专利名称：制作微珠的方法和微珠的制作方法
技术领域：
本发明涉及制作微珠的方法，也涉及微珠。更具体地，本发明涉及制作微珠的方法等，在制作微珠的方法中，给定类型的物质在表面上被固相化的微珠通过光刻胶法制备于基板上。
背景技术：
在核酸、蛋白质等的生化分析中，目前已在使用称之为“微珠”的粒子载体。例如， 在核酸的分析中，所用的微珠中，具有与靶核酸链相关的互补碱基序列的探针核酸链被固相化于其表面上。靶核酸链基于靶核酸链和探针核酸链之间的相互作用而分离。在蛋白质分析中，使用与靶蛋白相关的抗体固相化于微珠表面上的微珠按照类似的方式分离所述靶蛋白。近来，在利用这些微珠的生化分析中要求更高的处理能力，人们正就此开发实现高速分析的技术。在专利文献1中，例如，公开了“一种检测分析物的方法，所述分析物是样品内的多个分析物中的分析物，第一次提及的分析物采用各自的分析反应物识别，所述方法包括 (a)将多个群体(population)的荧光粒子与样品接触，这些群体分别具有不同的荧光信号和不同的分析反应物，其中分析反应物特异性地结合至样品中的一种分析物，而每一荧光粒子在其表面上具有至少一种用各个对应荧光染料标记的纳米粒子，(b)向所述样品中加入标记试剂，(c)检测标记，从而分析指示分析反应物与分析物的结合的荧光粒子，以及 (d)根据与各自群体相关的不同荧光信号的功能，同时确定结合至各自分析物的荧光粒子的群体”参见权利要求23。在由Luminex Trading, Inc.提供的“悬浮液阵列技术(Suspension ArrayTechnology) ”中，基于这种技术，在微珠上标记了两种类型的荧光染料的同时，在发光颜色上赋予了变化，由此能够使最大100种类型的微珠相互区分开。根据“悬浮液阵列技术”，当不同探针核酸链和抗体分别固相化于100种类型的微珠上时，就有可能同时通过一次分析而分离和检测100种不同类型的核酸链和蛋白质。在上述文献中，其记载了“荧光粒子的群体进一步根据其尺寸和形状进行检测”(参见权利要求25)并公开了对于区别微珠的其它参数，可以采用珠粒的尺寸和性状 (参见该文献的第0037段等)。与此有关的是，在非专利文献1中，还描述了在流路中根据光刻胶法制备多种不同形状的微珠的方法。根据这种方法，制作超过1百万种类型的微珠变成可能。现有技术文献专利文献专利文献1 日本专利公开No. 3468750非专利文献非专禾0 文献 1 "‘Multifunctional encoded particles forhigh-throughputbiomolecule analysis" . Science, 2007, Mar. 9 ；315 (5817) :1393-6
发明内容
技术问题在专利文献1和非专利文献1中公开的而具有不同荧光特性和形状的很多类型的微珠分别用彼此不同的探针核酸链或抗体固相化，并混合用作珠集(bead set)。这种珠集和包含靶核酸链的样品进行混合并冲洗，接着通过光信号、磁信号或电信号检测各微珠和其表面上捕获的靶核酸链。为了获得高分析精度，在珠集中存在的微珠数必须是清楚的。例如，对于最简单的样品，其中两种类型的微珠信号强度相互进行比较，如果珠集中所含的两种类型的微珠数目(群体)均不清楚，则不可能对所得信号强度进行相互比较。在这种情况下，为了精确比较分析信号强度，期望两种类型的微珠以相同的数目存在，或者如果数目不相等，需要知道两种类型的微珠之间数量比率。目前，在珠集中的群体通过在制备后基于重量和吸光度定量测定、并将其混合而进行了调节。然而，采用这种方法，不可能精确调节各种类型的微珠数目，由此引起群体变化，导致妨碍实现高分析精度。因此，作为主要目的，本发明提供了一种能够供给包含各种微珠并且其中各种类型的微珠群体清楚的珠集的制作微珠的方法。技术解决方案为了解决上述问题，本发明提供一种制作微珠的方法，其包括以下步骤在基板上形成用亲水性有机材料制成的亲水层，在所述亲水层上层积能够作为微珠剥离的薄膜，通过光刻胶法将薄膜形成为给定形状，在成形后的薄膜上固相化给定类型的物质，以及将所述物质固相化的、成形后的薄膜从所述基板连同至少一部分所述亲水层剥离而获得微珠。 根据这种微珠的制作方法，通过设计在光刻胶法中使用的光掩模形状，能够各自以任意数量制作具有任意的多形态的微珠。在这种微珠制作方法中，将溶解于溶剂中的亲水性有机材料涂覆于基板上并干燥而形成所述亲水层。此后，在所述剥离步骤中，将温度被设定在所述亲水性有机材料能够再溶解的温度下的溶剂用于溶解部分亲水层，或成形后的薄膜连同至少部分亲水层通过超声处理而剥离，由此获得微珠。按照这种方式，能够获得微珠，所述微珠每一个都具有提供了两个基本平行的相对面的立体形状，而仅仅在其一个面上固相化给定物质而另一个面在其至少一部分上赋予亲水性。在这种情况下，亲水层由一种或多种选自聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉、明胶、 琼脂、卡拉胶、果胶、刺槐豆胶和光敏性亲水树脂的亲水性有机材料形成。微珠制作方法还可以包括在所述基板上形成牺牲层的步骤。在这种情况下，亲水层层积于所述牺牲层上。在剥离步骤中，牺牲层被物理或化学侵蚀，从而所述成形后的薄膜连同所述亲水层一起被剥离。按照这种方式，像上述情况一样，能够获得的微珠，具有提供有两个基本平行的相对面的立体形状，并且其中仅仅在其一个面上固相化给定类型的物质，而另一个面在其至少一部分上被赋予亲水性。在这种情况下，所述亲水层由一种或多种选自光敏性亲水树脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉、明胶、琼脂、卡拉胶、果胶和刺槐豆胶的亲水性有机材料形成。所述牺牲层可以用氟系有机材料或聚酰亚胺有机材料，或可以用与亲水层所用的相同类型的亲水性有机材料或不同类型的亲水性有机材料形成。当所述牺牲层用氟系有机材料形成的情况下，这种由氟系有机材料形成的牺牲层在剥离步骤中进行升华或通过使用氟系溶剂溶解，从而由此容许所述成形后的薄膜从基板连同所述亲水层一起剥离而获得微珠。当所述牺牲层用聚酰亚胺有机材料形成的情况下，将这种由所述聚酰亚胺有机材料制成的牺牲层在所述剥离步骤中溶解于非质子溶剂中，由此容许所述成形后的薄膜从基板连同所述亲水层一起剥离而获得微珠。在用与所述亲水层相同类型的亲水性有机材料或不同类型的亲水性有机材料形成牺牲层的情况下，用所述亲水性有机材料形成的牺牲层在所述剥离步骤中于温度设定为亲水性有机材料能够再溶解的温度下的溶剂中溶解，或实施超声处理而由此容许所述成形后的薄膜从基板连同所述亲水层一起剥离而获得微珠。在这种微珠制作方法中，固相化步骤应该优选通过在薄膜上化学合成所述物质来实施。更具体地，对于这种物质，一种或多种选自核酸或肽的给定序列和糖链的生物高分子进行固相化。优选在成形步骤之后、固相化步骤之前于所述成形后的薄膜之间的区域中进行拒水整理。拒水整理能够防止滴加在所述成形后的薄膜表面上的溶液发生相互混合，由此能够使所需类型的物质固相化于各微珠上。在微珠制作方法中，薄膜适宜通过使用光刻胶或二氧化硅形成。在本发明的实施中，固相化于薄膜，即微珠上的“物质”，广泛包括那些能够与靶核酸或靶蛋白相互作用的物质，靶核酸或靶蛋白在使用微珠的生化分析中是分析中的靶。这种物质优选是选自给定序列的核酸或肽和糖链的生物高分子，并且应该包括能够与靶核酸等相互作用的分子。在“生物高分子”涉及核酸的情况下，核酸应该是具有给定碱基序列的核酸。“相互作用”是指具有互补碱基序列的核酸之间双链体的形成。在“生物高分子”涉及肽的情况下，这种肽应该是具有给定氨基酸序列的肽。“相互作用，，在这种情况下，例如， 是指蛋白-蛋白结合，如受体蛋白和配体蛋白之间的结合或抗原与抗体之间的结合。此外， 如果生物高分子涉及糖链，糖链应该是糖类结合的链或这种结合链还与脂质或蛋白质结合并是寡糖、糖脂质或糖蛋白。除此之外，这种“物质”还涵盖各种小分子形式的化合物。这些化合物是能够与靶核酸或靶蛋白结合的化合物，靶核酸或靶蛋白生化分析中的靶，以及是能够促进或抑制核酸或蛋白质的功能的化合物和成为药物开发领域的所谓“种子化合物” 的化合物。应该注意到，本文中所用的“核酸”包括，除了 DNA和RNA以外，通过其核糖部分的结构改性而获得的核酸类似物(例如，LNA(加锁核酸))。有益的效果根据本发明，提供了一种制作微珠的方法，该方法能够提供包括各种微珠并且各微珠的群体明确的珠集。
[图1]图1是示出根据本发明的微珠制作方法获得的微珠和珠集的示意图。[图2]图2是示出根据本发明一个实施方式的微珠制作方法的步骤的流程图。
[图3]图3是示意性示出根据本发明第一实施方式的微珠制作方法的成膜步骤S1 至成形步骤&和剥离步骤S7中基板上的构成的透视图。[图4]图4是示意性示出根据本发明第一实施方式的微珠制作方法的拒水整理步骤、中基板上的构成的俯视图。[图5]图5是示意性示出根据本发明微珠制作方法固相化步骤&中基板上的构成的透视图。[图6]图6是示意性示出根据本发明第一实施方式的微珠制作方法的成膜步骤S1 至固相化步骤&之后的基板(A)和剥离步骤S7之后的基板(B)的截面图。[图7]图7是示出根据本发明第二实施方式的微珠制作方法的步骤的流程图。[图8]图8是示出根据本发明第二实施方式的微珠制作方法的成膜步骤&至固相化步骤&之后的基板(A)和剥离步骤S7之后的基板(B)的截面图。[图9]图9是示出固相化于实施例1和3中微珠表面上的寡DNA的和靶寡DNA的结构的示图，其中㈧关于寡DNA-1，⑶关于寡DNA-2而(C)关于寡DNA-3。
具体实施例方式实施本发明的优选实施方式参照附图进行描述。应该注意到，以下举例说明的实施方式是本发明的典型实施方式的实例，本发明的范围不应该被解释为狭窄地限于这些实例。1.微珠(1)构形(configuration)和群体图1是示出根据本发明的微珠制作方法获得的微珠和珠集的示意图。在图1中，参考数字1表示的珠集由包括大致为圆柱体的微珠11和大致为立方体的微珠12的两种类型的微珠构成。根据本发明的微珠制作方法获得的微珠具有提供有两个基本平行的相对面的立体构形。微珠11和微珠12在整体形状上是不同的，并且能够基于构形上的差异通过一般的图像区分方式就能够相互区别开。珠集1包括给定数量的微珠11和微珠12(图1中每组4个)。根据本发明的微珠制作方法获得的珠集特征在于以给定数目包含构形上不同的多种类型的微珠并且所述数目明确。在珠集1中存在的各种类型的微珠的数目(群体)可以任意设定。为了简单起见， 图1示出了两种类型的微珠，基本上圆柱体和基本上立方体的(微珠)，每一种类型包含4 种微珠。在珠集1中可以包含三种以上类型的微珠，并且各种类型的微珠的数目可以相互不同。各种类型的微珠的构形可以任意设计，只要它们通过传统的成像辨别方式能够辨别。 本文中所用的“构形”除了包括微珠的整体构形外，还包括在微珠表面内或表面上的微细形状(典型地，就是所谓的“条形码”)。(2)探针在微珠11的表面上，存在固相化的生物高分子如核酸或肽、或糖类、或小分子(下文中称之为“核酸等”)，在图1中用符号P11表示。其特点是这些物质仅仅在微珠11表面中的两个基本平行相对面的一个面上进行固相化。
核酸等P11根据分析对象的类型可以使用给定的碱基序列或氨基酸序列。而且，核酸等P11可以使用糖链或各种化合物。下文中，主要描述核酸或肽用作核酸等P11的情况。例如，在核酸是分析对象的情况下，具有与其靶核酸相关的互补碱基序列的核酸链作为核酸等P11进行固相化。这使得样品中靶核酸链能够通过与核酸等P11杂交(双链体)形成而在微珠11上捕获、分离。应该注意到，核酸链等P11的碱基的数目(长度)是任意的，并且只要靶核酸链的碱基序列在其至少部分上具有互补碱基序列且双链体形成是可能的，则碱基的数目并没有严格限制。一般而言，核酸链等P11中碱基的数目是几个到几十个，优选约10至30个。例如，在蛋白质是分析对象时，能够与靶蛋白(例如，受体蛋白)相互作用的肽 (例如，配体蛋白的部分氨基酸序列)作为核酸等P11进行固相化。这使得样品中靶蛋白能够通过与核酸等P11相互作用而在微珠11上捕获、分离。另一方面，图1中通过符号P12表示的核酸等固相化于微珠12的表面上。核酸等 P12可以根据作为分析对象的核酸或蛋白质的类型使用给定碱基序列或氨基酸序列，也可以使用糖链，或者各种化合物。在微珠12中，这些物质固相化于基本平行而相互相对的两个面中的一个面(上表面)上。例如，当不同类型的物质，如具有不同碱基序列或氨基酸序列的核酸或肽，用作将固相化于微珠11的表面上的核酸等P11和将固相化于微珠12的表面上的核酸等P12时，不同类型的靶核酸或靶蛋白能够在各种类型的微珠上捕获、分离。用微珠11、12捕获和分离的靶核酸或靶蛋白采用荧光染料标记通过例如光学检测进行检测，同时微珠11、12通过图像识别手段进行辨别，由此使得两种类型的靶核酸或靶蛋白能够被同时分析。例如，对于单核苷酸多态(SNP)分析的情况，核酸等P11的碱基序列确定为对应于一个SNP的碱基序列，而核酸等P12的碱基序列作为对应于另一 SNP的碱基序列。这种珠集与样品混合，并将微珠11上的信号(例如，荧光信号强度)和微珠12上的信号进行相互比较，由此使得确定样品中所含的核酸的SNP类型之间的比率成为可能。(3)亲水性微珠11、12的两个基本平行相对面中，没有固相化核酸等P11和P12的面(在图中的底面)被赋予亲水性，该亲水性是由于下文描述的“亲水层”所产生。微珠通常由疏水材料形成，以便使用时保持其在水溶液中的构形。本发明的微珠 11、12也是通过下文描述的光刻胶法由疏水性薄膜材料形成。然而，在微珠由疏水材料形成的情况下，微珠表面变得疏水，因此由于疏水性相互作用而存在微珠相互凝聚的问题。微珠的相互凝聚使核酸等pn、p12不能被固相化。另外， 当它们用于分析时，采用图像识别手段辨别其构形变得不太可能，并且不能实现有效捕获和分离靶核酸或靶蛋白，这样就不能获得精确的分析结果。这就是微珠11、12被配置为赋予其两个基本平行的相对面中的一个面(图中的底面)亲水性的原因，由此防止微珠的相互凝聚。2.珠集按照这种方式，珠集1由具有不同构形的多种类型的微珠构成，所述微珠中碱基序列或氨基酸序列彼此不同的核酸链或肽被固相化。这使得同时分析样品中存在的多种靶核酸或蛋白质成为可能。如上文所述，为了获得高分析精度，在珠集中所含的各种类型的微珠数目必须是清楚的。例如，在前述SNP分析的情况下，如果珠集1中的微珠11、12的群体是未知的，则就不可能通过比对由此获得的信号而精确地确定样品中核酸的SNP类型之间的比率。在这点上，对于具有不同构形的多种类型的微珠的数目清楚的珠集1，微珠11和微珠12的数目能够彼此完全一致，由此可设定为相同的数目。因此，对二者获得的信号进行相互比较，由此能够获得高分析精度。3.微珠制作方法I(设置亲水层作为牺牲层的情况)参照图2，下面将描述涉及微珠和珠集的制作方法的第一实施方式。图2是示出根据第一实施方式的微珠制作方法的步骤的流程图。(1)亲水层的成膜步骤在图2中，用符号S1表示的“亲水层形成步骤”是“亲水层”形成在基板上而赋予微珠底面亲水性的步骤。在根据本实施方式的微珠制作方法中，亲水层起到了将微珠从其剥离的所谓牺牲层的作用。所用的基板包括，例如，玻璃基板、硅基板等。基板材料并没有严格限制，而常用于光刻胶技术的那些材料都可以采用。本发明中所用的“牺牲层”是指在下文描述的剥离步骤S7中能够进行物理或化学侵蚀的物质层。能够作为微珠剥离的薄膜形成于该牺牲层上作为上层并在剥离步骤中经受侵蚀而获得微珠。牺牲层应该优选是不会出现在剥离步骤之前的微珠制作步骤中、尤其是固相化核酸等的步骤中由于所用的化学品而使得基板上微珠被剥离的程度的侵蚀和损坏。牺牲层应该优选是能够在剥离步骤中被侵蚀而不会使微珠上固相化的核酸等变性或释放的层。如果在微珠上的固相化的核酸等发生变性、损坏、释放等，则靶核酸或靶蛋白就不能被捕获在微珠上。因此，所用牺牲层应该是可被侵蚀而同时保持与固相化于微珠上的靶核酸或靶蛋白如核酸等的相互作用性的层。在根据第一实施方式的微珠制作方法中，赋予微珠底面亲水性的亲水层也被用作所述牺牲层。该亲水层用亲水性有机材料形成。更具体地讲，将溶解于溶剂中的亲水性有机材料涂覆于基板上并干燥形成亲水层。所述亲水性有机材料可以通过旋涂、浸涂、丝网印刷、喷涂法、喷墨打印等进行涂覆。由此形成的亲水层可以通过使用溶剂而部分溶解，所述溶剂的温度设定在亲水性有机材料在下文描述的剥离步骤S7中能够再溶解的温度。因此，所用的亲水性有机材料应该优选是，例如，在室温(30°C)附近不会再溶解而在45°C附近或以上温度发生再溶解的亲水性有机材料。更具体而言，作为能够再溶解于热水或温水中的亲水性有机材料，可以使用一种或多种选自水溶性高分子如聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉等的物质。尤其是，聚乙烯醇优选用作牺牲层，因为在溶解于加热的溶剂后而被涂覆于基板上并干燥之后，除非再次加热，否则是不会再溶解的。除此之外，作为亲水性有机材料，可以采用的有明胶(其主要成分是胶原)、琼脂 (其主要成分包括琼脂糖和琼脂胶)、卡拉胶(其主要成分包括半乳糖和脱水半乳糖)、果胶(其主要成分包括半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯)、刺槐豆胶(其主要成分是半乳甘露聚糖)、光敏性亲水树脂等。(2)形成微珠薄膜的成膜步骤 在图2中，用符号S2表示的“微珠薄膜形成步骤”是形成层积于形成在基板上的亲水层上、由用于微珠的材料制成的薄膜的成膜步骤。形成由用作微珠材料的各种高分子、二氧化硅或金属(如铝、铬、金、银等)制成的薄膜。根据用于薄膜的材料类型，可以通过迄今已知的技术如采用旋涂机或狭缝涂布机或喷吹的涂布技术、或气相沉积如物理气相沉积(PVD)和化学气相沉积(CVD)进行膜形成。根据制作的微珠的厚度，适当设定薄膜的厚度(参见图1中的符号h)。作为用于薄膜的材料，优选使用包括环氧光刻胶如SU-8、聚酰亚胺光刻胶、丙烯酸光刻胶、酚醛清漆光刻胶等的光刻胶。采用高分子光刻胶薄膜，微珠能够比采用二氧化硅薄膜或金属薄膜的情况更加廉价地制作，并获得低比重的微珠。在分析时，将微珠与样品混合并分散于液相中。在此阶段，当微珠的比重较大时，液相中的分散状态就不可能长时间保持。SU-8在这些高分子中是优选的。SU-8是化学增幅的环氧系负性光刻胶。SU_8由美国IBM公司开发，适用于作为结合光刻胶超薄膜形成技术和光刻胶技术形成微结构的材料。当使用SU-8时，通过旋涂形成膜而很容易控制厚度。SU-8显示出高光学透明度并对于各种溶剂、酸和碱具有良好耐溶性和耐高温性。因此，使用SU-8使得具有不同厚度的微珠能够以简单方式制作并确保在微珠的制作工序中以及在使用微珠的分析过程中性能稳定。(3)成形步骤图2中用符号S3表示的“成形步骤”是在成膜步骤S2中形成的薄膜通过光刻胶法形成所需的形状。对于光刻胶如SU-8的膜(3-1)以及对于二氧化硅或各种金属的膜(3-2) 作为微珠的材料，该步骤通过不同工艺过程完成。(3-1)当光刻胶如SU-8用作微珠材料进行膜形成时在成膜步骤S2中形成的薄膜，如果必要，首先加热并固化(预烘焙)。接着，使用具有绘制有微珠构形的光掩模(下文中简称为“掩模”)进行曝光。将曝光后的基板浸没于液体显影剂中以除去不必要的薄膜区域，随后用液体冲洗剂(异丙醇IPA)冲洗而彻底除去不必要的区域。此后，进行后烘焙而随后留在基板上的薄膜上显现微珠的构形。当掩模中的构形根据要制作的微珠构形进行设计时，可以将具有任意构形的微珠形成于基板上。类似地，任意设计掩模使得具有不同构形的微珠能够分别以任意数目形成。 采用无掩模曝光设备，同样可以形成任意数目的具有任意构形的微珠，而无需制作光掩模。(3-2)当用二氧化硅或各种金属作为微珠材料进行膜形成时常用的光刻胶首先旋涂于薄膜表面，如果需要，也进行预烘焙。接着，采用例如上述的掩模进行曝光。将曝光后的基板浸没于液体显影剂以除去不必要的光刻胶区域，接着通过用液体冲洗剂(主要是超纯水)冲洗几次而除去不必要的区域并后烘焙。此后，薄膜通过蚀刻进行图案化而完全除去光刻胶。这使微珠构形能够在留在基板上的薄膜中显现。(4)官能团改性步骤
由图2中符号S4表示的“官能团改性步骤”是采用官能团对成形步骤S3中形成的薄膜表面进行改性的步骤。成膜步骤S2中形成于基板上的薄膜通过成形步骤S3仅仅留下一部分作为微珠，而其余部分都被除去。在官能团改性步骤S4中，为了在下文中说明的固相化步骤的官能团改性在用作微珠的部分的薄膜表面上进行。改性官能团可以是，例如，羟基、氨基、羧基、异硫氰酸酯基、环氧基、顺丁烯二酰亚胺基等。在传统的DNA芯片或蛋白芯片的制作中，为了在基板表面上引入用于固相化核酸链或肽的连接基，在基板表面上进行官能团改性。在本发明的实施中，可以采用类似的技术。对薄膜表面用羟基改性的具体实例进行说明。在这种情况下，基板表面首先用氨基丙基三乙氧基硅烷处理，然后浸没于溶解了 Y-戊内酯的二甲基甲酰胺中而发生反应， 完成羟基改性。或者，基板表面可以用缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷处理并浸没于四甘醇掺混少量浓硫酸的混合溶液中进行反应，完成改性。该官能团改性步骤S4和下文中说明的拒水整理(water repellentfinishing)步骤S5也可以先进行整理步骤S5,再进行官能团改性。应该注意到，这两个步骤并不总是必须的步骤。(5)拒水整理步骤 图2中S5表示的“拒水整理步骤”是将成形步骤S3中形成的薄膜之间的基板区域进行拒水整理的步骤。在成膜步骤S2中基板上形成的薄膜在成形步骤S3中的加工使得仅仅用作微珠的部分保留下来而其余部分被除去。在拒水整理步骤S5中，对薄膜被除去后的基板区域(成形后的薄膜之间的基板区域)赋予在随后说明的固相化步骤中所必要的拒水性。对已经除去薄膜的基板区域赋予拒水性有助于防止滴加在用作微珠的薄膜部分上的溶液彼此混合。例如，拒水整理可以按照以下方式进行。首先，将会成为微珠的薄膜部分用常用的光刻胶临时覆盖，而薄膜已被除去的基板区域用三乙氧基-1H，1H，2H，2H-十三氟-正辛基硅烷处理。此后，除去光刻胶，由此对珠区域以外的基板区域赋予拒水性。或者，在用光刻胶覆盖之后，可以旋涂氟树脂并进行烘焙以赋予拒水性。应该注意到，官能团改性步骤S4在完成拒水整理步骤S5之后进行的情况下，在薄膜已移除的基板区域完成拒水整理之后官能团仅仅在用作微珠的部分进行改性。(6)固相化步骤图2中由符号S6表示的“固相化步骤”是将核酸或肽固相化于成形步骤S3中形成的薄膜表面上的步骤。应该注意到，进行固相化的物质，除了核酸或肽外，包括糖链和各种此前列出的化合物。在此阶段，仅仅作为微珠的薄膜保留于基板上，而其它基板区域被赋予拒水性。在固相化步骤S6中，核苷溶液或氨基酸溶液(下文中总称为“单体溶液”)滴加在作为微珠部分的薄膜表面上，核酸或肽通过在薄膜上的逐步合成(St印synthesis)而固相化。核酸或肽的逐步合成可以通过重复结合反应的合成循环来进行，结合反应中根据所需的碱基序列或氨基酸序列，将含相应碱基或氨基酸的单体溶液依次滴加在用作微珠的薄膜上。例如， 在固相化核酸的情况下，利用吸液管滴加含核苷的单体溶液，接着，通过滴加5-乙基巯基四唑而发生反应。在冲洗和干燥之后，进一步滴加氧化溶液并发生反应，从而将核苷亚磷酸三酯转化成核苷磷酸三酯。在冲洗之后，滴加乙酸酐/四氢呋喃混合溶液并发生反应，从而封闭在官能团改性步骤S4引入的未反应的羟基。此外，在冲洗和干燥之后，滴加包含二氯乙酸的二氯甲烷溶液以从结合至基板的核苷的5'-羟基脱去二甲氧基三苯甲基保护基团。此后，进行冲洗和干燥，接着重复以上步骤(a)核苷链接，(b)冲洗， (c)氧化，(d)冲洗，(e)除去二甲氧基三苯甲基保护基团和(f)冲洗，并最后进行核酸碱基部分的去保护。这样，具有所需碱基序列的核酸可被固相化。在固相化肽的情况下，例如，滴加含α-氨基和侧链官能团被适当保护的氨基酸的单体溶液，并重复根据各种缩合方法在薄膜上进行的缩合步骤，然后最终除去各种保护基团。这使得具有所需氨基酸序列的肽能够被固相化。通过将含预先合成的核酸或肽的溶液滴加在用作微珠的部分的薄膜上并与在官能团改性步骤S4引入的官能团结合，由此可以固相化核酸或肽。可以通过用吸液管或微分散器或喷墨点样进行点样来滴加单体溶液和预先合成的核酸或肽的溶液。(7)剥离步骤通过图2中由符号S7表示的“剥离步骤”是从基板上剥离成形后的薄膜的步骤，核酸和肽已在成形后的薄膜上固相化。在根据第一实施方式的微珠制作方法中，亲水层具有赋予微珠底面亲水性的功能以及作为牺牲层的功能。在该剥离步骤S7中，部分亲水层被温度设定在亲水性有机材料能够再溶解的温度下的溶剂溶解和侵蚀。例如，当水溶性高分子如聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉等用作亲水性有机材料时，部分亲水层被温度设定于45°c附近或更高的温度下的溶剂再溶解。亲水层由于再溶解作用而被侵蚀，之后，层积于亲水层上的薄膜作为微珠被剥离。 此时，部分亲水层由于未溶解而被保留于薄膜表面接触亲水层的这一侧，由此微珠表面通过该剩余的亲水层而被赋予亲水性。当亲水性有机材料被溶解于加热的溶剂中时，部分亲水层在大多数情况下都保留于薄膜表面上。为了对微珠表面赋予令人满意的亲水性，亲水层的再溶解应该优选在使部分亲水层积极地保留于薄膜表面上的条件下进行。在本实施方式的剥离步骤S7中，作为侵蚀亲水层(用作所谓牺牲层)的液体去除齐U，可以使用加热至能够再溶解亲水性有机材料的温度的溶剂，优选加热的纯水。正如上文所述，牺牲层应该优选这样的牺牲层能够在所述剥离步骤中能够被侵蚀而不会使在微珠上固相化的核酸等发生变性或释放。在本实施方式中，纯水用作液体去除剂，其使得能够通过侵蚀牺牲层的同时、保持微珠上固相化的核酸等与靶核酸、靶蛋白等的相互活性而获得微珠。应该注意到，也可以通过将薄膜成形之后的基板进行超声处理、从而物理侵蚀亲水层来剥离薄膜。这种超声处理应该优选在将部分亲水层保留于薄膜表面上的条件下进行。4.微珠制作方法I的具体实例(将亲水层作为牺牲层的情况)(1)亲水层形成步骤至成形步骤
接着，参照图3 图5，对根据第一实施方式的微珠和珠集的制作方法进行具体描述。图3是示意性示出成膜步骤S1至成形步骤S3和剥离步骤S7中基板上的构成的透视图。 这里将SU-8用作微珠材料，将说明制作图1中所示的微珠和珠集的情况下的实例。首先，在成膜步骤S1中，亲水层3层积于基板2上(参见图3的(A))。接着在成膜步骤S2中，将SU-8置于亲水层3上(参见图3的(B))，接着旋涂而形成薄膜4 (参见图 3 的(C))。在此阶段，控制SU-8的量和旋涂机的旋转频 率(参见图中的箭头)以控制薄膜4 的厚度，由此适当设定所制作的微珠厚度(参见图1中的符号h)。将在成膜步骤S1中形成的薄膜4进行预烘焙，接着，通过在成形步骤S3中利用绘制有微珠构形的掩模M来曝光(参见图3的(D))。图中箭头指示来自光源的光。将曝光后的基板2浸没于液体显影剂中以除去其不必要的部分处的薄膜4。而且， 将基板用液体冲洗剂冲洗，使得微珠11、12以保留于基板2上的薄膜4的形式出现(参见图3的(E))。当掩模M中的构形根据所要制作的微珠构形设计时，可以在基板2上形成具有任意构形的微珠。类似地，如果掩模M任意设计，则具有不同构形的微珠就能够分别按照任意数目形成。因此，根据本实施方式的微珠制作方法，根据构形上的差异来辨别类型的微珠就能够有效地以低成本进行制作。另外，根据掩模的设计，就能够制作多种类型的微珠的群体都清楚地设置的珠集。(2)官能团改性步骤至拒水整理步骤在本实施方式的微珠制作方法中，在官能团改性步骤S4中，官能团改性在薄膜4 作为微珠11、12的部分的表面上完成。在拒水整理步骤S5中，基板2的已除去薄膜4的区域(即在作为微珠11、12的部分的薄膜4之间的基板)，进行拒水整理。此后，核酸或肽等在固相化步骤S6中在各个薄膜表面上固相化。图4是示意性示出拒水整理步骤S5中基板上的构成的俯视图。图4的(A)示出了微珠11、12如图3中所示形成于基板2上的情况。仅仅作为微珠11、12的部分的薄膜4根据成形步骤S3保留于基板上，而其它部分被除去(参见图3的 (E))。在拒水整理步骤S5中，将拒水性赋予基板区域，该区域用阴影线表示并且薄膜4已从此处除去，(即，所述亲水层3被曝光的区域)。例如，通过将由阴影线表示的基板区域进行三乙氧基-1H，1H，2H，2H-十三氟-正辛基硅烷处理来进行拒水整理。这使得能够防止滴加在用作微珠11、12的部分的薄膜4表面的溶液发生相互混合。因此，在固相化步骤S6中，当单体溶液或预先合成的核酸或肽溶液滴加在用作微珠的部分的薄膜表面上时，这种溶液可以很容易被点样在目标部位，由此，可以合成并固相化具有所需碱基序列或氨基酸序列的核酸链等。另外，当固相化糖链和化合物时，它们没有出现混合ο在图4的(A)中，进行拒水整理而包围各个作为微珠的薄膜部分。在相同类型的多个微珠形成于基板上的情况下，可以进行拒水整理以包围其上形成相同类型的微珠的区域。例如，在两种类型的微珠11、12分别以给定数目形成的情况下，在图4的⑶中所示的阴影区域内进行拒水整理。这使得对于相同类型的微珠(微珠组)能够集中滴下单体溶液等并且能够防止与滴加在其它邻近组微珠上的溶液的混合。
单体溶液等利用吸液管或微分散器点样或者通过喷墨点样滴加。当使用这样的点样系统时，具有细微不同的液体物理性质和相对高粘度的微液释放到空气中，并沉积于基板上。当释放时，产生喷雾样液滴(所谓“卫星状”(satellite))，使得单体溶液等出现沉积在预定位点以外的位点。在本发明的微珠制作方法中，因为微珠最终从基板上剥离，如果这样的单体溶液等以卫星状形式沉积于作为微珠的部分以外的基板区域上也不会产生问题。(3)固相化步骤 图5是示意性示出固相化步骤S6中基板上的构成的透视图。这里说明一个实例， 其中如图3和图4的(A)所示，将微珠11、12形成于基板2上并进行拒水处理，接着通过逐步合成将微珠11、12的表面上固相化核酸。在附图中，在亲水层3的上层上形成的微珠11、 12被放大显示。首先，将含腺嘌呤“A”的单体溶液滴加于用作微珠11的部分的薄膜4表面上。在官能团改性步骤S4中将连接基引入薄膜4的表面上。类似地，将含鸟嘌呤“G”的单体溶液滴加在作为微珠12的部分的薄膜4表面上。此后，在滴加的单体溶液中进行与腺嘌呤或鸟嘌呤的结合反应(参见图5的(A))。其次，含胞嘧啶“C”的单体溶液滴加于作为微珠11的部分上，而含胸腺嘧啶“T” 的单体溶液滴加于作为微珠12的部分上，接着进行第二阶段结合反应(参见图5的(B))。 此后，重复合成步骤直至获得所需的碱基序列。在拒水整理步骤&中，在图中阴影部分所示的区域进行拒水整理，由此，滴加于作为微珠11的部分上的单体溶液和滴加于作为微珠12的部分上的单体溶液不会发生相互混合。因此，能够精确合成具有所需碱基序列的核酸链并被固相化在各个微珠11、12的表面上。利用基于诸如用于已知DNA芯片的光化学反应的固相化，对于一个阶段的反应， 不得不进行对各个碱基(A、G、T和C)采用四个光掩模的四个结合反应。与之相反，根据本发明，含有各个碱基的单体溶液分别滴加于被拒水整理区域分隔的微珠上，由此同时进行结合反应。因此，核酸链的合成和固相化能够以低成本实现。(4)剥离步骤图6是示意性示出(A)成膜步骤S1至固相化步骤S6完成之后获得的基板和(B) 进一步完成剥离步骤S7之后获得的基板的截面视图。该图示出了基板2上已经形成了微珠11的区域的截面。在成膜步骤S1至固相化步骤S6完成之后的基板2上，经由亲水层3，通过光刻胶法层积有用核酸等P11在其表面上固相化的薄膜4 (微珠11)。在所述剥离步骤S7中，起到所述牺牲层作用的亲水层3部分溶解于温度设定于可发生再溶解的温度下的溶剂中，或将基板2进行超声处理，由此容许微珠11 (薄膜4)从基板2剥离(参见图6的(B))。这样，能够获得微珠11、12及由其构成的珠集，如图3的(F) 所示。由于上述制作方法，由此获得的微珠11具有包含两个基本平行的相对面的立体构形。更具体而言，两个基本平行的相对面由于薄膜4的成膜步骤S2而形成。两个面之间的距离对应于微珠的厚度(参见图1中的符号
h)并能够通过控制膜厚度而进行任意控制。
核酸等P11固相化于微珠11的两个基本平行的相对面之一上。另一个面(接触亲水层3的那一侧的表面)由于剩下部分未溶解的亲水层3而被赋予亲水性。5.微珠制作方法II(提供独立于亲水层的牺牲层的情况)图7是示出根据第二实施方式的微珠制作方法的步骤的流程图。在有关第一实施方式的微珠制作方法中，步骤S1中形成的亲水层具有作为所谓牺牲层的功能。在剥离步骤S7中通过侵蚀亲水层的同时在薄膜表面上保留一部分，微珠被剥离，同时其表面被赋予亲水性。在这种情况下，有必要在使薄膜表面上保留部分亲水层而对微珠表面赋予令人满意的亲水性的条件下侵蚀亲水层。根据此处说明的第二实施方式的微珠制作方法的特征在于，在形成亲水层之前， 独立地形成容许微珠从其剥离的“牺牲层”。因此，在此第二实施方式的微珠制作方法中，亲水层的作用是仅仅在微珠的底面上赋予亲水性。(1)牺牲层的形成步骤在图7中用符号Stl表示的“牺牲层形成步骤”中，通过使用氟系有机材料或聚酰亚胺有机材料，或与亲水层牺牲层相同或不同类型的亲水性有机材料，而在基板上形成牺牲层。(1-1)利用氟系有机材料形成牺牲层的情况在牺牲层由氟系有机材料形成的情况下，作为低分子量材料，使用三嗪的氟衍生物、稠合芳族的氟衍生物或金刚烷的氟衍生物等。作为高分子材料的氟系有机材料，可以由如全氟树脂、部分氟树脂、含氟光固化树脂等的氟树脂制成。氟系有机材料溶解于溶剂中并通过旋涂形成膜，干燥或光固化而提供膜。因为氟系有机材料的氟化程度越高，越难溶于水或有机溶剂，其仅仅可溶于氟系溶剂。因此，如果牺牲层由氟系有机材料构成，则这种牺牲层在剥离步骤和固相化核酸等的步骤之前不会被微珠制作步骤中采用的化学品侵蚀或损坏。另外，氟系溶剂不太可能与带电荷的高分子混合并具有难以溶解除氟系高分子之外的高分子的性能。在这个意义上，当氟系有机材料的层作为牺牲层提供而在剥离步骤S7 中用氟系溶剂进行侵蚀时，固相化于微珠上的核酸等并不会发生变性、损毁、释放等。而且， 当低分子量物质特别是如三嗪的氟衍生物用作氟系有机材料，微珠能够在剥离步骤S7中通过牺牲层发生升华而剥离，确保更可靠地保持核酸等与靶核酸或靶蛋白的相互活性。氟系有机材料的优选氟化度至少不低于约30原子％。设置在该数值范围的氟化度使得牺牲层能够对在例如成膜步骤S2中所用的溶剂如环戊酮、1-甲氧基-2-丙基乙酸酯等具有耐溶性。(1-2)使用聚酰亚胺有机材料形成牺牲层的情况牺牲层由聚酰亚胺有机材料形成的情况下，使用了通用的聚酰亚胺树脂。如果牺牲层由聚酰亚胺有机材料形成，则牺牲层在剥离步骤之前以及在核酸等的固相化步骤中不会受到微珠制作步骤中采用的化学品的侵蚀和损坏。此外，如果用非质子溶剂、如N-甲基-2-吡咯烷酮等在所述剥离步骤S7中侵蚀该层，则固相化于微珠上的核酸等并不会发生变性、损坏、释放等。应该注意到，牺牲层可以用酚醛清漆树脂代替聚酰亚胺树脂形成。
(1-3)用亲水性有机材料形成牺牲层的情况在牺牲层用亲水性有机材料形成的情况下，使用了与此后描述的亲水层所用的相同或不同类型的亲水性有机材料。在根据此第二实施方式的微珠制作方法中，亲水层所用的材料是一种或多种选自光敏性亲水树脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉、明胶、琼脂、卡拉胶、果胶和刺槐豆胶的亲水性有机材料。尽管牺牲层可以通过使用与那些亲水层材料相同的亲水性有机材料形成，但是优选使用与亲水层的亲水性有机材料类型不同且可再溶解性高的材料。其理由如下。即，由亲水性有机材料形成的牺牲层通过使用温度设定于在剥离步骤S7中牺牲层的亲水性有机材料能够再溶解的温度(例如约45°C或更高)下的溶剂而被溶解。此时，为了在成膜步骤S1中形成的亲水层并不发生溶解，牺牲层优选由比亲水层更易于再溶解的材料形成。更具体而言，优选光敏性亲水树脂或聚乙烯醇用作亲水层的材料，而牺牲层的材料利用第一次提及的材料以外的亲水性有机材料。光敏性亲水树脂在光敏化时发生凝胶而变得不溶于冷水。当聚乙烯醇溶解于加热溶剂中，涂覆于基板上并干燥后，除非再次加热， 否则不会发生再溶解。因此，如果亲水层由光敏性亲水树脂或聚乙烯醇形成且牺牲层由其它类型的亲水性有机材料形成时，在亲水层保留的情况下仅仅侵蚀牺牲层。应该注意到，在亲水层通过超声处理被物理侵蚀来剥离薄膜的情况下，因为相同的理由，优选牺牲层由不同于亲水层的类型的亲水性有机材料形成而更易于由于超声处理而被侵蚀。(2)亲水层的成膜步骤至固相化步骤图7中符号S1表示的“亲水层形成步骤”是在形成在基板上的牺牲层上层积亲水层的步骤。除了亲水层层积于牺牲层上之外，该步骤S1可以按照根据第一实施方式的微珠制作方法的相同方式进行。然而，关于这一点，应该注意以下事实第二实施方式的步骤S1中形成的亲水层并没有用作牺牲层，而仅仅赋予微珠表面亲水性。亲水层的材料包括一种或多种选自光敏性亲水树脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉、明胶、琼脂、卡拉胶、果胶和刺槐豆胶的亲水性有机材料。其中，优选亲水层由光敏性亲水树脂或聚乙烯醇形成，对于在剥离步骤S7中仅仅侵蚀牺牲层而同时保留亲水层的目的而言，它们的可再溶解性较低。对于光敏性亲水树脂，例如，可以使用叠氮基光敏基团侧链接于(pendant)聚乙烯醇的水溶性光敏树脂。通过将溶解于溶剂中的树脂利用旋涂等涂覆于基板上后进行光敏化作用来实现光敏性亲水树脂的膜形成。光敏性亲水树脂的光敏化作用按照，与用于随后的微珠薄膜的成膜步骤S2中进行膜形成的薄膜材料相同的光敏波长区域和曝光能量进行，由此可以使用其正负属性都相同的光敏性亲水树脂。在这种情况下，当形成的薄膜通过光刻胶法在成形步骤S3中按照所需的构形形成时，亲水层能够通过使用相同的掩模而被光敏化。因此，通过将由光敏性亲水树脂制成的亲水层和微珠薄膜通过使用相同掩模同时曝光而能够提高工作效率。仅仅与作为微珠的薄膜接触的亲水层部分能够进行交联，使得亲水层对用作微珠的薄膜的附着力提高。应该注意到，当然，也可以使用独立的掩模进行亲水层和微珠薄膜的曝光。光敏化的光敏性亲水树脂由于凝胶作用而在冷水中变得不溶。未固化的光敏树脂能够通过在设定于35°C或更高的热水中溶解而被除去。除了这里说明的步骤之外的步骤，包括微珠薄膜形成步骤&、成形步骤&、官能团改性步骤、、拒水整理步骤&和固相化步骤&，可以按照根据第一实施方式的微珠制作方法中相同的方式进行。因此，这些步骤的说明在这里被省略。(3)剥离步骤(3-1)牺牲层的侵蚀图7中符号S7表示的“剥离步骤”是将用核酸或肽固相化的成形后的薄膜从基板上剥离的步骤。图8是示意性示出(A)在成膜步骤&至固相化步骤&实施之后获得的基板和(B) 在进一步进行剥离步骤S7之后获得的基板。这些图分别示出了基板2上形成微珠11的区域的截面。如图8的(A)所示，在本实施方式的微珠制作方法中，牺牲层5作为牺牲层形成 (步骤Stl)，其上层积亲水层(步骤S1)和微珠薄膜(步骤S2)。在此剥离步骤S7中，牺牲层 5被物理或化学侵蚀而连同亲水层3 —起剥离所述薄膜4而获得微珠11。更具体而言，在牺牲层5由氟系有机材料形成的情况下，氟系溶剂用作液体去除剂而侵蚀牺牲层5，或氟系有机材料发生升华而侵蚀掉牺牲层5。氟系溶剂不太可能与带电荷的高分子混合，并且具有难溶解高分子的性质。因此，如果氟系溶剂用于侵蚀牺牲层5 时，仅仅牺牲层5能够被侵蚀掉而不会再溶解亲水层3。在将低分子量物质、特别是三嗪的氟衍生物用作氟系有机材料层时，在100°C或更低的低温下就能够完成升华和去除，而不会损坏亲水层。在牺牲层5由聚酰亚胺有机材料形成的情况下，非质子溶剂用作液体去除剂以侵蚀牺牲层5。一旦侵蚀掉由氟系有机材料或聚酰亚胺有机材料形成的牺牲层5，该层就通过完全溶解或升华被除去，而不会容许其保留于被剥离的微珠11的表面上。如果牺牲层5保留于微珠表面上，则存在所得微珠由于氟系有机材料或聚酰亚胺有机材料的疏水性而相互凝聚的可能性。在牺牲层5由亲水性有机材料形成的情况下，牺牲层5用温度设定于亲水性有机材料能够再溶解的温度下的溶剂或通过超声处理而被侵蚀掉。在这种情况下，牺牲层5应该优选由不同于亲水层3的亲水性有机材料的类型的并且更易于被侵蚀的亲水性有机材料形成。这使得能够通过超声处理或热水处理而单独侵蚀掉牺牲层并同时原样保留亲水层。在牺牲层5由亲水性有机材料形成的情况下，即使被侵蚀的牺牲层5未被完全溶解而残留于微珠11的表面上，在基于亲水层3的微珠表面上的亲水性也不会降低。(3-2)亲水层的蚀刻在牺牲层5的侵蚀之前，优选蚀刻亲水层3。在成膜步骤&中于基板上形成的薄膜4，在成形步骤&中按照仅仅将作为微珠11的部分保留下来而除去其余部分的方式进行加工。在薄膜4已经从其移除的基板区域(在成形后的薄膜之间的基板区域)暴露的亲水层3通过蚀刻而被移除。这有利于位于亲水层3之下的牺牲层5的溶解或升华。蚀刻通过使用温度设定于亲水性有机材料能够再溶解的温度下的作为液体去除剂的溶剂进行，并且在这种条件下进行，使得成形后的薄膜4(微珠11)之间暴露的亲水层3 能够被溶解和去除。蚀刻条件应该是这样的条件，在该条件下过度溶解亲水层3也不会使微珠11剥离。
关于这一点，在亲水层3由光敏性亲水树脂形成的情况下，仅仅在成形后的薄膜 4(微珠11)之间暴露的未固化光敏亲水性树脂能够被选择性除去，使得能够有效地防止微珠的剥离。在第二实施方式的微珠制作方法中，牺牲层5在剥离步骤S7中被侵蚀掉，其结果是大部分亲水层3被保留于薄膜4的接触亲水层3的那一侧的表面上，而同时能够剥离成形后的薄膜4 (微珠11)。特别地，如上文所述，在亲水层3由其正负属性在相同光敏波长区域和曝光能量下都与薄膜4相同的光敏性亲水树脂形成，并且使用相同的掩模曝光薄膜4和亲水层的情况下，成形后的薄膜4(微珠11)和与之接触的亲水层之间的附着力增强。因此，微珠能够以使所有亲水层3原样保留的状态被剥离。按照这种方式，与前面说明的第二实施方式的方法相比，本实施方式的微珠制作方法能够赋予微珠表面更好的亲水性。实施例11.在亲水层(PVA)用作牺牲层时的微珠的制作在本实施例中，在基板上形成为膜的SU-8通过光刻胶法成形并进行核酸链的固相化，接着进行剥离而获得微珠。这里通过使用聚乙烯醇(PVA)形成亲水层，其起到所谓的牺牲层的作用，由此容许SU-8薄膜被剥离。(1)亲水层形成步骤将PVA(全皂化型，具有的聚合度为 500，由 Wako Pure Chemicallndustries, Ltd. 生产，而在热溶解调节至IOwt %之后使用)旋涂(首先在500r.p.m.保持5s，然后在2500r. P. m下保持30s)于硅基板上，进行O2等离子体处理(直接等离子体，气体类型02，功率 100W，流速30sCCm，时间10s)，接着在85°C下干燥120min。采用接触膜厚度仪的PVA膜厚度测定表明厚度约600nm。(2)微珠薄膜形成步骤为了确保PVA和SU-8之间的附着力，涂布PVA的基板进行O2等离子体处理(直接等离子体，气体类型02，功率100W，流速30SCCm，时间10s)而活化，接着将用甲苯稀释至2-(3，4_环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.生产)旋涂(首先在500r. p. m保持5s.，随后在5000r. p. m下保持30s)，并在100°C 下干燥90s。SU-8 (SU-8-3035-N-02，由 Kayaku Microchem Corporation 生产，并在用环戊酮两倍稀释之后使用)进行旋涂(首先在500r. p. m保持15s，然后在1500r. p. m下保持30s)， 并在100°C下干燥2min。(3)成形步骤采用在其中绘制有微珠图案的铬掩模，用接触光刻机(contact aligner)进行i-射线曝光(170mJ/cm2)，接着在100°C下干燥3min。采用SU-8显影剂(Kayaku Microchem Corporation生产)进行显影，并在用IPA冲洗之后，在150°C下硬烘焙(hardbaking) lOmin，从而在基板上获得成列的珠图案。采用接触膜厚度仪的SU-8膜厚度测定表明厚度约3 μ m。(4)官能团改性步骤将含SU-8珠图案的基板进行O2等离子体处理(直接等离子体，气体类型02，功率100W，流速30SCCm，时间10s)而被活化，接着用2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷进行处理(1201，1011，气相反应)。(5)固相化步骤图9的㈧中所示的寡DNA-I (参见表1中的序列No. 1)溶解于2 X SSC缓冲液中而制成其 ο μ M溶液并在搅拌下浸润载有硅烷偶联珠的基板12h。取出基板，并在搅拌下于含0. 2M的SDS的2 X SSC缓冲液中冲洗15min。接着，在搅拌下于新的含0. 2M的SDS的 2 X SSC缓冲液中冲洗5min，同时加热至90°C。将基板用流水冲洗!Min并干燥。[表 1]
权利要求
1.一种制作微珠的方法，包括在基板上形成用亲水性有机材料制成的亲水层的步骤，在所述亲水层上层积能够作为微珠剥离的薄膜的步骤，将由此形成的薄膜通过光刻胶法成形为给定构形的成形步骤，在成形后的薄膜上固相化给定物质的固相化步骤，以及将固相化有所述物质的成形后的薄膜从所述基板连同至少一部分所述亲水层一起剥离而获得微珠的剥离步骤。
2.根据权利要求1所述的制作微珠的方法，其中，将溶解于溶剂中的亲水性有机材料涂覆到所述基板上并干燥以形成所述亲水层，此后在所述剥离步骤中，使用温度被设置在所述亲水性有机材料能够再溶解于其中的温度下的溶剂来溶解部分所述亲水层，或者实施超声处理，从而容许所述成形后的薄膜连同至少一部分的所述亲水层一起被剥离而获得微珠。
3.根据权利要求2所述的制作微珠的方法，其中，所述亲水层通过使用一种或多种选自聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉、明胶、琼脂、卡拉胶、果胶、刺槐豆胶和光敏性亲水树脂的亲水性有机材料而形成。
4.根据权利要求1所述的制作微珠的方法，还包括在所述基板上形成牺牲层的步骤， 所述亲水层层积于所述牺牲层上，此后所述牺牲层在所述剥离步骤中被物理或化学侵蚀以<容许所述成形后的薄膜连同所述亲水层一起被剥离而获得微珠。
5.根据权利要求4所述的制作微珠的方法，其中，所述亲水层通过使用一种或多种选自光敏性亲水树脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直链淀粉、明胶、琼脂、卡拉胶、果胶和刺槐豆胶的亲水性有机材料而形成。
6.根据权利要求5所述的制作微珠的方法，其中，所述牺牲层通过使用氟系有机材料形成，并且用所述氟系有机材料形成的所述牺牲层在所述剥离步骤中发生升华或者通过使用氟系溶剂而被溶解，由此容许所述成形后的薄膜从所述基板连同所述亲水层一起剥离而获得微珠。
7.根据权利要求5所述的制作微珠的方法，其中，所述牺牲层通过使用聚酰亚胺有机材料而形成，并且在所述剥离步骤中，用所述聚酰亚胺有机材料形成的所述牺牲层通过使用非质子溶剂溶解，从而容许所述成形后的薄膜从所述基板连同所述亲水层一起剥离而获得微珠。
8.根据权利要求5所述的制作微珠的方法，其中，所述牺牲层通过使用与所述亲水层类型相同或不同的亲水性有机材料形成，并且用所述亲水性有机材料形成的所述牺牲层在所述剥离步骤中通过使用温度被设定在所述亲水性有机材料能够再溶解于其中的温度下的溶剂溶解或者进行超声处理，从而容许所述成形后的薄膜从所述基板连同所述亲水层一起剥离而获得微珠。
9.根据权利要求3以及6至8中任一项所述的制作微珠的方法，其中，所述固相化步骤通过在所述薄膜上化学合成所述物质来实现。
10.根据权利要求9所述的制作微珠的方法，其中，一种或多种选自具有给定序列的核酸或肽、以及糖链的生物高分子作为所述物质进行固相化。
11.根据权利要求10所述的制作微珠的方法，其中，所述成形后的薄膜之间的区域在所述成形步骤之后所述固相化步骤之前进行拒水整理。
12.根据权利要求11所述的制作微珠的方法，其中，所述薄膜用光刻胶或二氧化硅形成。
13.根据权利要求3以及6至8中任一项所述的制作微珠的方法获得的微珠。
14.根据权利要求13所述的微珠，其中所述微珠每一个都具有提供了两个基本平行的相对面的立体构形，并且仅仅在其一个面上固相化给定物质，而另一个面在其至少一部分上被赋予亲水性。
全文摘要
本发明提供一种制作微珠的方法，这种方法能够提供包含各种类型的微珠并具有各类型的微珠的明确的群体的珠集。本发明也提供一种制作微珠的方法，这种方法包括在基板上形成亲水性有机材料制成的亲水层的步骤S1，在所述亲水层上层积能够以微珠形式剥离的薄膜的步骤S2，通过光刻胶法使所述薄膜成形为给定形状的成形步骤S3，在成形后的薄膜上固相化给定物质的固相化步骤S6，以及将所述用所述物质固相化的成形后的薄膜从所述基板连同至少一部分所述亲水层剥离而获得微珠的剥离步骤S7。
文档编号C12N15/09GK102165317SQ20098013731
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月4日 优先权日2008年9月30日
发明者岸井典之, 市村真理, 田中正信, 町田贤三 申请人:索尼公司