应用中采用所述额外的氨基酸，包括但不限于纯化应用。制备延长的蛋白的方法为本领域所知。本发明的0sEN0D93蛋白包括如下蛋白，所述蛋白包括是SEQID NO 3的保守地取代的变体的氨基酸。保守地取代的变体指包括一或多个残基被功能性类似残基保守取代的氨基酸的多肽。保守置换之例包括一个非-极性(疏水)残基(例如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸)用另一非-极性(疏水)残基置换；一个极性(亲水)残基用另一极性(亲水)残基置换，例如在精氨酸和赖氨酸之间，在谷氨酰胺和天冬酰胺之间，在甘氨酸和丝氨酸之间；一个碱性残基(例如赖氨酸，精氨酸或组氨酸)用另一碱性残基置换；或一个酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)用另一酸性残基置换。本发明的分离的多肽可使用各种本领域技术人员已知的标准技术纯化及表征。 见例如，Schroder et al.，The Peptides，1965，Academic Press，New York ；Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis,2nd rev.ed.1993， Springer-Verlag, Berlin/New York ；Ausubel (ed.), Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed. ,1995,Wiley,New York。本发明还提供检测0sEN0D93多肽的方法。可使用公幵的方法，例如，测定改变的 0sEN0D93蛋白的水平，例如，诱导的0sEN0D93蛋白的水平。例如，方法可涉及与特异性地识别0sEN0D93蛋白的抗体进行免疫化学反应。检测所述抗体-抗原缀合物或复合物的技术为本领域所知，及包括但不限于离心，亲和层析及其他免疫化学方法° 见例如，Ishikawa Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, 1999, Elsevier, Amsterdam/New York, United States of America ；Law, Immunoassay :A Practical Guide,1996, Taylor&Francis, London/Bristol, Pennsylvania,United States of America ；Liddell et al. ,Antibody Technology,1995,Bios Scientific Publishers, Oxford, United Kingdom ；及该文引用的参考文献。Ι·C.核苷酸及氨基酸序列比较在2个或更多核苷酸或蛋白序列中的术语相同的或百分率同一性，指当比较及比对最大对应(如使用本文中公开的序列比较算法或通过视觉观察之一所测)时，相同或具有指定的百分率的相同的氨基酸残基或核苷酸的2个或更多序列或亚序列。有关核苷酸或蛋白序列，术语基本上相同指由天然存在的序列的序列通过一或多个缺失，取代，或添加的特定序列变化，其净效应旨在保留EN0D93核酸或蛋白的生物功能。对于2个或更多序列的比较，一般将一个序列作为参照序列，将一或多个测试序
12列与其比较。当使用序列比较算法时，测试及参照序列进入计算机程序，如果必需，指定亚序列坐标，及选择序列算法程序参数。然后序列比较算法基于选定的程序参数计算指定的测试序列相对于参照序列的序列同一性百分率。比较的序列的最佳比对可，例如，通过Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math, 1981, 2 :482_489，通过 Needleman&Wunsch 的同源性比对算法，J. Mol. Biol.， 1970,48 :443-453，通过检索 Pearson&Lipman 的相似性方法，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,85 :2444-2448,通过这些算法的计算机化的运行(GAP，BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)，或通过视觉观察进行。一般见，Ausubel (ed.)，Short Protocols in Molecular Biology,3rded. , 1995, Wiley, New York。用于确定序列同一性百分率及序列相似性的优选的算法是BLAST算法，其描述于 Altschul et al，J. Mol. Biol，1990，215 :403_410。公众可通过 National Center for Biotechnology Information (网址 ncbi. nlm. nih. gov/)用进行 BLAST 分析的软件。BLAST 算法参数决定比对的灵敏度及速度。对于比较2个核苷酸序列，BLASTn默认参数设置为W =11(字长)及E= 10 (期望)，及也包括使用低复杂性筛选来屏蔽具有低组成性复杂性的查询序列的残值。对于2个氨基酸序列的比较，BLASTp程序默认参数设置为W = 3(字长)，E= 10(期望)，使用BL0SUM62评分矩阵，存在的空位值=11及延伸的空位值=1，及使用低复杂性筛选屏蔽具有低组成性复杂性的查询序列的残值。II·重组表达0sEN0D93蛋白的系统本发明还提供用于表达重组0sEN0D93蛋白的系统。所述系统可用于随后纯化和/ 或表征0sEN0D93蛋白。重组表达0sEN0D93蛋白的系统也可用于鉴定0sEN0D93蛋白的活化剂或靶，如本文中以下进一步所述。表达系统指包括异源核酸及由异源核酸编码的蛋白的宿主细胞。例如，异源表达系统可包括用包括运作性连接到启动子的编码0sEN0D93蛋白的0sEN0D93核酸的构建体转染的宿主细胞，或通过将0sEN0D93核酸导入宿主细胞基因组产生的细胞系。表达系统可还包括一或多个相关于0sEN0D93功能的额外的异源核酸，例如0sEN0D93活性的靶。这些额外的核酸可作为单个构建体或多个构建体表达。分离的蛋白及重组产生的蛋白可使用本领域技术人员已知的各种标准技术纯化及表征。见例如，Schroder et al. , The Peptides, 1965, Academic Press, New York ； Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis,2nd rev.ed.1993, Springer-Verlag, Berlin/New York ；Ausubel(ed. ), Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed., 1995，Wiley, New York。[II. A.表达构建体用于表达0sEN0D93蛋白的构建体可包括载体序列及0sEN0D93核苷酸序列，其中所述0sEN0D93核苷酸序列运作性连接到启动子序列。用于重组0sEN0D93表达的构建体也可包括转录终止信号及核苷酸序列的适当的翻译需要的序列。本领域技术人员已知表达构建体的制备，包括添加翻译及终止信号序列。启动子可为在选择的植物细胞，植物部分，或植物中显示转录活性的任何多核苷酸序列。启动子可为天然的或类似的，或外源或异源，对于植物宿主和/或对于本发明的 DNA序列。当启动子对于植物宿主是天然的或内源性时，期望启动子见于向其中导入启动子的天然的植物。当启动子对于本发明的DNA序列是外源或异源时，启动子对于运作性连接的本发明的DNA序列不是天然的或天然存在的启动子。启动子可为诱导性或组成性的。 其可为天然存在的，可由各天然存在的启动子的部分组成，或可为部分或完全合成的。启动子设计的指导由启动子结构的研究提供，例如Harley et al，Nucleic Acids Res.，1987， 15 :2343-61 ο而且，启动子相对于转录开始的位置可优化。见例如，Roberts et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76 :760_4。许多用于植物的适宜启动子为本领域熟知。例如，用于植物的适宜组成性启动子包括来自植物病毒的启动子，例如花生黄萎病条纹花椰菜花叶病毒(PCisv)启动子(美国专利No. 5，850，019)；来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的 35S 启动子(Odell et al.，Nature, 1985,313 :810-812)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利No. 5，563，328)及来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录物启动子(美国专利No. 5，378，619)；来自如稻肌动蛋白(McElroy et al. (1990)Plant Cell 2 :163-171)；泛素(Christensen et al.，Plant Mol. Biol.，1989，12 :619-632 及 Christensen et al.，Plant Mol. Biol.，1992，18 :675-689) ；pEMU(Last et al. , Theor. Appl. Genet. , 1991,81 :581-588) ；MAS (Velten et al.，EMBO J, 1984,3 :2723-2730)；玉米 H3 组蛋白(Lepetit et al. , Mol. Gen. Genet. , 1992, 231 :276-285 R Atanassova et al., Plant J. ,1992,2(3) =291-300)；欧洲油菜 ALS3 (PCT 国际公开 No. WO 97/41228)基因的启动子；及各土壤杆菌基因的启动子(见美国专利No. 4，771，002 ；5, 102，796 ；5，182，200 ；及 5，428，147)。用于植物的适宜诱导型启动子包括响应铜的来自ACEl系统的启动子(Mett et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1993，90 :4567-4571)；响应苯磺酰胺除草安全剂的玉米 In2 基因启动子(Hershey et al.，Mol. Gen. Genetics, 1991，227 :229-237 及 Gatz et al.， Mol. Gen. Genetics, 1994, 243 :32-38)；及来自 TnlO 的 Tet 阻遏物启动子(Gatz et al.， Mol. Gen. Genet.，1991，227 :2四_237)。用于植物的另一诱导型启动子是响应植物不正常响应的诱导剂的启动子。此类型的例示诱导型启动子是来自留激素基因的诱导型启动子，其转录活性被糖皮质激素诱导(Schena et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88 :10421) 或新近应用的嵌合转录活化子，XVE，其用于被雌二醇活化的基于雌激素受体的诱导性植物表达系统(Zuo et al. ,Plant J，2000，M :265-273)。用于植物的其他诱导型启动子描述于 EP 332104，PCT国际公开No. W093/213;34及WO 97/06269o也可使用包含部分其他启动子的启动子及部分或完全合成的启动子。见描述所述用于植物的启动子的例如，M et al., Plant J.，1995，7 :661-676 及 PCT 国际公开 No. WO 95/14098。启动子可包括，或将修饰为包括，一或多个增强子元件，以由此提供更高水平的转录。用于植物的适宜增强子元件包括=PCisv增强子元件(美国专利No. 5，850，019)，CaMV 35S增强子元件(美国专利No. 5，106, 739和5，164，316)及FMV增强子元件(Maiti et al.， Transgenic Res.，1997，6 143-156)。也见 PCT 国际公开 No. W096/23898。所述构建体可含'信号序列'或'前导序列'，以辅助将目的肽共-翻译或翻译后转运到某些细胞内结构，例如叶绿体(或其他质体)，内质网，或高尔基体，或分泌。例如， 可将构建体加工为含信号肽以辅助将肽转移到内质网。信号序列已知或疑似导致共翻译或翻译后跨细胞膜肽转运。在真核生物中，此一般涉及分泌到高尔基体，含一些得到的糖基化。前导序列指当翻译时导致足以引发将肽链共-翻译转运到亚-细胞细胞器的氨基酸序列的任何序列。由此，此包括通过进入内质网，到达液泡，质体(包括叶绿体，线粒体，等) 靶向转运和/或糖基化的前导序列。植物表达盒也可含内含子，以至于表达需要内含子的 mRNA处理。所述构建体也可含5'及3'非翻译区。3'非翻译区是位于编码序列下游的多核苷酸。能影响将聚腺苷酸段添加到mRNA前体3’端的多聚腺苷酸化信号序列及编码调控信号的其他序列是3'非翻译区。5'非翻译区是位于编码序列上游的多核苷酸。终止区可与转录起始区相同来源，可与本发明的序列相同来源，或可源于另一来源。方便的终止区可获自根癌土壤杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合酶及胆脂碱合酶终止区。也见 Guerineau et al. , Mol. Gen. Genet. , 1991,262 :141-144 ；Proudfoot, Cell, 1991,64 :671-674 ；Sanfacon et al. , Genes Dev. 1991,5 :141-149 ；Mogen et al., Plant Cell,1990,2:1261-1272 ；Munroe et al.，Gene，1990，91151-158 ；Ballas etal.， Nucleic Acids Res.，1989，17 :7891-7903 ；及 Joshi et al.，Nucleic Acid Res. , 1987, 15 :9627-9639。如果适当，可优化载体及0sEN0D93序列而用于在转化的宿主细胞中增加的表达。 即，序列可为改善的表达使用宿主细胞-优选的密码子合成，或可使用以宿主-优选的密码子利用频度的密码子合成。一般而言，将增加多核苷酸的GC含量。见例如，讨论宿主-优选的密码子利用的Campbell et al. ,Plant Physiol，1990,92 :1_11。用于合成宿主-优选的多核苷酸的方法为本领域所知。见例如，美国专利No. 6，320，100 ；6, 075，185 ；5, 380，831 ； 及 5，436，391，美国公开申请 No. 20040005600 和 20010003849，及 Murray et al. ,Nucleic Acids Res.，1989，17 :477_498，将它们通过引用并入本文。例如，可使目的多核苷酸靶向叶绿体用于表达。以此方式，其中目的多核苷酸不直接插入叶绿体，表达盒可附加地含编码将目的核苷酸引导到叶绿体的转运肽的多核苷酸。所述转运肽为本领域所知。见例如，Von Heijne et al.，Plant Mol. Biol. Rep., 1991,9 :104-126 ；Clark et al. J. Biol.Chem. ,1989,264 :17544-17550 ；Della-Cioppa et al. , Plant Physiol, 1987,84 :965-968 ；Romer et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993，196 :1414-1421 ；及 Shah et al.，Science，1986，233 :478-481。待革 E 向叶绿体的目的多核苷酸可为在叶绿体中表达而优化，以解释植物细胞核和此细胞器之间的密码子利用的差异。以此方式，目的多核苷酸可使用叶绿体-优选的密码子合成。见例如，美国专利 No. 5，380，831，将它们通过引用并入本文。可将植物表达盒(即，运作性连接到启动子的0sEN0D93开放阅读框)插入使DNA 转化进细胞的植物转化载体。所述分子可由一或多个表达盒构成，及可组织进多于一个载体DNA分子。例如，二元载体是利用2个非-连续的DNA载体来编码用于转化植物细胞的全部必要的顺式-及反式作用功能的植物转化载体(Hellens et al. , Trends in Plant Science, 2000, 5 :446-451)。植物转化载体包括用于实现植物转化的一或多个DNA载体。例如，利用包括多于一个连续的DNA段的植物转化载体是本领域中的通常实践。这些载体在本领域中常指二元载体。二元载体以及有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌-介导的转化，其中需要实现有效转化的DNA段的尺寸及复杂性相当地大，及对于对分离的DNA分子分离功能有利。二元载体一般含有含T-DNA转移需要的顺式作用序列的质粒载体(例如左边缘及右边缘)，加工为能在植物细胞中表达的可选择的标记物，及目的多核苷酸(即，经加工以能在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的多核苷酸)。也存在于此质粒载体的是细菌复制需要的序列。顺式作用序列以使有效转移到植物细胞及在那里表达的方式排列。例如，可选择的标记物序列及目的序列位于左及右边缘之间。第二质粒载体常含介导T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。此质粒常含使植物细胞被土壤杆菌感染，及通过在边缘序列切割及vir-介导的DNA转移来转移DNA的毒力功能(Vir基因)，如本领域中理解(Hellens 等人，2000年)。几种类型的土壤杆菌株(例如，LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105，等。) 可用于植物转化。第二质粒载体不必要于通过其他方法(例如微投影，微注射，电穿孔，聚乙二醇，等)将多核苷酸导入植物。[II.B.宿主细胞宿主细胞是可向其中导入本发明的异源核酸分子的细胞。代表性的真核宿主细胞包括酵母及植物细胞，以及原核生物宿主(例如大肠杆菌及芽孢杆菌)。用于功能测定的优选的宿主细胞基本上或完全缺乏0sEN0D93蛋白的内源性表达。可选择宿主细胞株以实现重组序列表达，或以特异性方式修饰及处理基因产物。 例如，不同的宿主细胞具有翻译及翻译后处理及修饰(例如，蛋白的糖基化，磷酸化)的特征性及特异性机理。可选择适当的细胞系或宿主细胞，以确保表达的外源蛋白的期望的修饰及处理。例如，在细菌系统中的表达可用于产生非-糖基化的核心蛋白产物，及在酵母中表达将产生糖基化的产物。本发明还含盖0sEN0D93蛋白在稳定的细胞系中的重组表达。将异源构建体转化进宿主细胞后产生稳定的细胞系的方法为本领域所知。见例如，Joyner,Gene Targeting A Practical Approach, 1993,Oxford University Press,Oxford/New York。由此,转化的细胞，组织，及植物理解为含盖不仅转化处理的终产物，而且其转基因后代或繁殖的形式。III· 0sEN0D93过表达植物本发明也提供包括过表达的0sEN0D93核酸或蛋白的0sEN0D93过表达植物。本发明也提供有0sEN0D93的条件性或诱导性表达的植物的产生。0sEN0D93过表达植物可以单子叶或双子叶植物制备，例如，以玉米，高粱，小麦，葵花，番茄，十字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花，稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，及油籽油菜， 芸苔属，紫花苜蓿，黑麦，粟，红花，花生，蕃薯，木薯，咖啡，椰子，菠萝，柑橘树，可可，茶，香蕉，鳄梨，无花果，番石榴，芒果，橄榄，番木瓜，腰果，澳洲坚果，杏仁，燕麦，蔬菜，观赏植物， 及松柏类植物。代表性的蔬菜包括番茄，莴苣，四季豆，利马豆，豌豆，山药，洋葱，及甜瓜属成员(例如黄瓜，罗马甜瓜，及香瓜)。观赏植物包括但不限于，杜鹃花，八仙花，芙蓉属植物，蔷薇科植物，郁金香，水仙花，牵牛花，康乃馨，一品红，及菊花。如本文所用，植物指全植物，植物器官(例如，叶，茎，根，等)，籽，植物细胞，繁殖体，胚胎，及后代其。植物细胞可分化或未分化(例如，愈伤组织，悬浮液培养细胞，原生质体，叶细胞，根细胞，韧皮部细胞，花粉)。可进一步在不同于0sEN0D93的座位修饰0sEN0D93过表达植物，以赋予增强的氮使用效率或其他目的特性。代表性的期望的特性包括改善的作物产率；增加的籽产率；增加的氨基酸含量；增加的硝酸盐含量；增加的应激耐受性；昆虫抗性；广谱除草剂耐受性； 对于由病毒，细菌，真菌，及虫所致的疾病的抗性；及增强保护免于环境应激(例如热，冷，旱，及高盐浓度)的机理。额外的期望的特性包括使消费者受益的输出特性，例如，含更多淀粉或蛋白，更多维生素，更多抗氧化剂，和/或更少反式-脂肪酸的营养增强的食品；有改善的口味，增加的货价期，及更佳成熟特征的食品；使少环境损害地产生纸可能的树；无烟碱烟草；有新色彩，芳香，及增加的寿命的观赏植物花卉；等。再者，可根据本发明使用的期望特性包括作为用于制备，例如，用于疾病治疗及疫苗接种的治疗性蛋白的手段在植物中产生的基因产物；织物纤维；可生物降解的塑料；用于漆，去污剂，及润滑剂的油；等。对于赋予与改变的基因表达，硝酸盐含量，氨基酸含量，硝酸盐摄取，侧根生长，或植物生物质相关的特性的遗传修饰，0sEN0D93过表达植物和第二遗传修饰的组合可产生协同效应，即，基因表达，硝酸盐含量，氨基酸含量，硝酸盐摄取，侧根生长，或植物生物质的变化大于由任一遗传修饰单独引起的变化。对于0sEN0D93过表达植物的制备，将多核苷酸导入植物细胞通过本领域中已知的几种技术之一实现，包括但不限于电穿孔或化学转化(见例如，Ausubel, ed. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. , Indianapolis, hdiana)。赋予对于毒性物质的抗性的标记物在从非-转化的细胞的(那些不含或不表达测试多核苷酸序列的细胞)鉴定转化的细胞(已摄取及表达测试多核苷酸序列的细胞) 中有用。在本发明的一方面，基因作为标记物有用以评定DNA导入进植物细胞。转基因植物，转化的植物，或稳定转化的植物，或前述之任何的细胞，组织或籽，指外源多核苷酸合并入或整合入植物细胞的植物。稳定的转化指多核苷酸构建体被导入植物以至于其整合进植物基因组及能被其后代遗传。一般而言，植物转化方法涉及将异源DNA转移进靶植物细胞(例如，未成熟的或成熟的胚胎，悬浮液培养物，未分化的愈伤组织，原生质体，等)，然后是施加最大阈值水平的适当的选择(取决于可选择的标记物基因)，以从一组未转化的细胞质量回收转化的植物细胞。一般将外植体转移到新鲜供给的相同培养基及常规培养。随后，放置到补充了最大阈值水平的选择试剂(即，温度和/或除草剂)的再生培养基后转化的细胞分化为芽。然后将芽转移到用于回收生根的芽或小植株的选择性生根培养基。转基因小植株然后生长为成熟的植物及产生能育的籽(例如，Hiei et al,Plant J. ,1994,6 =271-282 ；Ishida et al， Nat. Biotechnol，1996，14 :745-750)。产生转基因植物的技术及方法的一般描述见于Ayres et al.，CRC Crit. Rev. Plant Sci.，1994. 13 :219_239，及 Bommineni 等人，Bommineni et al. ,Maydica, 1997' ,42 :107_120。由于转化的物质含许多细胞，转化的及非-转化的细胞存在于任何块的作为对象的靶愈伤组织或组织或细胞团。杀非-转化的细胞及使转化的细胞增值的能力产生转化的植物培养物。常常，去除非-转化的细胞的能力是快速恢复转化的植物细胞及成功的产生转基因植物的限制。然后可将分子及生物化学方法用于确认转基因植物基因组中有整合的目的核苷酸。转基因植物的产生可通过几种方法之一进行，包括但不限于通过土壤杆菌将异源 DNA导入植物细胞(土壤杆菌-介导的转化)，用附着于粒子的异源外源DNA轰击植物细胞，及各其他非-粒子直接介导的方法(例如，Hiei et al.，Plant J. ,1994,6 :271-282 ； Ishida et al. ， Nat.Biotechnol, 1996,14:745-750 ；Ayres et al. ， CRC Crit. Rev. Plant Sci. , 1994,13 :219-239 ；Bommineni et al，Maydica，1997,42 :107-120)来转移 DNA。有3种常用的用土壤杆菌转化植物细胞的方法。第一方法是土壤杆菌与培养的分离的原生质体的共-培养。此方法要求使培养原生质体及从培养的原生质体的植物再生的建立的培养系统。第二方法是用土壤杆菌转化细胞或组织。此方法要求(a)植物细胞或组织可经土壤杆菌转化及(b)可诱导转化的细胞或组织来再生为全植物。第三方法是用土壤杆菌转化籽，顶点或分生组织。此方法要求微繁殖。通过土壤杆菌的转化效率可通过使用本领域中已知的许多方法增强。例如，使天然的创伤应答分子，例如乙酰丁香酮(AQ包含到土壤杆菌培养已显示增强用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化效率(Shahla et al. ,Plant Molec. Biol, 1987, 8:291-298)。或者，转化效率可通过伤害待转化的靶组织来增强。植物组织的伤害可，例如，通过打孔，浸软，用微投射物轰击，等实现。见例如，Bidney et al. ,Plant Molec. Biol, 1992，18 :301-313。在本发明的另一方面，植物细胞用载体经粒子轰击(即，用基因枪)转染。粒子介导的基因转移方法为本领域所知，可商购，及包括但不限于，气体驱动的基因递送装置，其描述于美国专利No. 5，584，807，将其整个内容通过引用并入本文。此方法涉及将目的多核苷酸序列包被于重金属微粒，及在压缩气体的压力下加速包被的粒子用于递送到靶组织。其他粒子轰击方法也可用于将异源多核苷酸序列导入植物细胞。一般而言，这些方法涉及将目的多核苷酸序列淀积到例如金，钼，或钨的小的，密的粒子材料表面。将包被的粒子直接包被到任一硬的表面，例如金属板，或到由脆性材料(例如聚酯薄膜)制成的载质片材。然后将包被的片材向靶生物组织加速。平的片材的使用产生加速的粒子的均一的扩展，其最大化在均一的条件下接受粒子的细胞的数，导致多核苷酸样品被导入靶组织。特异性起始信号也可用于实现编码目的多肽的序列的更有效翻译。所述信号包括 ATG起始密码子及相邻序列。在编码目的多肽的序列的情况中，将其起始密码子，及上游序列插入适当的表达载体，可无需额外的转录或翻译控制信号。但是，在仅插入编码序列，或其部分的情况中，应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应在正确的阅读框中，以确保整个插入子的翻译。外源翻译元件及起始密码子可为各种来源的， 天然的及合成的。表达效率可通过包含对于特定细胞系统适当的增强子来增强，所述增强子例如那些文献中所述使用的(Scharf et al.，Results Probl. Cell Differ. , 1994,20 125)。本发明的另一方面，通过同源重组在植物基因组中修饰对应于本发明的核苷酸序列的至少一个基因组拷贝，如进一步阐述于I^aszkowski等人，EMBO Journal 1988,7 4021 沈。此技术使用同源序列的性质彼此识别及通过本领域中已知的处理(如同源重组)在各之间交换核苷酸序列。同源重组可在细胞内核苷酸序列的染色体拷贝之间发生， 及通过转化将所得的核苷酸序列拷贝导入细胞。由此将特异性修饰精确导入核苷酸序列的染色体拷贝。一方面，修饰本发明的核苷酸序列的调控元件。所述调控元件通过使用本发明的核苷酸序列或其部分作为探针筛选基因组库容易可获得。既有的调控元件被不同的调控元件取代，由此改变核苷酸序列的表达。已转化的细胞可根据常规方式生长为植物。见例如，McCormick et al.，Plant Cell R印.，1986，5 :81-84。这些植物可然后生长，及用相同的转化的株或不同的株任一授粉，及得到具有鉴定的期望的表型特征性的组成性表达的杂交体。可生长2或更多代，以确保期望的表型特征性的表达稳定维持及遗传，然后收获籽，以确保已实现期望的表型特征
18性的表达。以此方式，本发明提供具有本发明的多核苷酸(例如，稳定合并入它们的基因组的本发明的表达盒)的转化的籽(也称为转基因籽)。本发明的转基因植物可对于加入的多核苷酸纯合；S卩，含2个添加的序列的转基因植物，一个序列在染色体对的各染色体的相同的座位上。纯合转基因植物可如下得到 使(自交)含加入的根据本发明的序列的独立性分离子转基因植物性交，使一些产生的籽发芽，及就相对于对照(天然的，非-转基因)或独立性分离子转基因植物的增强的酶活性 (即，除草剂抗性)和/或增加的植物产率分析得到的产生的植物。需知，也可交配2个不同的转基因植物来产生含2种独立地分离加入的，外源的多核苷酸的后代。适当的后代的自交可产生对于全部加入的，外源的编码本发明的多肽的多核苷酸纯合的植物。也考虑与亲本植物回交及与非-转基因植物远交。将DNA导入植物细胞后，通过各方法确认多核苷酸转化或整合入植物基因组，例如与整合的序列相关的多核苷酸，多肽及代谢物的分析。IV.0sEN0D93结合偶体及活化剂本发明还公开鉴定0sEN0D93结合偶体及0sEN0D93活化剂的测定。0sEN0D93活化剂是改变0sEN0D93蛋白的化学及生物活性或性质的试剂。所述化学及生物活性及性质可包括但不限于，0sEN0D93核酸表达水平及经0sEN0D93调节的核酸的表达水平。鉴定活化剂的方法涉及在一或多种测试试剂的存在下测定0sEN0D93功能的增强的，水平或质量。代表性的0sEN0D93活化剂包括小分子以及生物实体，如本文以下所述。0sEN0D93活性的对照水平或质量指野生型0sEN0D93活性的水平或质量，例如，当使用包括SEQ ID NO :3表达的重组表达系统时。当评估测试试剂的活化能力时，0sEN0D93 活性的对照水平或质量包括无测试试剂的情况下的活性的水平或质量。0sEN0D93蛋白的显著变化的活性指可测量的大于测量技术中固有的误差容限的质量的可定量的变化。例如，显著的抑制指相对于对照测量降低约2倍以上，或约5倍以上降低，或约10倍以上降低的0sEN0D93活性。显著的增强指相对于对照测量增加约2倍以上，或约5倍以上增加，或约10倍以上增加的0sEN0D93活性。0sEN0D93功能的测定可包括确定0sEN0D93基因表达水平；确定重组表达的 0sEN0D93蛋白的DNA结合活性；确定0sEN0D93蛋白的活性构象；或确定响应0sEN0D93活化剂结合的信号转导事件的活化(例如，增强的硝酸盐转运子表达，增加的硝酸盐含量，增加的氨基酸含量，增加的硝酸盐摄取，增加的侧根萌发，和/或增加的生物质)。例如，鉴定 0sEN0D93活化剂的方法包括(a)提供表达0sEN0D93蛋白的细胞；(b)使细胞与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定编码0sEN0D93蛋白的核酸的表达；及(d)选择当相比对照试剂与测试试剂接触时，诱导核酸的升高的表达的测试试剂。根据本发明，也提供依赖于本文所述的方法的快速及高通量筛选方法。此筛选方法包括使0sEN0D93蛋白与多个测试试剂独立地接触。在所述筛选方法中，多种测试试剂可包括多于约IO4样品，或多于约IO5样品，或多于约IO6样品。本发明的体外及细胞测定可包括可溶性测定，或可还包括用于固定一或多种测定成分的固相基材。例如，可将0sEN0D93蛋白，或表达0sEN0D93蛋白的细胞，与固体状态成分经共价或非-共价连接直接结合。任选地，结合可包括介导0sEN0D93蛋白与基材的间接结合的接头分子或标签。
[IV. A.测试试剂测试试剂指与0sEN0D93核酸或蛋白(包括任何合成的，重组，或天然的产物)潜在地相互作用的任何试剂。可使用本文中公开的方法评价疑似与蛋白相互作用的测试试剂的所述相互作用。代表性的测试试剂包括但不限于肽，蛋白，核酸，小分子(例如，有机和无机化合物)，抗体或其片段，核酸-蛋白融合体，任何其他亲和性试剂，及其组合。待测试的测试试剂可为纯化的分子，同质的样品，或分子或化合物的混合物。小分子指化合物，例如，有小于约1，000道尔顿，更优选小于约750道尔顿，再更优选为小于约600道尔顿，及再更优选为小于约500道尔顿的分子量的有机化合物。小分子也优选具有在约-4 约+14范围内的，更优选在约-2 约+7. 5范围内的计算的对数辛醇-水分配系数。测试试剂可作为分子库或收集得到或制备。库可含从约10个分子 几十亿个分子或更多变化的少或大的不同的分子数。分子可包括天然存在的分子，重组分子，或合成的分子。库中多个测试试剂可测定同时。任选地，可将源于不同的库的测试试剂合并用于同时评估。代表性的库包括但不限于肽库(美国专利No. 6，156，511，6，107，059， 5，922，545，及 5，223，409)，寡聚体库(美国专利 No. 5，650，489 和 5，858，670)，适体库 (美国专禾IJ No. 7，338，762 ；7，329，742 ；6，949，379 ；6，180，348 ；及 5，756，291)，小分子库 (美国专禾U No. 6，168，912和5，738，996)，抗体或抗体片段库(美国专利No. 6，174，708， 6，057，098，5，922，254，5，840，479，5，780，225，5，702，892，及 5，667，988)，核酸-蛋白融合体库(美国专利No. 6，214，55 ，及任可潜在地结合0sEN0D93蛋白的何其他亲和性试剂库。库可包括一批随机收集的分子。或者，库可包括一批有对于特定序列，结构，或构象的偏好的分子，例如，关于抑制性核酸。见例如，美国专利No. 5，264, 563和5，824，483。 制备库含各种类型的分子的多样的群的方法为本领域所知，例如本文中以上引用的美国专利中所述。多种库也可商购。[IV. B.结合测定在本发明的另一方面，鉴定0sEN0D93活化剂的方法包括确定测试试剂与 0sEN0D93蛋白的特异性结合。例如，鉴定0sEN0D93结合偶体的方法可包括(a)提供SEQ ID NO :3的0sEN0D93蛋白；(b)使0sEN0D93蛋白与一或多种测试试剂在对于结合而言足够的条件下接触；(c)测定测试试剂与分离的0sEN0D93蛋白的结合；及(d)选择展示特异性结合0sEN0D93蛋白的测试试剂。特异性结合也可含盖相互作用的质量或状态，以至于测试试剂与0sEN0D93蛋白的结合是抑制性或诱导性的。特异性结合指确定蛋白及其他生物材料的异质的群中有蛋白的结合反应。如果结合亲和力为约IXlO4M-1 约IXlO6M-1以上，测试试剂与0SEN0D93蛋白的结合可认为是特异性的。特异性结合也指可饱和的结合。为展示测试试剂与0sEN0D93蛋白的可饱和的结合，可进行 katchard 分析，例如，Mak et al，J. Biol. Chem.，1989，洸4 :21613-21618 所述。几种技术可用于不采用已知的竞争性抑制剂地检测0sEN0D93蛋白与测试试剂之间的相互作用。代表性的方法包括但不限于，荧光相关性光谱学，表面-增强的激光解吸/ 电离飞行时间光谱学，及BIACORE 技术，本文以下所述的各技术。这些方法服从自动化的，高-通量筛选。荧光相关性光谱学(FCQ测量小的样品体积之内荧光分子的平均扩散速度。样品尺寸可低至IO3个荧光分子及样品体积低至单个细菌细胞质。扩散速度是分子质量的函数， 及随着质量增加而降低。因此可通过测量结合之后分子的质量变化、从而扩散速度而将FCS 应用于蛋白-配体相互作用分析。在典型的实验中，待分析的靶(例如，0sEN0D93蛋白)作为有在N-端或C-端插入的序列标签(例如聚-组氨酸序列)的重组蛋白表达。表达在宿主细胞(例如大肠杆菌，酵母，爪蟾卵母细胞，或哺乳动物细胞)中介导。蛋白使用层析方法纯化。例如，可将聚-组氨酸标签用于将表达的蛋白结合到金属螯合物柱(例如鳌合到亚氨基二乙酸琼脂糖的Ni2+)。然后将蛋白用荧光标签，例如羧基四甲基罗丹明或B0DIPY 试剂(获自Molecular Probes of Eugene, Oregon)标记。然后将蛋白在溶液中暴露于潜在配体，及通过 FCS 使用获自 Carl Zeiss, Inc. (Thornwood of New York, New York)的仪表测定其扩散速度。配体结合通过蛋白扩散速度的变化测定。表面-增强的激光解吸/ 电离(SELDI)由 Hutchens&Yip，Rapid Commun· Mass Spectrom.，1993，7 :576-580开发。当偶联于飞行时间质谱仪(TOF)时，SELDI提供快速分析芯片上保留的分子的技术。可通过将靶蛋白，或其部分，共价结合到芯片上及通过质量光谱法分析结合此蛋白的小分子来将其应用于配体-蛋白相互作用分析(Worrall et al, Anal Chem.，1998，70 (4) :750-756)。在典型的实验中，使靶蛋白(例如，0sEN0D93蛋白)重组表达及纯化。通过利用聚-组氨酸标签或通过其他相互作用(例如离子交换或疏水相互作用)将靶蛋白结合到SELDI芯片。然后将由此制备的芯片经，例如，能够以连续方式移液配体的递送系统(自动采样器)暴露于潜在配体。然后将芯片在增加严格度溶液中洗涤， 例如用含增加离子强度的缓冲溶液的一系列洗涤。各洗涤后，通过将芯片交付于SELDI-T0F 来分析结合物质。特异性地结合靶蛋白的配体通过洗脱它们需要的洗涤严格度来鉴定。BIACORE 依赖于配体与固定到层的靶蛋白(例如，0sEN0D93蛋白)结合之后在表面层折射率的变化。在此系统中，以2 5μ 1细胞依次注射一批小的配体，其中所述靶蛋白固定到细胞之内。通过表面等离子体共振(SPR)通过记录从表面折射的激光来检测结合。一般而言，对于在表面层的质量浓度的给定变化的折射率变化对于全部蛋白及肽实际上相同，使单个方法对于任何蛋白可应用。在典型的实验中，使靶蛋白重组表达，纯化， 及结合到BIACORE 芯片。结合可通过利用聚-组氨酸标签或通过其他相互作用(例如离子交换或疏水相互作用)辅助。然后将由此制备的芯片经合并入由Biacore (Uppsala， Sweden)出售的仪器的递送系统暴露于一或多种潜在配体，以便以连续方式移液配体(自动采样器)。记录芯片上的sra信号，及折射率变化表示固定的靶和配体之间的相互作用。结合速率及解离速率的信号动力学分析使非特异性和特异性相互作用之间区别。也见 Homola et al. , Sensors and Actuators, 1999, 54 :3-15,及该文的参考文献。[IV. C.构象测定本发明也提供鉴定0sEN0D93结合偶体及活化剂的方法，其依赖于当被测试试剂结合或与测试试剂别样地相互作用时，0sEN0D93蛋白的构象变化。例如，将圆二色性应用到大分子溶液显示这些大分子的构象状态。技术可区别随机卷曲，α螺旋，及β链构象状态。为鉴定0sEN0D93蛋白的结合偶体及活化剂，可使用重组表达的EN0D93蛋白进行圆二色性分析。0sEN0D93蛋白，例如通过离子交换及大小排阻层析纯化，及与测试试剂混合。使混合物经历圆二色性。将测试试剂存在下0sEN0D93蛋白构象与无测试试剂的情况下0sEN0D93蛋白构象比较。在测试试剂的存在下0sEN0D93蛋白构象状态的变化鉴定 0sEN0D93结合偶体或活化剂。代表性的方法描述于美国专利No. 5，776，859和5，780，2420 结合偶体或活化剂的活性可使用功能测定评定，所述测定包括硝酸盐含量，硝酸盐摄取， 侧根生长，籽产率，氨基酸含量或植物生物质，如本文所述。[IV. D.功能测定在本发明的另一方面，鉴定0sEN0D93活化剂的方法采用有功能的0sEN0D93蛋白， 例如，如SEQ ID NO :3所示的。代表性的确定0sEN0D93功能的方法包括测定由0sEN0D93活性引起的生理变化，例如增强的侧根生长，增加的硝酸盐摄取，增加的硝酸盐含量，增加的籽产率，增加的氨基酸含量和/或增加的植物生物质(见，例如，实施例1，3 6，10和12)。例如，鉴定0sEN0D93活化剂的方法可包括(a)提供表达0sEN0D93蛋白的细胞； (b)使细胞与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定0sEN0D93靶基因的表达；及(d) 选择当相比对照试剂与测试试剂接触时诱导升高的0sEN0D93靶基因的表达的测试试剂， 该基因被0sEN0D93正常诱导(例如，氮代谢基因，碳代谢基因及光合产物转运基因)。根据公开的方法，表达0sEN0D93的细胞可以对于进行测定0sEN0D93功能有用的试剂盒的形式提供。例如，用于检测0sEN0D93活化剂的测试试剂盒可包括用编码全长0sEN0D93蛋白的 DNA转染的细胞及用于生长细胞的培养基。采用瞬时转染的细胞的0sEN0D93活性的测定可包括从非-转染的细胞区别转染的细胞的标记物。标记物可由用于0sEN0D93表达的构建体编码或别样地与用于0sEN0D93 表达的构建体相关，以至于细胞用编码0sEN0D93的核酸分子及标记物同时转染。作为标记物有用的代表性的可检测的分子包括但不限于异源核酸，由转染的构建体编码的蛋白 (例如，酶或荧光蛋白)，结合蛋白，及抗原。鉴定0sEN0D93活化剂的方法也可包括(a)提供表达0sEN0D93蛋白的植物；(b) 使植物与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定(i)硝酸盐含量；(ii)硝酸盐摄取； (iii)氨基酸含量；(iv)籽产率；或(V)生物质；及(d)选择诱导(i)增加的硝酸盐含量， ( )增加的硝酸盐摄取，(iii)增加的氨基酸含量，(iv)增加的籽产率，或(V)增加的生物质的测试试剂。采用表达重组0sEN0D93的细胞或表达0sEN0D93的植物的测定可附加地采用基本上无天然的0sEN0D93及，任选地，基本上类似于0sEN0D93蛋白的蛋白的对照细胞或植物。当使用瞬时转染的细胞时，对照细胞可包括，例如，未转染的宿主细胞。当使用表达 0sEN0D93蛋白的稳定的细胞系时，对照细胞可包括，例如，用于衍生0sEN0D93-表达细胞系的亲本细胞系。当使用植物时，对照植物可包括0sEN0D93过表达植物。在此实例中， 0sEN0D93活化剂引起类似于0sEN0D93过表达植物的表型。IV.E.合理的设计天然的0sEN0D93蛋白的结构的知识提供用于0sEN0D93活化剂的合理的设计的方法。简言之，0sEN0D93蛋白的结构可通过X射线晶体学和/或通过产生3-维呈现的计算的算法测定。见 Saqi et al,Bioinformatics, 1999,15 :521-522 ；Huang et al,Pac. Symp. Biocomput，2000，230-241 ；及 PCT 国际公开 No. WO 99/26966。或者，EN0D93 蛋白结构的
22工作模型可通过同源性建模推导(Maalouf et al.，J. Biomol. Struct. Dyn.，1998，15 (5) 841-851)。计算机模型可还预测蛋白结构与可合成及使用本文以上所述的测定测试的各底物分子的结合。额外的化合物设计技术描述于美国专利No. 5，834，228和5，872，011。0sEN0D93蛋白是可溶性蛋白，其可纯化及浓缩用于结晶化。可将纯化的0sEN0D93 蛋白在以下之至少一种变化的条件下结晶化pH，缓冲液类型，缓冲液浓度，盐类型，聚合物类型，聚合物浓度，其他沉淀配体，及纯化的0sEN0D93浓度。产生晶体蛋白的方法为本领域所知，及可合理地适于确定如本文所述的0sEN0D93蛋白。见例如，Deisenhofer et al.， J. Mol. Biol, 1984,180 :385-398 ；Weiss et al.，FEBS Lett.，1990，267 :268-272 ；或商业试剂盒中提供的方法，例如结晶筛选 试剂盒(获自Hampton Research of Riverside, California, USA)。可测试结晶化的0sEN0D93蛋白的功能活性，及进一步测试不同尺寸的及形状的结晶的X射线衍射中的适应性。一般而言，更大的结晶相比更小的结晶提供更佳晶体学，及更厚的结晶相比更薄的结晶提供更佳晶体学。优选地，0sEN0D93结晶尺寸跨0. 1 1. 5mm。 这些结晶衍射X射线到至少10人分辨率，例如1.5~ 10.0人或该值内任何范围，例如1.5， 1. 6,1. 7,1. 8,1. 9,2. 0,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4， 3. 5或3，3.5人或以下对于最高分辨率优选。IV. F. 0sEN0D93 抗体在本发明的另一方面，提供产生特异性结合0sEN0D93蛋白的抗体的方法。根据方法，配制全长重组0sEN0D93蛋白，从而其可将用作有效免疫原，及用于免疫动物，以产生动物的免疫应答。免疫应答特征在于产生可收集自动物血清的抗体。抗体是包括抗原结合位点的免疫球蛋白，或抗体片段(例如，Fab，修饰的Fab， Fab' , F(ab' )2或Fv片段，或具有至少一个免疫球蛋白轻链可变区或至少一个免疫球蛋白重链区的蛋白)。本发明的抗体包括二体，四聚体抗体，单链抗体，四价抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，及识别特定表位的结构域-特异性抗体。产生抗-0sEN0D93 抗体的细胞系也包括在本发明内。针对0sEN0D93蛋白的抗体的特异性结合指在包括多种不同的抗原的异质的样品中优先结合到0sEN0D93蛋白。基本上缺少结合描述抗体结合到对照蛋白或样品，即，结合水平表征为非特异性或背景结合。如果结合亲和力至少为约10_7M或更高，例如至少约10_8M 或更高，包括至少约ΙΟ—Μ或更高，至少约1(Γ"Μ或更高，或至少约或更高，抗体与抗原的结合是特异性的。如本文所述制备的0sEN0D93抗体可用于本领域中已知的涉及0sEN0D93蛋白的表达及活性的方法，例如，用于克隆编码0sEN0D93蛋白的核酸，免疫纯化0sEN0D93蛋白，及在植物样品中检测0sEN0D93蛋白，及在植物样品中测量0sEN0D93蛋白的水平。为实施所述方法，本发明的抗体可还包括可检测的标记物，包括但不限于放射性的标记物，荧光标记物， 表位标记物，及可体内检测的标记物。本领域技术人员已知选择适宜于特定检测技术的标记物的方法，及缀合到或别样地联系可检测的标记物与抗体的方法。V. 0sEN0D93的过表达公开的0sEN0D93结合偶体及0sEN0D93活化剂对于通常与评定对氮水平的应答及促进氮使用效率相关的应用体外及体内有用。尤其是，0sEN0D93活化剂可用于诱导0sEN0D93的转录，增加植物的硝酸盐含量，增加硝酸盐摄取入植物根，增加植物籽产率，增加植物的氨基酸含量及增加植物生物质。本发明提供将有效量的0sEN0D93活化剂施用于植物，即，足以引起期望的生物应答的量。例如，有效量的0sEN0D93活化剂可包括足以引起下列的量升高的0sEN0D93，正常用于0sEN0D93诱导的基因(例如，氮代谢基因，碳代谢基因及光合产物转运基因)的表达，植物根中增加的硝酸盐含量，植物根中增加的硝酸盐摄取，增加的侧根萌发，增加的籽产率，增加的氨基酸含量及增加的生物质。可受益于0sEN0D93活化的植物包括但不限于，玉米，高粱，小麦，葵花，番茄，十字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花，稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，及油籽油菜，芸苔属，紫花苜蓿，黑麦，粟，红花，花生，蕃薯，木薯，咖啡，椰子，菠萝，柑橘树，可可，茶，香蕉，鳄梨，无花果，番石榴，芒果，橄榄，番木瓜，腰果，澳洲坚果，杏仁，燕麦，蔬菜，观赏植物，及松柏类植物。代表性的蔬菜包括番茄，莴苣，四季豆，利马豆，豌豆，山药，洋葱，及甜瓜属成员(例如黄瓜，罗马甜瓜，及香瓜)。代表性的观赏植物包括但不限于，杜鹃花，八仙花，芙蓉属植物， 蔷薇科植物，郁金香，水仙花，牵牛花，康乃馨，一品红，及菊花。前述植物之任何可为野生型植物，近亲交配植物，或转基因植物，例如，农业环境中使用的植物株及遗传修饰的植物。用0sEN0D93活化剂处理的植物可为转基因植物，S卩，为赋予增强的氮使用效率或其他特性目的在0sEN0D93，或在不同于0sEN0D93的座位遗传修饰的植物。代表性的期望的特性包括改善的作物产率；增加的籽产率；增加的氨基酸含量；增加的硝酸盐含量；增加的应激耐受性；昆虫抗性；广谱除草剂耐受性；对于由病毒，细菌，真菌，及虫所致的疾病的抗性；及从环境应激(例如热，冷，旱，及高盐浓度)保护的机理增强。额外的期望的特性包括使消费者受益的输出特性，例如，含更多淀粉或蛋白，更多维生素，更多抗氧化剂，和 /或更少反式-脂肪酸的营养增强的食品；有改善的口味，增加的货价期，及更佳成熟特征的食品；使少环境损害地产生纸可能的树；无烟碱烟草；有新色彩，芳香，及增加的寿命的观赏植物花卉；等。再者，根据本发明可使用的期望特性包括植物中产生的作为用于制备以下的手段的基因产物，例如，用于疾病治疗及疫苗接种的治疗性蛋白；织物纤维；可生物降解的塑料；用于漆，去污剂，及润滑剂的油；等。对于赋予与增加的改变的基因表达，硝酸盐含量，硝酸盐摄取，侧根生长，籽产率，氨基酸含量或植物生物质相关的特性的遗传修饰， 用0sEN0D93活化剂及遗传修饰处理的组合可产生协同效应，即，基因表达，硝酸盐含量，硝酸盐摄取，侧根生长，籽产率，氨基酸含量或植物生物质中的变化大于由任一遗传修饰单独引起的变化。
实施例已包括以下实施例来阐述本发明的模式。以技术术语及被本共-发明人发现或含盖的方法描述以下实施例的某些方面，以在本发明的实践中工作良好。鉴于本公开内容及本领于技术人员的一般水平，那些技术人员将认同以下实施例仅旨在例示，及在不脱离本发明的范围的情况下可采用多种变化，修饰，及改变。实施例1暴露于不同的氮水平的植物中生物质的变化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica)Donjin变种植物生长在泥炭藓及蛭土的混合物(1 4) (SunGro Horticulture Canada Ltd. BC, Canada)中，一周一次添加含不同的量的硝酸盐的营养溶液直到收获。营养溶液含4mM MgSO4, 5mM KCl,5mM CaCl2, ImMKH2PO4,0. ImM Fe-EDTA,0. 5mM MES (ρΗ6· 0)，9 μ M MnSO4,0. 7μ M ZnSO4,0. 3μ M CuSO4, 46 μ M NaB4O7和0. 2μΜ(ΝΗ4)6Μο702。将IOmM硝酸盐用作高氮条件，5mM硝酸盐作为中氮，及 ImM硝酸盐作为低氮。植物生长在有于28 30°C 16小时光照(-400 μ moIm^s"1)及于22 24V 8小时暗的生长室4周。独立地收获芽及根，及评定生物质差异作为生长标记物。在中氮浓度(5mM硝酸盐)下通过芽生物质所测的植物生长降至大致在高氮浓度 (IOmM硝酸盐)的70% (干重的73% )，及在低氮浓度(ImM硝酸盐)下通过芽生物质所测的植物生长进一步降至在高氮浓度(IOmM硝酸盐)的大致30% (干重的33%)(图1A)。 在2种限制氮浓度下根生物质降低稍微多于芽，其分别为干重的69%及25% (图1B)，导致增加的芽/根比及增加的氮应激(图1C)。实施例2响应氮缺乏使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin变种植物如实施例1中所述生长。当N缺乏发生时，叶黄化及有紫色类黄酮花青苷是植物具有的一些典型的应答(Diaz U，et al, Plant and Cell Physiology，2006，47 :74-83)。相对花青苷含量基于由 Neff 及 Chory 描述的方法分析(Neff MM&Chory J,Plant Physiol, 1998,118 :27-35)。总叶绿素任一使用Minolta SPAD 502DL叶绿素仪(Tokyo，Japan)测量，或通过乙醇提取及通过分光光度计根据Kirk(Kirk，JT0，Planta，Berl，1968，78 :200)测试。叶中叶绿素及花青苷水平在高及中氮条件下类似。在低氮条件下，植物不是明显的黄或紫，尽管相比高及中氮条件，叶绿素降低及花青苷增加显著(图ID及1E)。实施例3暴露于不同的氮水平的植物中游离的硝酸盐含量的变化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin变种植物如实施例1中所述生长。冷冻的芽及根组织用于测定在不同的氮条件下硝酸盐含量的差异。硝酸盐含量根据 Cataldo DA, et al, Commun. Soil ScL Plant Anal 1975，6 :71-80 通过比色测定分析。芽中的游离的硝酸盐含量在中氮浓度(5mM硝酸盐)下降至在高氮浓度(IOmM硝酸盐)的70 % (3. 35mg/gFff对比4. 55mg/gFff)，及在低氮浓度(ImM硝酸盐)下不更降低 (2. 85mg/gFW对比4. 55mg/gFff)(图2A)。根中的游离的硝酸盐含量在中氮浓度(5mM硝酸盐)下相比高氮浓度(IOmM硝酸盐)降低约半(4. 8mg/gFff对比9. 9mg/gFff)，及在低氮浓度(ImM硝酸盐)下相比在高氮浓度(IOmM硝酸盐)发生几乎20倍下降(0. 45mg/gFW对比 9. 9mg/gFff)(图 2B)。实施例4暴露于不同的氮水平的植物中氨基酸含量的变化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin变种植物如实施例1中所述生长。将冷冻的芽及根组织用于测定在不同的氮条件下氨基酸含量的差异。用80%，50% 及0%乙醇在IOmM HEPES-K0H(pH 7.4)中连续提取总氨基酸，将上清合并，及根据Rosen H, Arch. Biochem. Biophys. 1957,67 :10-15 测定总氨基酸。芽中的总氨基酸含量在中氮浓度(5mM硝酸盐)下降至在高氮浓度(IOmM硝酸盐) 的77%，及在低氮浓度(ImM硝酸盐)下降至在高氮浓度(IOmM硝酸盐)的35% (图2C)。 在根中观察到类似降低(图2D)。实施例5暴露于不同的氮水平的植物中可溶性蛋白含量的变化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin变种植物如实施例1中所述生长。将冷冻的芽及根组织用于测定在不同的氮条件下可溶性蛋白含量的差异。总可溶性蛋白用含 IOOmM HEPES-KOH, pH 7. 5，及 0. 1 % iTriton X-100 的缓冲液提取，及使用 Bio-Rad 蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories, Inc. , California, USA)测定。在中氮浓度(5mM硝酸盐)下芽中的总可溶性蛋白类似于在来自在高氮浓度 (IOmM)下生长的植物的芽中观察到的水平，但在低氮浓度(ImM)下显著更低(图2E)。在相同的条件下生长的根中观察到类似结果(图2F)。实施例6暴露于不同的氮水平的植物中总氮含量的变化使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin变种植物如实施例1中所述生长。将冷冻的芽及根组织用于测定在不同的氮条件下总氮含量的差异。干燥的组织中总氮的百分率通过微-Dumas燃烧分析方法使用Carlo Erba NA1500 C/N分析仪测量(Carlo Erba Strumentazione, Milan, Italy)。在中氮浓度(5mM硝酸盐)下芽中的总氮百分率类似于在来自在高氮浓度(IOmM) 下生长的植物的芽中观察到的水平，但在低氮浓度(ImM)下显著更低(图2G)。在相同的条件下生长的根中观察到类似结果(图2H)。实施例7暴露于不同的氮水平的植物中区别表达的基因的鉴定使野生型日本水稻(Oryza sativa Japonica) Donjin变种植物如实施例1中所述生长。收获在高氮浓度(IOmM硝酸盐)，中氮浓度(5mM硝酸盐)及低氮浓度(ImM硝酸盐) 下生长的4周龄野生型稻植物的芽及根来比较在不同的，但稳定的氮浓度下基线基因表达水平。各氮浓度具有3个生物学重复。附加地，在收获之前2小时，将在低氮浓度(ImM硝酸盐)下生长的一些植物转移到高氮浓度(IOmM硝酸盐)来评定响应2小时氮诱导的基因表达变化。将在高氮浓度(IOmM硝酸盐)下生长的其他植物转移到低氮浓度(ImM硝酸盐) 来评定响应2小时氮降低的基因表达变化。全部样品在中午采取，以最小化碳及氮代谢的昼变化。收集各时间点的3个生物学重复。将来自各样品的5 μ g的总RNA用于合成双链cDNA。将从cDNA合成的标记的互补 RNA与自定义设计的稻GENECHIP 全基因组阵列杂交(zhu T，Current Opinion in Plant Biology 2003,6 :418-425)。由GENECHIP 扫描仪3000获得阵列的杂交信号， 及通过MAS 5.0(Affymetrix, California，美国)定量。探针组测量总结为一组中全部探针的加权平均值，使用自定义算法减去整个阵列的平均强度的底部5%。将各阵列的全部探针组的总体强度进一步标度到100的靶强度以使直接比较。在以下样品(对于芽及根各4个)之间进行8个比较(1)高氮浓度对比中氮浓度(IOmM硝酸盐对比5mM硝酸盐)；( 高氮浓度对比低氮浓度(IOmM硝酸盐对比ImM硝酸盐)；(3)低氮浓度(ImM硝酸盐)对比低to高氮浓度O小时氮诱导)；及⑷高氮浓度 (IOmM硝酸盐)对比高到低氮浓度O小时氮降低)。收集的数据使用GeneSpring(Agilent，California，美国)分析。数据使用程序的默认设置标准化，然后是基因筛选，其要求各基因在3个复制样品中必需具有任一'P' 或'M'标记。此之后是第二筛选步骤要求3个样品之至少一个具有'P'标记。此基本上保证组中留下的每个基因将是3个重复之中'PMM'，‘ PPM'，或'PPP'。对于配对组比较，首先鉴定有2-倍变化的基因，然后将ANOVA用于鉴定显著的基因(Welch t检验， 0. 05的ρ-值截止值)。
为确认微阵列分析的结果，通过定量实时PCR测试来自不同的比较组的8个显著的基因的表达。使用TRIZOL试剂(Invitrogen，California，美国)从植物组织分离总 RNA。为消除任何残留的基因组DNA，总RNA用无RQl RNA酶的DNA酶(!Iomega，Wisconsin， 美国)处理。通过使用反转转录系统试剂盒(ftOmega)从总RNA合成第一链cDNA。将 PRIMER EXPRESS 2· 0 软件(Applied Biosystems, California, USA)用于设计引物。 基本上根据 Kant S，et al. ,Plant Cell Environ.，2006，四1220-12 进行实时 PCR。各靶基因的相对定量(RQ)值通过方法(Livak KJ, Schmittgen TD,Methods, 2001, 25 402-408)使用ACTIN2作为内部参照基因(用于比较来自不同的PCR运行或cDNA样品的数据)计算。为确保2_“"方法的有效性，将来自对照植物盐芥(Thellimgiella)及拟南芥的cDNA的2倍系列稀释液用于创建标准曲线，及靶及参照基因的扩增效率显示大致相等 (Livak &khmittgen，2001年)。相对表达水平的结果与微阵列数据非常一致。对于芽及根，全部基因的基线表达水平在高及中氮浓度下生长的样品之间仍类似(表1)。但是，在低氮浓度下根及芽之间的转录变化不同，如在根样品中鉴定59种显著的基因(27种上调的， 及32种下调的)，但在芽样品中无(表1)。表1
权利要求
1.分离的0sEN0D93核酸，其包括(a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；(b)与SEQID NO 1的互补序列在严格杂交条件下特异性地杂交的核酸； (C)SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；(d)与SEQID NO 2的互补序列在严格杂交条件下特异性地杂交的核酸；(e)核苷酸序列，其编码包括SEQID NO 3所示的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白；或(f)互补于(a) (e)的核酸的核苷酸序列。
2.载体，其包括权利要求1的核酸。
3.宿主细胞，其表达权利要求2的载体。
4.权利要求3的宿主细胞，其是植物细胞。
5.分离的0sEN0D93蛋白，其包括SEQID NO 3所示的氨基酸序列。
6.抗体或抗体片段，其特异性结合权利要求5的分离的0sEN0D93蛋白。
7.转基因植物，其经权利要求1的核酸转化。
8.权利要求7的植物，其是单子叶植物。
9.权利要求7的植物，其是双子叶植物。
10.产生转基因植物的方法，其包括将重组核酸导入植物细胞，其中所述重组核酸包括(a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；(b)与SEQID NO 1的互补序列在严格杂交条件下特异性地杂交的核酸； (C)SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；(d)与SEQID NO 2的互补序列在严格杂交条件下特异性地杂交的核酸；或(e)核苷酸序列，其编码包括SEQID N0:3所示的氨基酸序列的0sEN0D93蛋白。
11.权利要求10的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞。
12.权利要求10的方法，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞。
13.权利要求10的方法，其中使用选自下列的方法将所述重组核酸导入植物细胞微粒轰击，土壤杆菌-介导的转化，及颈须-介导的转化。
14.权利要求13的方法，其中所述重组核酸的导入导致权利要求10的核酸序列的组成性过表达。
15.权利要求10的方法，其中所述植物显示在以下方面增加氮使用效率，籽产率，应激耐受性，硝酸盐水平，生物质，或氨基酸水平。
16.权利要求15的方法，其中所述植物显示增加的氮使用效率。
17.鉴定增强编码0sEN0D93蛋白的核酸的表达水平的试剂的方法，包括(a)提供表达权利要求5的0sEN0D93蛋白的细胞；(b)使细胞与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定编码0sEN0D93蛋白的核酸的表达；(d)选择当相比对照试剂与测试试剂接触时，诱导核酸的升高的表达的测试试剂。
18.权利要求17的方法，其中所述一或多种测试试剂是肽，蛋白，寡聚体，核酸，小分子，无机化学物质，有机化学物质或抗体。
19.增加编码0sEN0D93蛋白的核酸的表达水平的方法，其包括使表达权利要求5的0sEN0D93蛋白的植物或细胞与根据权利要求17的试剂接触。
20.权利要求19的方法，其中所述核酸显示组织-特异性表达。
21.鉴定0sEN0D93蛋白的结合偶体的方法，所述方法包括下列步骤(a)提供权利要求5的0sEN0D93蛋白；(b)使0sEN0D93蛋白与一或多种测试试剂或对照试剂在对于结合而言足够的条件下接触；(c)测定测试试剂与分离的0sEN0D93蛋白的结合；及(d)选择展示特异性结合0sEN0D93蛋白的测试试剂。
22.权利要求21的方法，其中所述一或多种测试试剂是肽，蛋白，寡聚体，核酸，小分子，无机化学物质，有机化学物质或抗体。
23.鉴定0sEN0D93活化剂的方法，其包括下列步骤(a)提供表达权利要求5的0sEN0D93蛋白的细胞；(b)使细胞与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定0sEN0D93靶基因的表达；及(d)选择当相比对照试剂与测试试剂接触时诱导靶基因的升高的表达的测试试剂，该基因正常经历0sEN0D93诱导。
24.权利要求23的方法，其中所述一或多种测试试剂是肽，蛋白，寡聚体，核酸，小分子，无机化学物质，有机化学物质或抗体。
25.权利要求23的方法，其中所述靶基因选自氮代谢基因，碳代谢基因，及光合产物转运基因。
26.鉴定0sEN0D93活化剂的方法，其包括下列步骤(a)提供表达权利要求5的0sEN0D93蛋白的植物；(b)使植物与一或多种测试试剂或对照试剂接触；(c)测定所述植物的硝酸盐含量，氨基酸含量，氮摄取，籽产率，或生物质；及(d)选择当相比对照试剂在测试试剂的存在下诱导增加的硝酸盐含量，增加的氨基酸含量，增加的硝酸盐摄取，增加的籽产率或增加的生物质的测试试剂。
27.权利要求沈的方法，其中所述一或多种测试试剂是肽，蛋白，寡聚体，核酸，小分子，无机化学物质，有机化学物质或抗体。
28.改良植物产率的方法，包括使植物与权利要求21的0sEN0D93结合剂接触。
29.权利要求观的方法，其中所述植物是单子叶植物。
30.权利要求观的方法，其中所述植物是双子叶植物。
31.改良植物产率的方法，包括使植物与权利要求沈的0sEN0D93活化剂接触。
32.权利要求31的方法，其中所述植物是单子叶植物。
33.权利要求31的方法，其中所述植物是双子叶植物。
全文摘要
用于改善的氮利用，增加的产率，及增加的应激耐受性的分离的核酸及蛋白、以及表达所述分离的核酸及蛋白的植物。
文档编号C12N15/82GK102164953SQ200980137557
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者J·克拉克, S·康德, S·罗思坦, Y-M·比 申请人:先正达参股股份有限公司, 圭尔夫大学