野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa和其碱基序列的制作方法

专利名称：野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa和其碱基序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DREB类转录因子GsDREBa和其碱基序列。
背景技术：
低温、干旱和盐碱等逆境条件严重影响作物的产量和质量，是制约我国东北地区 乃至全国农业生产的重大问题。提高作物的耐低温、干旱和盐碱能力是农业生产的主要目 标之一。在非生物胁迫条件下，高等植物细胞会积极地调动体内的防卫系统，从感知到信号 传导，最后将信号传递到细胞核的转录因子，转录因子作用于功能基因，启动逆境应答基因 的表达，导致合成新的蛋白、代谢的转变以及抗逆渗透调节物质的积累等，最终达到提高植 物耐逆性的目的。 为提高植物对非生物胁迫抗性，人们进行了大量关于植物抗非生物胁迫基因的 研究，并开始转向与非生物胁迫密切相关的转录调控基因的研究，如蛋白激酶、转录因子 等。这些蛋白因子都属于非生物胁迫信号传导途径中较早期的蛋白，在信号传导途径中起 到重要的调控作用，并且能够调节一系列非生物胁迫相关基因的表达，并不单单是一个基 因在起作用，而是启动信号传导中某个途径中多个基因协同应答非生物胁迫。因此，转录 因子在提高植物抗逆能力方面起到重要的作用，并逐渐成为研究热点。DREB (Dehydration ResponsiveElement Binding protein)转录因子是目前非胁迫分子生物学研究较为热点 的蛋白因子，但是目前可实际供使用的DREB转录因子却比较少，限制了非生物胁迫基因工 程的推广和使用。

发明内容
本发明的目的是为了解决目前可实际供使用的DREB转录因子比较少的问题，而 提供一种野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa和其碱基序列。 本发明野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa具有非生物胁迫抗性，并具有下列氨 基酸序列之一 ①SEQ ID NO : 1所示； ②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加 一个或几个氨基酸。 本发明上述野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa的碱基序列所编码的野生大豆
的DREB类转录因子GsDREBa具有非生物胁迫抗性。 本发明野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa适用于单、双子叶植物，并可使用组
成型启动子和诱导型启动子调控的植物表达载体，转化模式植物烟草和拟南芥；所转基因
植株具明显的耐逆性，为非生物胁迫基因工程的广泛推广奠定了物质基础。本发明野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa能够与DRE元件核心序列(CCGAC)
特异性结合，并且具有激活活性，能够激活报告基因的表达，并且定位在细胞核中。实验证
明该转录因子受多种非生物胁迫诱导。野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa基因超表
达的烟草幼苗较野生型植株表现出盐、渗透胁迫耐受性，说明野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa参与植物对干旱、低温、盐渍等非生物胁迫信号传导途径。


图1是具体实施方式
四中GsDREBa转录因子在酵母细胞内与DRE元件结合特性分 析结果图，图2是具体实施方式
四中GsDREBa转录因子在体外与DRE元件结合功能分析结 果图，图3是具体实施方式
五中GsDREBa转录因子在酵母体内的转录激活实验结果图，图4 是具体实施方式
六中亚细胞定位载体pCEG的载体图谱，图5是具体实施方式
六中野生大豆 的DREB类转录因子GsDREBa在植物细胞内的亚细胞定位分析的激光共聚焦显微镜观察图， 图6是具体实施方式
七中转化烟草的植物表达载体命名为pBI121-GsDREBa的载体图谱，图 7是具体实施方式
八中转GsDREBa基因烟草对高盐、渗透胁迫的耐逆性生长实验结果图，图 8是具体实施方式
九中野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa转基因植株在不同胁迫条件下 RT-PCR检测的GsDREBa基因的表达结果图。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一 本实施方式野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa具有非生物胁 迫抗性，并具有下列氨基酸序列之一
①SEQ ID NO :1所示； ②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸。 本实施方式②包括与SEQ ID NO :1氨基酸序列具有至少80%同源性，特别是具有
至少95%的同源性的氨基酸序列。 本实施方式野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa都含有保守的AP2/EREBP结构 域序歹ll (ThrGlnAsnSerGlnCysAsnTyrArgGlyValArgGlnArgThrArgGlyLysTrpValGlyGluIleA
AlaAlaArgAlaMetTyrGlyProCysAlalleLeuAsnPhe)。
具体实施方式
二 本实施方式野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa的碱基序列所 编码的野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa(如SEQ ID NO : 1所示)具有非生物胁迫抗 性。 本实施方式碱基序列可用于构建的GsDREBa基因的表达载体，使用GsDREBa构建 植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。 为了便于对转基因细胞或植株进行鉴定和筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植 物筛选标记基因及报告基因。可使用的选择标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大 霉素、卡那霉素、潮霉素等。可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如GFP)来识 别的化合物的酶，或抗化学试剂(例如除草剂)。另外，从转基因植物的安全性考虑，可不加 任何选择标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 本实施方式的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规方法导入植物细胞，并将转化的植物组织培育成植 株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦、草坪草等单子叶植物，也可以是大豆、油
4菜、苜蓿、黄瓜、番茄、杨树等双子叶植物。
具体实施方式
三本实施方式按以下步骤获得野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa : 1、 DREBP/AP2保守区的克隆及分析 野生大豆幼苗在O. 2mol/L NaCl中处理lh，取其叶片在液氮中速冻，用于RNA的提取；使用Trizol Reagent提取叶片总RNA，操作参照Invitrogen公司Trizol试剂的使用说明；多序列比对拟南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2 (AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的氨基酸序列，在相对保守的DREBP/AP2结构域的P-折叠区和a-螺旋区设计一套简并引物，简并引物序列如下GsAP2(+) :5' -GGH(A/T/C)AAATGGGTD(T/A/G)K(G/T)S(C/G)H(A/T/C)GA-3 '禾口 GsAP2 (_) :5' _GGR(G/A)AAR(G/A)TTR(G/A)AGD(A/T/G)M(A/C)K(G/T)AGC-3'。提取的野生大豆叶片RNA利用Invitrogen公司的反转录酶SuperScript II进行反转录。在5(TC下反转录延伸，利用上述简并引物采用降落PCR扩增。再以第一轮PCR扩增的结果为模板进行第二轮常规PCR，以增加PCR反应的效率及特异性。降落PCR反应程序为94。C预变性7min ;94。C变性30s、56. 6。C退火40s、72。C延伸0. 5min，30个循环，每次循环降落0.25t:，72t:终延伸10min。第二轮PCR的退火温度为44°C ，获得到189bp的片段，将扩增的片段克隆到pGEM-T vector上进行测序。对此片段的氨基酸序列进行Blastp同源性分析，在GenBank中有71条与该片段同源的序列，相似性为70% 80%，这些序列都含有AP2结构域。克隆的片段具有AP2保守的氨基酸序列，其保守的氨基酸残基为RgxRxRxWxKxxxExRx. . . xWxxT，是由3个平行的P _折叠和1个a -螺旋构成的蛋白结构域，预测可以与DNA结合。
2、 GsDREBa全长基因的克隆及分析 根据已获得的野生大豆DREBP/AP2功能域设计引物，用RACE的技术分别扩增保守区片段的3'末端和5'末端。为了提高反应的特异性，共进行了 3轮巢式PCR。RACE的引物序列如下3 'RACEl(+) :5， -GAGGAGTTAGGCAGAGGACACG-3，，3 'RACEl(-):5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'，3 'RACE2(+) :5'-GCAGGCTTTGGTTGGGTAC-3'，3 'RACE3(+):5' -GCTGCTCTTGCCTATGATGAAG-3'， 5 'RACElW :5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGDDGGGDDGGGDDG-3'，5 'RACE 1 (_) :5' -AAGGATAGCACAAGGACCATAC-3'，5 'RACE2(+):5' -GAGGAGTTAGGCAGAGGACACG-3'，5 'RACE2(-) 5' -TGCTTCCTCTATTGGGCTCC-3'，5 'RACE3(-) :5，-CGTGTCCTCTGCCTAACTCCTC-3，，获得1162bp的3'端序列禾口 482bp的5，端序列。将获得的3'末端、5'末端及DREBP/AP2结构域DNA序列进行序列拼接，经分析拼接的序列为1622bp，具有完整的开放读码框。根据拼接的序列设计扩增全长引物，引物序列如下GsDREBa all(+) :5，-CACGGATCCAGTTTGATTGAGTACTGTGTG_3，和GsDREBa all(-) :5，-GGCGAGCTCCTTGTATTAGTTGTATAGGGG-3'。以基因组DNA和cDNA为模板，在退火温度为55。C下进行PCR扩增。结果表明，以基因组DNA和cDNA为模板均获得1360bp的片段，初步分析该基因没有内含子。对扩增的全长片段进行序列分析，该片段包括1179bp的开放读码框，编码392个氨基酸。拼接的两端序列设计引物，采用RT-PCR方法进行全长基因扩增，结果获得了1360bp全长cDNA序列如SEQ ID NO :2所示(起始密码子位于第48 50bp)，该基因被命名为GsDREBa。通过NCBI的Protein Conserve Domain程序分析，在GsDREBa氨基酸序列内部具有转录因子特有的与DNA结合的结构域DREBP/AP2。 N端具有6个氨基酸(SRKRKS)的核定位序列(皿clearlocalization signal，NLS)。以上都是典型的DREB转录因子的结构特点。
具体实施方式
四本实施方式按以下步骤进行野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa与DRE的结合特性分析 1、 GsDREBa转录因子在酵母细胞内与DRE元件结合特性分析
(l)4mer DRE及4mer mutant DRE(mDRE)矛艮告载体的构建 以CCGAC为核心序列，进行4次重复，核心元件之间以ATGAGTATACTA间隔，合成4mer DRE元件序列，并且为了便于连接到pHIS2报告载体上，在上下游分别加Eco R I和Sac I限制性酶切识别序列，分别是GAATTC和GAGCTC。合成的序列为
DRE(+):
CATGAGTGAGCT-3'
DRE(-):
TCA￡_3， 各取20 ii 1浓度为1 y g/ y L的DRE (+)和DRE (-)，混匀，在70。C下退火，得到80bp的片段，上下游分别是Eco R I和Sac I的粘性末端。将此混合物与经过Eco R I和SacI酶切过的pHIS2报告载体连接。转化大肠杆菌，提取阳性克隆质粒DNA，进行酶切鉴定，并对插入片段的阳性克隆进行测序。经测序得到含转录因子DREB与DRE顺式作用元件结合的DNA核心元件序列的双链DNA片段的重组报告载体，命名为pHIS2-DRE。
4mer mutant DRE (mDRE)挽救载体的构建与pHIS2_DRE的构建相同，不同之处是将核心序列CCGAC突变为TTTTT，将构建的突变DRE报告载体命名为pHIS2-mDRE。
(2)融合有AD激活结构域的GsDREBa诱佴载体的构建 根据诱饵载体pGADT7-Rec2酶切图谱，在GsDREBa基因CDS区上下游分别通过PCR引入Sac I和EcoRV(平末端)酶切识别序列，将pGADT7-Rec2利用Sac I和Sma I (平末端)进行酶切，将两者进行连接，转化大肠杆菌，并进行酶切鉴定，获得融合有AD激活结构域的GsDREBa诱佴载体，命名为pGADT7-GsDREBa。在后续的酵母体内结合活性验证试验中，使用已知结合功能的拟南芥DREB1A作为阳性对照，因此也需要构建融合有AD激活结构域的AtDREBIA诱饵载体。用同样的方法进行构建，命名为pGADT7-AtDREBlA。
将重组的报告载体pHIS2-DRE禾P pHIS2-mDRE转化酵母Y187(MATa，腦3_52， his3_200， ade2_101， trp 1_901， leu2_3，112， gal4A， gal80 △ ， met_，MRA3: :GALlMAS-GallTATA-LacZ MEL1)，得到整合有pHIS2-DRE的酵母菌株Y187/pHIS2-DRE和整合有pHIS2-mDRE的酵母菌株Y187/pHIS2_mDRE，再把pGADT7-GsDREBa转化重组酵母Y187/pHIS2-DRE和Y187/pHIS2-mDRE，在28。C下，在20mmol/L 3-AT和HIS—/Leu7Trp—3缺的培养基上培养3 5天。重组酵母Y187/pHIS2-DRE能够生长，并且菌落直径大于2mm，而重组酵母Y187/pHIS2-mDRE生长受到抑制，菌落直径都小于lmm。对重组酵母Y187/pHIS2-DRE和Y187/pHIS2-mDRE单菌落进行PCR鉴定，确定pGADT7-GsDREBa已转化进入重组酵母菌中。挑取PCR阳性克隆在30mmol/L 3-AT和HIS—/Leu—/Trp—3缺的培养基上划线，培养3 5天。阳性对照AtDREBIA采用同样的方法同时进行。重组酵母Y187/pHIS2-DRE/pGADT7-GsDREBa能够正常生长，含有较浓的菌线，而重组酵母Y187/pHIS2-mDRE/pGADT7-GsDREBa在高浓度的3-AT培养基中生长完全抑制，GsDREBa转录因子与拟南芥DREB1A —样，在酵母体内能够特异结合DRE元件，从而激活报告基因HIS基因的表达，故能在HIS-选择培养基上生长，相反由于不能与突变的mDRE结合，不能激活报告基因HIS基因的表达，因而在HIS-选择培养基上生长受到抑制，证明GsDREBa在酵母体内具有与DRE元件核心序列(CCGAC)的结合特性。GsDREBa转录因子在酵母细胞内与DRE元件结合特性分析结果如图l所示。 2、 GsDREBa转录因子在体外与DRE元件结合功能分析(EMSA实验)
利用Roche公司的DIG标记和检测试剂盒进行GsDREBa转录因子在体外与DRE元件结合功能分析实验。利用LiAC-PEG方法将质粒pGADT7-GsDREBa转入酵母菌Y187，获得阳性酵母重组菌Y187/pGADT7-GsDREBa，采用玻璃珠破碎法提取重组酵母。由于GsDREBa完整CDS序列N端含有HIS标签序列，按照Invitrogen公司的ProBondTMPurificationSystem(lot : 1288003)protocol对表达蛋白进行纯化，用于EMSA实验。利用DIG标记人工合成的DRE和mDRE元件序列。将纯化的GsDREBa蛋白和标记的元件序列在结合缓冲液中进行结合反应，DNA与蛋白复合物在质量浓度为5%聚丙烯酰胺中进行电泳，之后通过电转将复合物转移到尼龙膜上。参照DIG检测试剂盒说明进行信号检测。GsDREBa转录因子在体外与DRE元件结合功能分析结果如图2所示。由于GsDREBa蛋白与DRE元件的结合，导致标记的DRE序列电泳带滞后(3泳道)；而GsDREBa蛋白与突变的DRE (mDRE)元件不能结合，因此没有滞后的条带(4泳道)；对照只含有标记的DRE和mDRE元件的泳道均没有滞后条带(1，2泳道)。此结果证明在体外GsDREBa蛋白能够与DRE元件结合。
具体实施方式
五本实施方式按以下步骤进行野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa在酵母体内的转录激活实验 将GsDREBa全长CDS区克隆到酵母表达载体pGBKT7 (Trp+)中，得到重组酵母表达载体命名为pGBKT7-GsDREBa，然后采用小量LiAc/PEG法将pGBKT7-GsDREBa， pGBKT7 (阴性对照)，pGBKT7-AtDREBlA和pGBKT7-GmDREBl (阳性对照)分别转化酵母菌株Y189，经PCR鉴定得到阳性转化子。将各阳性转化子在30/-111)培养基上划线。培养出菌落后，将重组酵母细胞采用滤纸影印法影印到Whatman滤纸上，将滤纸放入液氮中15s，然后恢复到室温使细胞裂解，然后将滤纸浸润在2. 5mL Z-buffer/X-GAL溶液中，3(TC培养观察蓝白斑。其中，Z-buffer (pH7. 0)主要成分为Na2HP04 *7H2016. lg/L，NaH2P04 *H20 5. 50g/L，KCl 0. 75g/L， MgS04 7H20 0. 246g/L。 Z-buffer/X-GAL溶液的主要成分为20mL Z-buffer，O. 054mLP-巯基乙醇，67iiL20mg/mL X-GAL stock solution。 GsDREBa转录因子在酵母体内的转录激活实验结果如图3所示，所有酵母细胞都能够在SD/-Trp培养基上正常生长，含有pGBKT7-GsDREBa的酵母细胞和阳性对照pGBKT7-AtDREBlA、 pGBKT7-GmDREBl —样，能够产生蓝斑，而阴性对照则不能产生蓝斑，说明GsDREBa在酵母体内具有转录激活特性。
具体实施方式
六本实施方式按以下步骤进行野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa在植物细胞内的亚细胞定位分析 将GsDREBa全长CDS区克隆到亚细胞定位载体pCEG (载体图谱如图4所示)，得到GsDREBa亚细胞定位载体pCEG-GsDREBa。采用冻融法将pCEG-GsDREBa， pCEG(阴性对照)和pCEG-AtDREBlA(阳性对照)分别转化农杆菌EHA105，PCR鉴定得到阳性转化子。用重组农杆菌浸润烟草叶片，过渡培养3天后，用激光共聚焦显微镜(SP5 ;Leica， Germany)观察488nm下荧光信号(GFP为绿色荧光蛋白)，结果如图5所示，说明GsDREBa蛋白定位于细胞核，与阳性对照AtDREBlA定位相同，而阴性对照pCEG则无定位倾向。
具体实施方式
七本实施方式按以下步骤进行野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa cDNA植物表达载体的构建和农杆菌介导转化烟草 GsDREBa cDNA植物表达载体的构建按常规方法进行，双元表达载体pBI121
含35S启动子和翻译增强子TMV的片段。将用于转化烟草的植物表达载体命名为
pBI121-GsDREBa(载体图谱如图6所示)。将pBI121-GsDREBa植物表达载体直接转化农杆
菌，农杆菌菌株为LBA4404，农杆菌转化的植物受体为龙江911烟草。 1、遗传转化烟草 遗传转化用到的培养基为 MO :发芽培养基，1/8MS， pH5. 8，0. 8%琼脂。 Ml :分化培养基(用于预培养和共培养)，MS+1. Omg/L 6-BA+0. lmg/LNAA， pH5. 8，0. 75%琼脂。 M2 :筛选培养基，Ml+Km+除菌剂。 M3 :生根培养基，1/2MS， pH5. 8，0. 7%琼脂。 (1)受体材料的准备 将烟草种子浸种3 5h后，用体积浓度为70%酒精表面消毒30s，0. 1%升汞消毒3min，无菌水冲洗5遍，接种于MO培养基中。待幼叶长至2 3cm时，将叶片取下用直径为7mm的打孔器制成叶盘，近轴面向下接种在Ml培养基上，预培养2 3天。叶盘切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。 (2)农杆菌介导的遗传转化程序及植株再生 1)农杆菌菌液的制备将农杆菌接种于附加KmlOOmg/L、 Sm50mg/L、 Rif50mg/L的
YEB固体培养基上，28t:暗培养，至长出单菌落。挑取单菌落，接种在5mL含相应抗生素的
YEB液体培养基中，于28°C，200r/min振荡培养。待菌液长至0D6。。 = 0. 4 0. 6时，将菌
液按l : IO的比例进行二次活化。当0De。。二0.4 0.6时，吸取菌液置于无菌离心管中，
2000r/min离心10min，弃上清，用等体积的YEB液体培养基重悬，备用。 2)侵染取预培养2 3天的外植体于无菌三角瓶内，加入适量活化好的农杆菌菌
液，侵染5min左右。 3)共培养将侵染过的外植体接种在M工培养基上，2『C暗培养共培养3 4天，以肉眼可见菌落为准。 4)除菌及筛选培养将经过共培养的外植体放入无菌三角瓶内，用无菌水冲洗3
4次，然后用附加除菌剂的液体植物培养基振荡培养30min，用无菌滤纸吸干表面水分，再
转移到附加选择压的除菌筛选培养基上，26 2『C光下培养，每10天继代一次。 5)继代筛选培养筛选培养2 3周以后，外植体的转化细胞将分化出抗性芽，将抗
性芽转入相应的筛选培养基中进行继代培养。 6)生根培养待不定芽长到3 4cm时，将其切下并插入M3培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。 7)驯化移栽待生根完全后，将小苗取出，小心洗去根部培养基，栽于土 细沙=i : 2的花盆中。 2、转基因烟草分子生物学检测及筛选
(l)PCR检测 采用CTAB常规植物DNA提取方法小量提取烟草叶片DNA，以此为模板，以基因特异 引物对抗性植株进行PCR检测，PCR反应条件如下94t:预变性5min，94t:变性40s、55。C退 火30s、72。C延伸lmin，共30个循环，72。C延伸10min， 4。C终止反应。 经检测共获得20株PCR阳性植株，收集PCR阳性植株T。代种子，用于卡那霉素进 行筛选。 (2) T。代种子Km筛选实验及1\代植株PCR检测 将PCR阳性的T。代种子和对照的种子接种到75mg/L的发芽培养基上，14天后观 察生长情况，对比PCR阳性植株和未转化植株种子在发芽阶段的差异，将经卡那霉素筛选 成活的烟草幼苗移栽到土壤中继续培养，并进行PCR检测，PCR的阳性率达到100%。说明 利用卡那霉素筛选转基因烟草后代种子的方法是比较可行的。
(3) Southern印迹杂交 采用CTAB常规植物DNA提取方法大量提取转基因烟草Tl代植株叶片总DNA，用于 做Southern杂交检测。Southern印迹杂交的方法参照《分子克隆》(第三版)。最终获得 Southern杂交阳性转基因烟草5个株系。
(4)RT-PCR 提取转基因烟草的RNA，进行DNase I处理，反转录cDNA，用PCR基因特异引物进 行RT-PCR检测。结果Southern杂交阳性转基因烟草5个株系在转录水平均有表达。
具体实施方式
八本实施方式按以下步骤进行转GsDREBa基因烟草耐逆性鉴定
收集Southern杂交阳性烟草的1\代种子，利用卡那霉素对1\代种子进行筛选，筛 选存活的幼苗和对照分别移栽到含150mM NaCl、350mM甘露醇的1/2MS培养基中进行培养。 在不同的胁迫(高盐、渗透胁迫)下，转基因植株均较对照生长良好(如图7所示)。在高 盐条件下，转基因植株的生长量较对照有明显提高；而在渗透胁迫下，转基因烟草的地上部 分生长量好于对照。以上结果表明，转GsDREBa基因烟草具有对高盐、渗透逆境条件的耐受 性。
具体实施方式
九本实施方式按以下步骤进行野生大豆的DREB类转录因子 GsDREBa在逆境中的表达特征分析
1、野生大豆幼苗的处理 将野生大豆用浓硫酸浸泡10分钟后，用清水冲洗。之后播种于蛭石草炭土 =
1 : 1的土壤中，待幼苗生长至具有2对3重复叶后，从土中取出，并尽量避免不伤及根部。
将幼苗放在1/2MS液体培养基中进行缓苗，3天后进行下述不同条件的处理 1)盐处理用200mM NaCl溶液处理幼苗，分别处理0h、0. 5h、lh、3h、6h，分别取
处理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-S(TC保存待用或者直接提取
RNA。 2)模拟干旱处理用30% (W/V)PEG6000溶液处理幼苗，分别处理0h、0. 5h、lh、 3h、6h，分别取处理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-S(TC保存待用或 者直接提取RNA。
3)低温处理将幼苗置于4t:冷藏柜中进行低温处理，分别处理0h、0. 5h、lh、3h、 6h，分别取处理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-S(TC保存待用或者 直接提取RNA。 2、野生大豆幼苗的RNA提取及基因组DNA的去除 1)取经上述不同方法处理后的野生大豆幼苗材料各约100mg，液氮研磨，用plant RNApr印Plant Kit(TIANGEN， cat no :DP402)试剂盒并参照试剂盒说明书提取RNA。
2)采用TaKaRa公司的DNase I于37。C反应20_30min，去除RNA中的基因组DNA。 反应体系如下長40iiL，10XDNase I Buffer 5iiL，DNasel 2 ii L，謹ase Inhibitor 0. 5 ii L， RNAase-free ddH20 2. 5 ii L。 3)加入50 L的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，用70%乙
醇洗沉淀2次，将RNA溶于40 ii L无菌RNAase-free ddH20。 4)通过电泳和紫外分光光度计检测RNA的浓度和完整度。 3 、 RT-PCR法统一模板DNA浓度 l)mRNA的反转录 以步骤2提取的经不同处理的野生大豆幼苗的RNA为模板，采用 ReverseTranscriptase M-MLV RNase H-(TaKaRa， cat no :D2639A)试剂盒反转录合成 cDNA。取RNA 5iiL，01igo dT 1 P L，混匀后70。C变性10min，迅速置于冰上冷却，然后加 入5XM-MLV Buffer 2 ii L， d證QOmM)O. 5 ii L， M-MLV ReverseTranscriptase 0. 25 ii L， RNAase Inhibitor 0. 25 ii L， RNAase-free ddH20 liiL，混匀后42。C lh，70。C 15min，4。C储 存备用。 2)模板cDNA的含量调平 根据GenBank上登录的大豆肌动蛋白基因设计内参引物，以步骤l)获得的经不同 处理的野生大豆幼苗的cDNA为模板，PCR扩增内参基因(肌动蛋白基因)，并进行琼脂糖 凝胶电泳检测。然后根据PCR产物的电泳结果对模板cDNA进行稀释，调整模板cDNA的用 量，直至内参基因扩增出的DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本 一致。 4、 GsDREBa基因表达分析 利用调平的模板cDNA，进行半定量RT-PCR。野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa 转基因植株在不同胁迫条件下RT-PCR检测的GsDREBa基因的表达结果如图8所示，可以看 出GsDREBa基因的表达受高盐、渗透、低温的影响，但是在根和叶中的表达特征并不相同，
推断该基因在野生大豆的根和叶以不同的机制参与到非生物胁迫信号传导途径中。 序列表 〈110〉东北农业大学 〈120〉野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa和其碱基序列 〈160>18 〈210>1 〈211>392 〈212>PRT 〈213>野生大豆(Glycine Soja)
〈400>1MetGlyAlaTyrAspGinValSerLeuLysProLeuAspSerSerArg151015LysArgLysSerArgSerArgGlyAspGlySerLysSerValAlaGlu202530ThrlieAlaLysTrpLysGluTyrAsnGluHisLeuTyrSerGlyLys354045AspAspSerArgThrThrArgLysAlaProAlaLysGlySerLysLys505560 [o川]Gly 65CysMetLysGlyLys 70GlyGlyProGinAsn 75SerGinCysAsnTyr 80ArgGlyValArgGinArgThrTrpGlyLysTrpValGlyGlulieArg859095GluProAsnArgGlySerArgLeuTrpLeuGlyThrPheSerSerAla100105110GinGluAlaAlaLeuAlaTyrAspGluAlaAlaArgAlaMetTyrGly115120125ProCysAlaArgLeuAsnPheProGlulieThrAspTyrProSerVal130135140LysGluSerLeuLysAspSerSerMetAlaAlaSerSerSerCysSer145150155160SerAlaAlaThrAlaAlaSerAspThrThrThrThrThrSerAsnGin165170175SerGluValCysAlaValGluAspVallieGluLysProAlaAsnVal180185190AsnAspLysPheAsnAspCysHisLysAlaTyrValSerAlaSerPro195200205ThrSerArgMetLysGinGluProArgAspGluAlaValAspHisMet210215220AspThrGlyAlaGlyGlulieGinAspValGlyLeuGluGlyThrHis225230235240AspThrGlyGinValAlaGluAsnValAsnLysAspGinMetAspLeu245250255SerTrplieAspGlyLeuAspPhelieAspAspTyrLeuLysSerLeu260265270SerAlaAspGluLeuPheGinValAspGluLeuLeuGlyLeulieAsp275280285AsnAsnProlieAspAsnSerValLeuMetGinGlyLeuAspPheGly290295300
Gin Met Gly Phe Pro Gly Asp Gly Asn Pro Gin Val Asp Asp Thr Pro305 310 315 320Ser Ser Phe lie Tyr Gin Leu Gin Asn Pro Asp Ala Lys Leu Leu Gly325330 335Ser Leu Pro His Met Glu Gin Thr Pro Ser Gly Val Asp Tyr Gly Leu340345 350Asp Phe Leu Lys Thr Val Glu Pro Gly Asp Tyr Asn Gly Gly Gly Glu355360 365Glu Pro Pro Phe Leu Asn Leu Asp Asp Asp Leu Asn His Asp Ser Asn370375 380Gly Met Gin Ala Arg Lys Gly Gly385 390〈210>2〈211>1360〈212>DNA〈213>野生大豆(Glycine Soja)〈400>2tttcattgag tectgtgtggcgaagtttgt gtcttggatt ttgtggacat gggtgcttat60gatcaagttt ctcttaagccattggattct tcteg朋3ga gg朋朋gteg g3gcagaggg120gatgggtcca aatctgtggctgagactett gc朋3gtgg3 3gg朋tec朋tgagcatctt180tettctggca朋g3tgategteg朋c朋ct cgt朋ggcgc cggcte朋gg ttcg朋ga朋240gggtgC3tg3朋ggg朋ggg3ggacctc朋朋ttctcagt gteactecag aggagttegg300C卿gg3C3t ggggg朋3tgggttggtgag attagggaac ccaategagg aagcaggctt360tggttgggta ccttctcttctgcccaggaa gctgctcttg cctatgatga agctgctaga420gctatgtetg gtccttgtgcacgcctcaat tttcccgaaa tcacagatta tccttctgtt480朋gg朋tcgt tg朋ggactcttcgatggct gcatcgtcgt cttgttcttc ggcagcaact540gcagcatctg acactactactec朋catcg朋cc朋tcgg aggtttgtgc tgttgaggat600gttetcgaga朋cctgcg朋tgtg朋tgat朋gttt朋tg attgtcatea ggcttecgte660tctgcctcac caactegtegaatgaagcaa gagccteggg atgaggctgt ggaccacatg720g織C3gggg ctgggg腿ttc朋gatgtc ggacteg朋g g朋c3catg3 tectgggcag780gttgc3gaga atgte朋teaagatcagatg gatttgtcat ggattgatgg ccttgacttt8403ttg3Cg3tt 3Cttg朋g3gcctttccgcg gatgagttet ttcaggtgga cgaacttttg■gggctteteg ateateacccaatcgateac tctgtgttga tgcaaggttt ggattttgga960caaatgggtt ttcctggagatggteatcct caggttgacg atectccttc aagctttett1020tetcagttgc朋朋tccag3tgcc朋gttg ttegg朋gtt tgccccatet ggagc3gac31080ccatcaggtg ttgattetggattegatttc ttg朋朋cag tggagccagg ggacteteat1140ggtggagggg aagaaccaccatttctteat ttggatgatg atcteaacca tgattcaaat1200ggcatgc朋g c朋gg朋gggtggctegaga aggctecgtg tetctgcttc attttcaact1260ggttctegcg tctgctggteatctgtctct tgggctgttg tccccttttt agctetetea 121320
〈222〉(24，25，29，30，34，35) 〈223>d = a或g或t 〈220〉 〈223>RACE的引物5 'RACEl (+)序列。 〈400>10 ggccacgcgt cgactagtac gggddgggdd 〈210>11 〈211>22 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223>RACE的引物5 'RACEl (-)序列。 〈400〉 11 朋ggategC3 c朋gg3ccat 〈210>12 〈211>22 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉RACE的引物5 'RACE2(+)序列。 〈400>12 gaggagttag gcagaggaca eg 〈210>13 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉RACE的引物5 'RACE2(-)序列。 〈400>13 tgcttcctct attgggctcc 〈210>14 〈211>22 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉RACE的引物5 'RACE3(-)序列。 〈400>14 cgtgtcctct gcctaactcc tc 〈210>15
gggddg 36
22
22
2014/14页
〈211>30 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根据拼接的序列设计扩增全长引物GsDREBa all(+)序列。 〈400>15
cacggatcca gtttgattga gtactgtgtg 30
〈210>16
〈211>30
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉根据拼接的序列设计扩增全长引物GsDREBa all(-)序列。 〈400>16
ggcgagctcc ttgtattagt tgtatagggg 30
〈210>17
〈211>78
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉GsDREBa转录因子在酵母细胞内与DRE元件结合特性分析用4次重复的DRE
件的正义序列DRE(+)。 〈400>17
aattcatact accgacatga gtatactacc gacatgagta tactaccgac atgagtatac 60
taccgacatg agtgagct 78
〈210>18
〈211>70
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉GsDREBa转录因子在酵母细胞内与DRE元件结合特性分析用4次重复的DRE
件的反义序列DRE(-)。 〈400>18
gtatgatggc tgtactcata tgatggctgt actcatatga tggctgtact catatgatgg 60 ctgtactcac 70
1权利要求
野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa，其特征在于野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa具有非生物胁迫抗性，并具有下列氨基酸序列之一①MetGlyAlaTyrAspGlnValSerLeuLysProLeuAspSerSerArgLysArgLysSerArgSerArgGlyAspGlySerLysSerValAlaGluThrIleAlaLysTrpLysGluTyrAsnGluHisLeuTyrSerGlyLysAspAspSerArgThrThrArgLysAlaProAlaLysGlySerLysLysGlyCysMetLysGlyLysGlyGlyProGlnAsnSerGlnCysAsnTyrArgGlyValArgGlnArgThrTrpGlyLysTrpValGlyGluIleArgGluProAsnArgGlySerArgLeuTrpLeuGlyThrPheSerSerAlaGlnGluAlaAlaLeuAlaTyrAspGluAlaAlaArgAlaMetTyrGlyProCysAlaArgLeuAsnPheProGluIleThrAspTyrProSerValLysGluSerLeuLysAspSerSerMetAlaAlaSerSerSerCysSerSerAlaAlaThrAlaAlaSerAspThrThrThrThrThrSerAsnGlnSerGluValCysAlaValGluAspValIleGluLysProAlaAsnValAsnAspLysPheAsnAspCysHisLysAlaTyrValSerAlaSerProThrSerArgMetLysGlnGluProArgAspGluAlaValAspHisMetAspThrGlyAlaGlyGluIleGlnAspValGlyLeuGluGlyThrHisAspThrGlyGlnValAlaGluAsnValAsnLysAspGlnMetAspLeuSerTrpIleAspGlyLeuAspPheIleAspAspTyrLeuLysSerLeuSerAlaAspGluLeuPheGlnValAspGluLeuLeuGlyLeuIleAspAsnAsnProIleAspAsnSerValLeuMetGlnGlyLeuAspPheGlyGlnMetGlyPheProGlyAspGlyAsnProGlnValAspAspThrProSerSerPheIleTyrGlnLeuGlnAsnProAspAlaLysLeuLeuGlySerLeuProHisMetGluGlnThrProSerGlyValAspTyrGlyLeuAspPheLeuLysThrValGluProGlyAspTyrAsnGlyGlyGlyGluGluProProPheLeuAsnLeuAspAspAspLeuAsnHisAspSerAsnGlyMetGlnAlaArgLysGlyGly；②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸。
2.如权利要求1所述野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa的碱基序列，其特征在于野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa的碱基序列所编码的野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa具有非生物胁迫抗性。
全文摘要
野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa和其碱基序列，它涉及一种DREB类转录因子GsDREBa和其碱基序列。它解决了目前可实际供使用的DREB转录因子比较少的问题。野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa具有非生物胁迫抗性，并具有下列氨基酸序列之一①如SEQ ID NO1所示；②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸。野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa的碱基序列所编码的野生大豆的DREB类转录因子GsDREBa具有非生物胁迫抗性。本发明可用于植物非生物胁迫基因工程。
文档编号C07K14/415GK101704880SQ20091007319
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年11月12日
发明者季佐军, 才华, 朱延明, 李勇, 柏锡, 纪巍 申请人:东北农业大学