专利名称：肺癌及结肠直肠癌的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种肿瘤相关的分子标记，特别是关于一种外周血液中的肿瘤相关的分子标记。
背景技术：
肺癌主要可分为两种，非小细胞肺癌(NSCLC)以及小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌约占了肺癌的80%。在美国三种最常见的非小细胞肺癌为肺腺癌/支气管肺泡癌 (35-40% )、鳞状细胞癌05-30% )及大细胞肺癌(10-15% )。肺癌若在罹患初期诊断出来，是最容易成功治愈的。初期癌症是指还未生长至大体积或转移至身体其它部位。若是较大的或已转移的癌症较难被治疗。结肠直肠癌(Colorectal cancer)又称为结肠癌(colon cancer)或大肠癌 (large bowel cancer)，包括发生在结肠、直肠及阑尾的癌症。为第三常见的癌症，且在西方国家中为致死率排名第二的癌症。许多结肠直肠癌被认为是由结肠的腺瘤息肉发展而成。那些蕈状的息肉通常是良性的，但有些会随时间发展成癌症。大多情况下，局部结肠癌都是以结肠镜进行诊断。用于早期肺癌及结肠直肠癌的诊断标记，对于这些疾病的发病率及致死率方面具有重大影响。检测癌细胞专一性的生化标记，可作为有效的筛检策略。并可用于筛检手术后残余肿瘤细胞及隐匿性转移(一种肿瘤再生的早期指标)。因此，早期检测可改善患者的存活率，包括在症状为临床上可检测之前、接受治疗时、以及在缓解时。肿瘤组织中某些标记， 已知在该领域中可预测患者的罹癌风险，然而，未被预期也不是可预期到的是，同一标记可在血液中被检测到(参阅发明说明；在肿瘤组织的癌症基因标记对照血液样本)。因此，迄今为止在该领域中存在了一些缺陷及不足之处，特别是关于在外周血液样本中检测肺癌及结肠直肠癌的方法。
发明内容
本发明的实施例是关于检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性的方法。 该方法包括下列步骤(a)由个体取得包括有核酸的体液的检测样本；(b)量测至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由(i)DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4、NFl 及 MDM2 所组成的群组；或(ii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NFl、MMD、RNF4、GRB2 及 EXT2 所组成的群组；(c)以持家基因(houseke印ing gene)对该至少一个癌症基因标记的表达量进行标准化；(d)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型 (logistic regression prediction model)，计算出癌症和/或癌症复发风险的机率；以及(e)基于该计算出的机率以决定肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。在本发明的一实施例中，检测样本为血液样本。在本发明的另一实施例中，利用实时聚合酶链式反应(real-time PCR)量测至少一个癌症基因标的的表达程度。在本发明的另一实施例中，在步骤(b)通过该检测样本的循环数目以定量出mRNA 表达量[Ct (测试)(Ct (test))]，且其中步骤(C)的标准化是通过将持家基因的mRNA表达量[Ct (HK)]减去Ct (test)，以得到该检测样本的标准化mRNA表达量["Ct (test)]。在本发明的另一实施例中，该持家基因是选自由次黄嘌呤磷酸核糖转移 Sl (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1， HPRT1) (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)所组成白勺群组。在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测DUSP6的表达量。在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测以下六种癌症基因标记的表达量 DUSP6、MDM2、NF1、EIF2S3、MMD&RNF4 的表达量。在本发明的另一实施例中，其中该至少一个癌症基因标记是选自由DUSP6、 EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2所组成的群组，且其中步骤(e)是决定肺癌和/ 或结肠直肠癌的存在和/或严重性。在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测出下列的表达量，包括至少(i)八种癌症基因标记；(ii)七种癌症基因标记；(iii)六种癌症基因标记；(iv)五种癌症基因标记； (ν)四种癌症基因标记；(vi)三种癌症基因标记；或(vii) 二种癌症基因标记。在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测出下列的表达量，包括⑴该一个癌症基因标记DUSP6(ii)该二个癌症基因标记DUSP6及EIF2S3 ；(iii)该三个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3及GRB2 ；(iv)该四个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、GRB2 及 RNF4 ；(ν)该五个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4 及 MMD ；(vi)该六个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD 及 MCM4 或 NFl ；(vii)该七个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4 及 MDM2 或 NFl ；(viii)该三个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3及MDM2 ；(ix)该四个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2 及 NFl ；(χ)该五个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NFl 及 MMD ；(xi)该六个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD&RNF4 ；(xii)该七个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4&GRB2 ；或(xiii)该八个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2 及 EXT2。在本发明的另一实施例中，利用实时聚合酶链式反应(real-time PCR)量测各个癌症基因标的的表达程度，所使用的引物对选自由下列引物对1至9所组成的群组，包括(i)DUSP6(SEQ ID NO :9)专一'性引物对 1:SEQ ID NOs 137 及 138，或 SEQ IDNOs. 139 及 140 ；(ii)EIF2S3(SEQ ID NO 1)专一性引物对 2 :SEQ ID NOs. 17及 18，SEQ ID NOs. 19 及 20，SEQ ID NOs. 21 及 22，SEQ ID NOs. 23 及 24，SEQ ID NOs. 25 及 26，SEQ ID NOs. 27 及 28，SEQ ID NOs. 29 及 30，或 SEQ ID NOs :31 及 32 ；(iii)MDM2(SEQ ID NO 4)专一性引物对 3 :SEQ ID NOs :75&76，SEQ ID NOs :77 及 78，SEQ ID NOs :79 及 80，或 SEQ ID NOs :81 及 82 ；(iv) NFl (SEQ ID NO 6)专一性引物对 4:SEQ ID NOs :97 及 98，SEQ ID NOs 99 及 100，SEQ ID NOs :101 及 102，SEQ ID NOs :103 及 104，SEQ ID NOs :105 及 106，SEQ ID NOs 107 及 108，SEQ ID NOs :109 及 110，SEQ ID NOs :111 及 112，或 SEQ ID NOs :113 及 114 ；(v)MMD (SEQ ID NO 7)专一性引物对 5 :SEQ ID NOs :115 及 116，SEQ ID NOs :117 及 118，或 SEQ ID NOs :119 及 120 ；(vi)RNF4(SEQ ID NO 8)专一性引物对 6 :SEQ ID NOs :121 及 122，SEQ ID NOs 123 及 124，SEQ ID NOs :125 及 126，SEQ ID NOs :127 及 128，SEQ ID NOs :129 及 130，SEQ ID NOs 131 及 132，SEQ ID NOs :133 及 134，或 SEQ ID NOs :135 及 136 ；(vii)GRB2(SEQ ID NO 5)专一性引物对 7 :SEQ ID NOs :83&84，SEQ ID NOs :85 及 86，SEQ ID NOs 87及 88 ；SEQ ID NOs 89 及 90，SEQ ID NOs91及 92，SEQ ID NOs 93 及 94，或 SEQ ID NOs 95 及 96 ；(viii)EXT2(SEQ ID NO 2)专一性引物对8 :SEQ ID NOs :33及34，SEQ ID NOs :35 及 36，SEQ ID NOs 37 及 38，SEQ ID NOs 39 及 40，SEQ ID NOs 41 及 42，SEQ ID NOs 43 及 44，SEQ ID NOs 45 及 46，SEQ ID NOs 47 及 48，SEQ ID NOs 49 及 50，或 SEQ ID NOs 51 及 52 ；(ix)MCM4(SEQ ID NO 3)专一性引物对 9 :SEQ ID NOs :53 及 54，SEQ ID NOs 55 及 56，SEQ ID NOs 57及 58，SEQ ID NOs 59 及 60，SEQ ID NOs 61及 62，SEQ ID NOs 63 及 64，SEQ ID NOs 65 及 66，SEQ ID NOs 67 及 68，SEQ ID NOs 69 及 70，SEQ ID NOs 71 及 72，或 SEQ ID NOs 73 及 74。在本发明的另一实施例中，在步骤(e)决定出肺癌的存在和/或严重性时则选择该 EIF2S3(SEQ ID NO 1)专一性引物对 2:SEQ ID NOs :27 及 28、及 SEQ ID NOs :31 及 32、 该 NFl (SEQ ID NO 6)专一性引物对 4:SEQ ID NOs 103 及 104、和 / 或该 GRB2 (SEQ ID NO:
5)专一性引物对7=SEQ ID NOs :91及92，若在步骤(e)决定结肠直肠癌的存在和/或严重性时则不选用这些引物对。在本发明的另一实施例中，在步骤(e)决定出结肠直肠癌的存在和/或严重性时则选择该 EIF2S3(SEQ ID NO 1)专一性引物对 2 :SEQ ID NOs 19 及 20、该 NFl (SEQ ID NO:
6)专一性引物对4 :SEQ ID NOs :113 及 114、该 EXT2 (SEQ ID NO 2)专一性引物对:SEQ ID NOs :47 及 48、和 / 或该 MCM4(SEQID NO 3)专一性引物对 9:SEQ ID NOs 67 及 68，若在步骤(e)决定肺癌的存在和/或严重性时则不选用这些引物对。本发明另一实施例是关于一种监测和/或评估患者对癌症治疗的预后反应的方法。该方法包括下列步骤(a)在接受结肠直肠癌及肺癌的癌症治疗之前及之后，由该患者取得包括有核酸
9的体液样本群；(b)量测至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由DUSP6、 EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD, MCM4、NFl 及 MDM2 所组成的群组；(c)以持家基因(houseke印ing gene)对该至少一个癌症基因标记的表达量进行标准化；(d)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型 (logistic regression prediction model)计算出癌症和/或癌症复发的机率；以及(e)比较该样本群的计算后机率以评估该反应，而借此监测和/或评估该患者对该癌症治疗的预后反应；其中在接受癌症治疗后该机率的降低是该癌症治疗为正反应(positive response)的表征。本发明另一实施例是关于一种监测和/或评估患者对癌症治疗的预后反应的方法。该方法包括下列步骤(a)在接受结肠直肠癌及肺癌的癌症治疗之前，由该患者取得包括有核酸的体液的第一样本；(b)在接受该治疗之后，由该患者取得包括有核酸的体液的第二样本；(c)量测该第一样本及第二样本中至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD, MCM4、NFl及MDM2所组成的群组；以及(d)比较在该第一样本及第二样本中所量测出的表达量，并借此监测和/或评估该患者对于该癌症治疗的预后反应；其中(i)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中DUSP6、GRB2、MCM4和/ 或NFl表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌和/或肺癌复发的风险；(ii)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；以及(iii)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中EIF2S3、MMD和/或 RNF4表达量的增加，代表该个体并未有形成肺癌的风险。本发明的一实施例是关于一种检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性的方法。该方法包括下列步骤(a)由个体取得包括有核酸的体液的检测样本；(b)量测至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由(i)DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4、NFl 及 MDM2 所组成的群组；或(ii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NFl、MMD、RNF4、GRB2 及 EXT2 所组成的群组；以及(c)将该至少一个基因标记的表达量与相对应基因标记的表达量作比较，该相对应癌症基因标记取自非癌症对照组的体液检测样本，并借此检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性；其中(i)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、GRB2、MCM4 和/或NFl表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌的风险；(ii)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；
(iii)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD和/ 或RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成肺癌的风险；(iv)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、GRB2、MDM2 和/或NFl表达量的增加，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险；(ν)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD, EXT2 和/或RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险；该方法更包括(a)以持家基因对该至少一个癌症基因标记的表达量进行标准化； (b)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型，计算出癌症和/ 或癌症复发的机率；以及(c)基于该计算出的机率以决定肺癌和/或结肠直肠癌的存在和 /或严重性。本发明的另一实施例是关于一种使用于上述方法的试剂盒，以检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。该试剂盒包括一或多个引物对，选自由下列基因标记专一性引物对所组成的群组(i)DUSP6(SEQ ID NO 9)专一性引物对；(ii)EIF2S3(SEQ ID NO 1)专一性引物对；(iii)MDM2(SEQ ID NO 4)专一性引物对；(iv) NFl (SEQ ID NO 6)专一性引物对；(v)MMD(SEQ ID NO 7)专一性引物对；(vi) RNF4 (SEQ ID NO 8)专一性引物对；(vii)GRB2(SEQ ID NO 5)专一性引物对；(viii)EXT2(SEQ ID NO 2)专一性引物对；(ix)MCM4(SEQ ID NO 3)专一性引物对。本发明的另一实施例是关于一种使用于上述方法的试剂盒，以检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。该试剂盒包括一个或多个引物对，选自由下列基因标记专一性引物对1-9所组成的群组(i)DUSP6(SEQ ID NO :9)专一'性引物对 1:SEQ ID NOs 137 及 138、或 SEQ ID NOs. 139 及 140 ；(ii)EIF2S3(SEQ ID NO 1)专一性引物对2 :SEQ ID NOs. 17及 18、SEQ ID NOs. 19 及 20、SEQ ID NOs. 21 及 22、SEQ ID NOs. 23 及 24、SEQ ID NOs. 25 及 26、SEQ ID NOs. 27 及 28、SEQ ID NOs. 29 及 30、或 SEQ ID NOs 31 及 32 ；(iii)MDM2(SEQ ID NO 4)专一性引物对 3 :SEQ ID NOs :75 及 76、SEQ ID NOs :77 及 78、SEQ ID NOs 79 及 80、或 SEQ ID NOs 81 及 82 ；(iv) NFl (SEQ ID NO 6)专一性引物对 4:SEQ ID NOs :97 及 98、SEQ ID NOs 99 及 100、SEQ ID NOs :101 及 102、SEQ ID NOs :103 及 104、SEQ ID NOs :105 及 106、SEQ ID NOs 107 及 108、SEQ ID NOs :109 及 110、SEQ ID NOs :111 及 112、或 SEQ ID NOs :113 及 114 ；(v)MMD (SEQ ID NO 7)专一性引物对 5 :SEQ ID NOs :115 及 116、SEQ ID NOs :117 及 118、或 SEQ ID NOs :119 及 120 ；(vi)RNF4(SEQ ID NO 8)专一性引物对 6 :SEQ ID NOs :121 及 122，SEQ ID NOs 123 及 124、SEQ ID NOs :125 及 126、SEQ ID NOs :127 及 128、SEQ ID NOs :129 及 130、SEQ ID NOs 131 及 132、SEQ ID NOs :133 及 134、或 SEQ ID NOs :135 及 136 ；(vii)GRB2(SEQ ID NO 5)专一性引物对 7 :SEQ ID NOs :83 及 84、SEQ ID NOs :85 及 86、SEQ ID NOs 87及 88 ；SEQ ID NOs 89 及 90、SEQ ID NOs 91及 92、SEQ ID NOs 93 及 94、或 SEQ ID NOs 95 及 96 ；(viii)EXT2(SEQ ID NO 2)专一性引物对8 :SEQ ID NOs :33及34、SEQ ID NOs :35 及 36、SEQ ID NOs 37 及 38、SEQ ID NOs 39 及 40、SEQ ID NOs 41 及 42、SEQ ID NOs 43 及 44、SEQ ID NOs 45 及 46、SEQ ID NOs 47 及 48、SEQ ID NOs 49 及 50、或 SEQ ID NOs 51 及 52 ；(ix)MCM4(SEQ ID NO 3)专一性引物对 9 :SEQ ID NOs :53 及 54、SEQ ID NOs 55 及 56、SEQ ID NOs 57 及 58、SEQ ID NOs 59 及 60、SEQ ID NOs 61 及 62、SEQ ID NOs 63 及 64、SEQ ID NOs 65 及 66、SEQ ID NOs 67 及 68、SEQ ID NOs 69 及 70、SEQ ID NOs 71 及 72、或 SEQ ID NOs 73 及 74。该试剂盒更包括专一于持家基因的引物对10。在本发明的一实施例中，该试剂盒更包括HPRTl专一性引物对10 :SEQ ID NOs 153 及 154。上述的构想将通过下列较佳实施例的说明及相关附图更为清楚，其中的变化及修改并未超出本案所揭露内容、精神及专利范围。表现本发明的一或多个实施例的图式及其文字说明，可用于解释本发明所请内容。在有可能的情形下，相同的图号标示用于参照实施例中相同或相似的组成组件。本发明所采用的具体实施例，将通过以下的实施例及附图作进一步的说明。
图1为用于预测模型PM-7(N = 300)的接收者操作特性曲线(ROC)图，ROC曲线下面积(AUC)是为0. 93136 ；图2为用于预测模型PM_14(N = 272)的接收者操作特性曲线(ROC)图，ROC曲线下面积(AUC)是为0. 93448 ；图3为用于预测模型的接收者操作特性曲线(ROC)图，这些预测模型是使用不同分子标记或表15所列的不同标记的组合。
具体实施例方式本说明书中所使用的用语是在该领域中具有其一般定义，包括在本发明的说明内容，以及特定文字内容部分所使用的用语。以下将讨论本发明所使用的特定用语，亦或说明书的其它部分，以作为实施者在实施本发明的导引。为了便利起见，某些词汇将特别标记， 例如使用斜体和/或引号标示。这些标示的使用，将不影响该用语的范围或定义；该用语的范围或定义在文中仍然是相同的，无论其是否有标记。相同的事物可用一种以上的方式描述。因此，在此将使用超过一种的其它用语及同义字，这些用语并无其它特殊含义，无论这些用语是否有特别解释或阐述。在本文中使用了一些同义字，列举一或多种同义字并不代表排除了其它未提及或列举的同义字。在实施例或说明书中所使用的用语仅为用以说明，并非限定其本发明或实施例的范围或定义。同样地，本发明并非受限于说明书中的实施例。除非另外定义，本文中所使用的技术上或科学上的用语，皆为该领域具有通常知识者所理解在本发明所涉及的一般定义。本文中所述的“大约”、“约略”或“近似地”一般是指20%的范围内，较佳为10%的范围内，最佳为5%的范围内。本文中的数值为近似值，在未明确定义的情况下可隐含“大约”、“约略”或“近似地”的含义。本文使用的用语“基因(gene)”，是指一基因体序列的可定位区域。在细胞中，基因是DNA的部分片段，同时包含决定该基因作用的编码(coding)序列，以及决定基因活化 (表达)的非编码(non-coding)序列。基因是一种基因体序列的组合，编码一可重迭功能产物的连续组合。由基因表达产生的分子，无论是RNA或是蛋白质，都是已知为基因产物。本文使用的用语“基因标记(genetic marker) ”，是指一种在DNA发生改变，而可指引出特定疾病或异常的风险的增加。本文使用的用语“基因表达(gene expression) ”，是指由基因所生成的蛋白质或功能性RNA产物。本文使用的用语“基因标签(gene signature/genetic signatures) ”，是指细胞中基因活性的特征模式。本文使用的用语“持家基因(houseke印ing gene) ”是指一种已知在许多情况下， 可维持相对性恒定表达量的基因。持家基因的产物通常是维持细胞所必需的。一般情况下，都是假定其表达量不受实验条件影响。本发明所检测的持家基因是利用临床肿瘤/正常组织，在正常人血液中加入(spike-in)培养的癌细胞，或临床血液样本(肺癌及对照组)是为 GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)； NM_002046 ； SEQ ID NO :155)，YWHAH (酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，η 多月太(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, eta polypeptide) ；NM_003405 ；SEQ ID NO :156), SFRS8(智人剪接因子(Homo sapiens splicing factor)，富含精氨酸、丝氨酸8 (arginine/serine-rich 8)(抑制因子-白杏-同源(suppressor-of-white-apricot homolog)，果也填属(Drosophila) ；NM_004592 ；SEQ ID NO :157)，UBA3(泛素激活酶 3(Ubiquitin-activating enzyme 3) ；NM_003968 ； SEQ ID NO: 158)，RPS24(核糖体蛋白质 S24(ribosomal protein S24) ；NM_033022 ；SEQ ID NO :159)， RPL13(核糖体蛋白质L13(ribosomal protein L13) ；NM_000977 ；SEQ ID NO : 160)PGKl (磷酸甘油酸激酶 l(phosphoglycerate kinase 1) ；NM_000291 ； SEQ ID N0:161)(还参见 Dheda 等人(2004)生物技术(Biotechniques) 37 (1) :112_4，116，118-9 ；人参照基因小组 (罗氏)(Human Reference Gene Panel(Roche)) ；Vandesompele 等人 ^00 基因组生物学(Genome Biology)3(7) :research0034. 1-0034. 11)。本文使用的用语“预后(prognosis) ”，是指一种预测疾病的可能发展及结果，特别是复原的可能性。本文使用的用语“引物(primer) ”，是指用于作为DNA复制起始点的DNA的一股。本文使用的用语“过度表达(overexpressed)”，是指相对于正常或基础表达量而言，具有一种可量测增加的状态。举例而言，一种在疾病中过度表达的分子，与未罹患疾病相比之下，维持其高表达量。
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本文使用的用语“过低表达(underexpressed) ”，是指相对于正常或基础表达量而言，具有一种可量测减少的状态。举例而言，一种在疾病中过低表达的分子，与未罹患疾病相比之下，维持其低表达量。在本文中“检测”或“诊断”等用语是可交替地使用。本文使用的用语“正常组织样本”或“对照组”，是指肺癌或结肠直肠癌组织和/或取自个体的体液，且该个体确认为未有肺癌或结肠直肠癌。在本文中，“个体(individual)、宿主、患者及个体(subject) ”等用语是可交替地使用，是指哺乳类，包括但不限于诸如鼠类、灵长类、人类、非人类的灵长类动物、猫类、狗类、马类、牛类、猪类及羊类。在组织与血液样本中癌症基因标记的检测本发明是关于在血液样本中利用实时性PCR(real time-PCR assays)检测癌症相关核酸。在血液样本中量测到的一组基因标记，可用以检测肺癌和/或结肠直肠癌罹患风险是种无法预期的发现。该领域者已知的是在癌症组织中特定的癌症基因标记，可用于预测患者的罹癌风险。然而，不能预测，也无法预测的是，相同的基因标记同样地可在血液样本中被检测到(参U. S. Application NO. 11/437，607案，将其全部内容纳入参考)，在此揭露了一组共12个基因(危险度(Hazard Ratio)大于1)，由于被认为是风险因子，因此在血液样本中进行检测。其中4个对于肺癌预后具有风险的基因，HGF、HMMR、ErbB3及 DLG2，系因mRNA表达量相当低(其Ct值大于30)。另外，此四个基因有时在血液中无法量测。更进一步，无法预期的是，在实验结果中显示出2个基因MMD及RNF4，在本发明的逻辑回归模型(logistic regression model)中似乎扮演了保护的角色(参阅美国专利申请 (U. S. Application)NO. 11/437，607)。经过进一步证实，在组织样本中的癌症标记，在血液样本中不能预测也无法预测， 包括如下EIF2S3在血液检测的预测模型中被认为是保护基因，然而在组织样本检测中， 却是肺癌转移的风险基因；MCM4经证实在肺癌组织中为一种癌症相关标记。在血液样本中似乎是肺癌的风险因子，但在结肠直肠癌的整体模型(full model)中似乎扮演保护的角色 (表14)。GRB2的表达量与肺癌转移为正相关。由表4及表9的胜算比(odds ration, OR) 可知，GRB2基因的转录产物表达量，对肺癌及结肠直肠癌而言为风险因子，但在结肠直肠癌的整体模型(full model)中似乎也是扮演保护的角色(表14)。CPEB4在组织样本研究中为风险因子，但在血液样本检测中为保护因子(表14)。在组织样本研究中，P0LDIP2在组织样本检测中为一种保护基因，但在血液样本检测中为风险因子(表14)因此，在此所揭露用在血液样本的癌症风险诊断及预测癌症标记，并非一种可预期的结果。肺癌及结肠直肠癌相关基因标记本发明关于基因标签的确认及应用于检测、诊断肺癌和/或结肠直肠癌，监测治疗结果，及预后的预测，例如复发率。由患者及对照组的血液样本中检测及测量肺癌及结肠直肠癌基因标记的表达量。在一实施例中，利用实时PCR检测血液中8个基因标记的表达量。由肺癌和/或结肠直肠癌患者的血液样本中显示出其中3个基因DUSP6、MCM4及NFl具有较高表达量，显示出此3个基因与肺癌和/或结肠直肠癌具有关联性。因此，可做为检测肺癌和/或结肠直肠癌风险的基因标记。针对此8个基因的mRNA表达量，利用统计学方法建立数个预测模型，用以预测一个体罹患肺癌和/或结肠直肠癌的风险。表1列示了肺癌及结肠直肠癌基因标记。表权利要求
1.一种检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性的方法，其步骤包括(a)从个体取得包含核酸的体液的检测样本；(b)量测至少一个癌症基因标记表达量，该癌症基因标记选自(i)由DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD, MCM4、NFl 及 MDM2 所组成的群组；或(ii)由DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2&EXT2 所组成的群组；(c)以持家基因对该至少一个癌症基因标记表达量进行标准化；(d)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型，计算出癌症和/或癌症复发风险的机率；以及(e)基于该计算后的机率决定肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该检测样本为血液样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)经由实时聚合酶链式反应量测。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)通过该检测样本的循环数目定量mRNA表达量[Ct (test)]，且其中步骤(c)的标准化是通过将持家基因的mRNA表达量[Ct(HK)]减去Ct (test)，以得到该检测样本的标准化mRNA表达量["Ct (test)]。
5.根据权利要求1所述的方法，其中持家基因选自由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 (HPRTl)及甘油醛3-磷酸去氢酶(GAPDH)所组成的群组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)是量测DUSP6基因的表达量。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)是量测以下六个癌症基因标记的表达量 DUSP6、MDM2、NF1、EIF2S3、MMD 及 RNF4。
8.根据权利要求1所述的方法，其中该至少一个癌症基因标记选自由DUSP6、EIF2S3、 MDM2、NFU MMD, RNF4、GRB2及EXT2所组成的群组，且其中步骤(e)决定结肠直肠癌的存在和/或严重性。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)量测下列的表达量，至少(i)八个癌症基因标记；(ii)七个癌症基因标记；(iii)六个癌症基因标记；(iv)五个癌症基因标记； (ν)四个癌症基因标记；(vi)三个癌症基因标记；或(vii)二个癌症基因标记。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)量测下列的表达量(i)该一个癌症基因标记DUSP6；(ii)该二个癌症基因标记DUSP6及EIF2S3；(iii)该三个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3及GRB2；(iv)该四个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、GRB2及RNF4；(ν)该五个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4及MMD ；(vi)该六个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD及 MCM4 或 NFl ；(vii)该七个癌症基因标记0旧 63正253、61 2、8顺4、匪0、]\014、及^^2或咿1；(viii)该三个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3及MDM2；(ix)该四个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2及NFl ；(χ)该五个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1及MMD ；(xi)该六个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD及 RNF4 ；(xii)该七个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、&GRB2；或(xiii)该八个癌症基因标记DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2、&EXT2。
11.根据权利要求10所述的方法，其中各该癌症基因标记的表达量经由实时聚合酶链式反应量测，且利用选自由下列癌症基因标记专一性引物对1至9所组成的群组中至少一个引物对(i)DUSP6(SEQID NO :9)-专一性引物对 1 :SEQ ID NOs :137 及 138、SEQ ID NOs. 139 及 140 ；(ii)EIF2S3(SEQID NO 1)-专一性引物对 2 :SEQ ID NOs. 17 及 18、SEQ ID NOs. 19 及 20、SEQ ID NOs. 21 及 22、SEQ ID NOs. 23 及 24、SEQ ID NOs. 25 及 26、SEQ ID NOs. 27 及 28、SEQ ID NOs. 29 及 30、或 SEQ ID NOs 31 及 32 ；(iii)MDM2(SEQID NO :4)-专一性引物对 3 :SEQ ID NOs :75 及 76、SEQ ID NOs :77 及 78、SEQ ID NOs 79 及 80、或 SEQ ID NOs 81 及 82 ；(iv)NFl(SEQ ID NO :6)-专一性引物对4 :SEQ ID NOs :97及98、SEQ ID N0s:99及 100、 SEQ ID NOs :101及102、SEQ ID NOs 103及104、SEQ ID NOs 105及 106、SEQ ID NOs :107 及 108、SEQ ID NOs :109 及 110、SEQ ID NOs :111 及 112、或 SEQ ID NOs :113 及 114 ；(v)MMD(SEQ ID NO :7)-专一性引物对 5 :SEQ ID NOs :115 及 116、SEQ ID NOs :117 及 118、或 SEQ ID NOs :119 及 120 ；(vi)RNF4 (SEQ ID NO :8)-专一性引物对 6 :SEQ ID NOs :121 及 122、SEQ ID NOs :123 及 124、SEQ ID NOs :125 及 126、SEQ ID NOs :127 及 128、SEQ ID NOs :129 及 130、SEQ ID NOs 131 及 132、SEQ ID NOs :133 及 134、或 SEQ ID NOs :135 及 136 ；(vii)GRB2(SEQID NO :5)-专一性引物对 7 :SEQ ID NOs :83 及 84、SEQ ID NOs :85 及 86、SEQ ID NOs 87 及 88 ；SEQ ID NOs 89 及 90、SEQ ID NOs 91 及 92、SEQ ID NOs 93 及 94、或 SEQ ID NOs 95 及 96 ；(viii)EXT2(SEQID NO :2)-专一性引物对8 :SEQ ID NOs :33 及 34、SEQ ID NOs :35 及 36、SEQ ID NOs 37 及 38、SEQ ID NOs 39 及 40、SEQ ID NOs 41 及 42、SEQ ID NOs 43 及 44、SEQ ID NOs 45 及 46、SEQ ID NOs 47 及 48、SEQ ID NOs 49 及 50、或 SEQ ID NOs 51 及52 ’及(ix)MCM4(SEQID NO 3)专一性引物对9 :SEQ ID NOs :53及54、SEQ ID NOs :55及56、 SEQ ID NOs :57 及 58、SEQ ID NOs 59 及 60、SEQ ID NOs :61 及 62、SEQ ID NOs 63 及 64、 SEQ ID NOs 65 及 66、SEQ ID NOs 67 及 68、SEQ ID NOs 69 及 70、SEQ ID NOs :71 及 72、 或 SEQ ID NOs 73 及 74。
12.根据权利要求11所述的方法，其中若步骤(e)决定肺癌的存在和/或严重性，则选择该 EIF2S3(SEQ ID NO 1)-专一性引物对 2 :SEQ ID NOs. 27 及 28、及 SEQ ID NOs 31 及 32、该 NFl (SEQ ID NO :6)-专一性引物对 4 :SEQ ID NOs :103 及 104、和 / 或该 GRB2 (SEQ ID NO :5)-专一性引物对7 :SEQ ID NOs :91及92，而若步骤(e)决定结肠直肠癌的存在和 /或严重性，则不选择这些引物对。
13.根据权利要求11所述的方法，其中若步骤(e)决定结肠直肠癌的存在和/或严重性，则选择该 EIF2S3(SEQ ID NO :1)-专一性引物对 2 :SEQ ID NOs. 19 及 20，该 NFl (SEQ ID NO :6)_ 专一性引物对 4 :SEQ ID NOs 113 及 114，该 EXT2 (SEQ ID NO :2)-专一性引物对 8 SEQ ID NOs :47 及 48，和 / 或该 MCM4(SEQ ID NO 3)-专一性引物对 9 SEQ ID NOs 67 及 68，而若步骤(e)决定肺癌的存在和/或严重性，则不选择这些引物对。
14.一种监测和/或评估患者对癌症治疗的预后反应的方法，其步骤包括(a)在接受结肠直肠癌和/或肺癌的癌症治疗之前及之后，由该患者取得包括有核酸的体液样本群；(b)量测至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由DUSP6、EIF2S3、 GRB2、RNF4、MMD, MCM4、NFl 及 MDM2 所组成的群组；(c)以持家基因对该至少一个癌症基因标记的表达量进行标准化；(d)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型计算出癌症和 /或癌症复发风险的机率；以及(e)比较该样本群的计算后机率以评估该反应，而借此监测和/或评估该患者对该癌症治疗的预后反应；其中在接受癌症治疗后该机率的降低是该癌症治疗为正反应的表征。
15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)量测下列的表达量，至少(i)八个癌症基因标记；( )七个癌症基因标记；(iii)六个癌症基因标记；(iv)五个癌症基因标记；(ν)四个癌症基因标记；(vi)三个癌症基因标记；或(vii)二个癌症基因标记。
16.根据权利要求14所述的方法，其中该检测样本为血液样本。
17.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)经由实时聚合酶链式反应量测。
18.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)通过该检测样本的循环数目定量mRNA 表达量[Ct (test)]，且其中步骤(c)的标准化是通过将持家基因的mRNA表达量[Ct(HK)] 减去Ct (test)，以得到该检测样本的标准化mRNA表达量["Ct (test)]。
19.一种监测和/或评估患者对癌症治疗的预后反应的方法，其步骤包括(a)在接受结肠直肠癌和/或肺癌的癌症治疗之前，由该患者取得包括有核酸的体液的第一样本；(b)在接受该治疗之后，由该患者取得包括有核酸的体液的第二样本；(c)量测该第一样本及第二样本中至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由第一样本及第二样本的DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4、NF1及MDM2所组成的群组；以及(d)比较在该第一样本及第二样本中所量测出的表达量，并借此监测和/或评估该患者对于该癌症治疗的预后反应；其中(i)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中DUSP6、GRB2、MCM4和/或NFl 表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌和/或肺癌复发的风险；(ii)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；以及(iii)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中EIF2S3、MMD和/或RNF4表达量的增加，代表该个体并未有形成肺癌的风险。
20.一种检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性的方法，包括下列步骤(a)由一个体取得包括有核酸的体液的检测样本；(b)量测至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自(i)由DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD, MCM4、NFl 及 MDM2 所组成的群组；或(ii)由DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2&EXT2 所组成的群组；以及(c)将该至少一个癌症基因标记的表达量与相对应癌症基因标记的表达量作比较，该相对应癌症基因标记取自非癌症对照组的体液检测样本，并借此检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性；其中(i)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、GRB2、MCM4和/ 或NFl表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌的风险；(ii)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；(iii)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD和/或 RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成肺癌的风险；(iv)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、GRB2、MDM2和/ 或NFl表达量的增加，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险；以及(ν)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD, EXT2和/ 或RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险。
21.根据权利要求20所述的方法，其步骤更包括(a)以一持家基因对该至少一个癌症基因标记的表达量进行标准化；(b)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型，回归计算出癌症和/或癌症复发的机率；以及(c)基于该计算出的机率以决定肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。
22.根据权利要求20所述的方法，其中该检测样本为血液样本。
23.一种使用根据权利要求1所述方法的试剂盒，以检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性，该试剂盒包括一个或多个引物对，选自由下列癌症基因标记专一性引物对1-9所组成的群组(i)DUSP6(SEQID NO 9)专一性引物对 1 :SEQ ID NOs 137 及 138、或 SEQ ID NOs. 139 及 140 ；(ii)EIF2S3(SEQID NO 1)专一性引物对 2 :SEQ ID NOs. 17 及 18、SEQ ID NOs. 19 及 20、SEQ ID NOs. 21 及 22、SEQ ID NOs. 23 及 24、SEQ ID NOs. 25 及 26、SEQ ID NOs. 27 及 28、SEQ ID NOs. 29 及 30、或 SEQ ID NOs 31 及 32 ；(iii)MDM2(SEQID NO 4)专一性引物对 3 :SEQ ID NOs 75 及 76、SEQ ID NOs 77 及/78、SEQ ID NOs 79 及 80、或 SEQ ID NOs 81 及 82 ；(iv)NFl (SEQ ID NO :6)专一性引物对4 :SEQ ID NOs :97及 98、SEQ ID NOs :99及 100、 SEQ ID NOs :101及 102、SEQ ID NOs 103及104、SEQ ID NOs 105及106、SEQ ID NOs :107 及 108、SEQ ID NOs :109 及 110、SEQ ID NOs :111 及 112、或 SEQ ID NOs :113 及 114 ；(v)MMD(SEQ ID NO 7)专一性引物对 5 :SEQ ID NOs :115 及 116、SEQ ID NOs :117 及 118、或 SEQ ID NOs :119 及 120 ；(vi)RNF4(SEQID NO 8)专一性引物对 6 :SEQ ID NOs :121 及 122、SEQ ID NOs :123 及 124、SEQ ID NOs :125 及 126、SEQ ID NO s :127 及 128、SEQ ID NOs :129 及 130、SEQ ID NOs 131 及 132、SEQ ID NOs :133 及 134、或 SEQ ID NOs :135 及 136 ；(vii)GRB2(SEQID NO 5)专一性引物对 7 :SEQ ID NOs 83 及 84、SEQ ID NOs 85 及 86、SEQ ID NOs 87 及 88 ；SEQ ID NOs 89 及 90、SEQ ID NOs 91 及 92、SEQ ID NOs 93及 94、或 SEQ ID NOs 95 及 96 ；(viii)EXT2(SEQID NO 2)专一性引物对 8:SEQ ID NOs :33 及 34、SEQ ID NOs :35 及 36、SEQ ID NOs 37 及 38、SEQ ID NOs 39 及 40、SEQ ID NOs 41 及 42、SEQ ID NOs 43 及 44、SEQ ID NOs 45 及 46、SEQ ID NOs 47 及 48、SEQ ID NOs 49 及 50、或 SEQ ID NOs 51 及52 ；以及(ix)MCM4(SEQID NO :3)专一性引物对9 :SEQ ID NOs :53及54、SEQ ID NOs :55及56、 SEQ ID NOs :57 及 58、SEQ ID NOs :59 及 60、SEQ ID NOs :61 及 62、SEQ ID NOs :63 及 64、 SEQ ID NOs 65 及 66、SEQ ID NOs 67 及 68、SEQ ID NOs 69 及 70、SEQ ID NOs :71 及 72、 或 SEQ ID NOs 73 及 74。
24.根据权利要求21所述的试剂盒，更包括专一于持家基因的引物对10。
25.根据权利要求21所述的试剂盒，更包括HPRTl-专一性引物对10:SEQ ID NOs :153 及 1540
26.一种使用根据权利要求1所述方法的试剂盒，以检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性，该试剂盒包括一个或多个引物对，选自由下列癌症基因标记专一性引物对所组成的群组(i)DUSP6(SEQID NO 9)专一性引物对；(ii)一 EIF2S3(SEQ ID NO 1)专一性引物对；(iii)MDM2(SEQID NO 4)专一性引物对；(iv)NFl (SEQ ID NO 6)专一性引物对；(v)MMD(SEQ ID NO 7)专一性引物对；(vi)RNF4(SEQID NO 8)专一性引物对；(vii)GRB2(SEQID NO 5)专一性引物对；(viii)EXT2(SEQID NO 2)专一性引物对；以及(ix)MCM4(SEQID NO 3)专一性引物对。全文摘要
本发明揭露一种使用于血液样本中检测肺癌及结肠直肠癌的分子标记及其方法。所述方法包括由个体中取得血液样本，并量测其癌症基因标记的表达量，以检测和/或评估患者在接受癌症治疗后的反应的预后情形。同时本发明亦揭露一种检测、诊断和/或监测肺癌或结肠直肠癌的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102159729SQ200980137047
公开日2011年8月17日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年9月22日
发明者李宛真, 滕涵菁, 陈瑾妤 申请人:怡发科技股份有限公司, 达生药物开发公司