离心力和剪应力应答基因1在脂肪肝和糖尿病中的功能和应用的制作方法

离心力和剪应力应答基因1在脂肪肝和糖尿病中的功能和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种RECS1在脂肪肝、糖尿病中的功能和应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以RECS1基因敲除小鼠和野生型C57小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的脂肪肝、糖尿病模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，RECS1基因敲除小鼠的糖代谢紊乱，脂肪肝病变严重，脂质蓄积增加显著。这说明RECS1对维持糖代谢稳态具有调控能力，有肝脏脂质清除和抗脂肪肝形成的能力。从而发现RECS1在脂肪肝、糖尿病中的功能，主要体现在其具有能够改善脂肪肝、糖尿病的作用。针对RECS1的上述功能，RECS1可用于在制备治疗脂肪肝和糖尿病的药物。
【专利说明】离心力和剪应力应答基因1在脂肪肝和糖尿病中的功能和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种离心力和剪应力应答基因I(responsive to centrifugal force and shear stress gene I，RECSl)在脂肪肝糖尿病疾病中的功能和应用。 【背景技术】
[0002]糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性代谢性疾病，预计到2030年患者的数量将增加到4.39亿，这意味着在全球20-79岁成年人中将会有7.7%是糖尿病患者。在过去的二三十年里，糖尿病患者数量已经翻倍，对全球人类的健康是一个极为严重的威胁。当前儿童、青少年及青年人群中2型糖尿病及2型糖尿病前期发病率剧增，这也意味着未来糖尿病的发病人群将扩大，防治难度将会大增【I】。
[0003]肝脏作为人体的生化工厂，三大能量代谢物质均需在这个工厂加工处理才能转为机体所用，足见肝脏在代谢中重要地位。三大物质代谢紊乱，尤其是糖和脂肪代谢紊乱在2型糖尿病发病和进展中起着促进和恶化作用。随着糖尿病病程的延长，发生肝脏病变的危险性及其病变程度也随之增加。糖尿病性肝损伤是指糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化，是糖尿病的一种慢性并发症，持久性高血糖状态能导致肝功能衰退。而另一方面，肝功能异常可导致葡萄糖代谢紊乱，加剧糖尿病。
[0004]由于对糖尿病的病因和发病机制尚未充分明了，缺乏针对病因的治疗。目前强调早期治疗、长期治疗、综合治疗和治疗个体化的原则。国际糖尿病联盟(IDF)提出了糖尿病现代治疗的五个要点，分别是:饮食控制，运动疗法、血糖监测、药物治疗和糖尿病教育。由于2型糖尿病患者很少自发性发生酮症酸中毒等急性并发症，多数患者不需要胰岛素治疗维持生命，(除非在某些阶段，可能需要胰岛素控制代谢紊乱)，所以口服降糖药在2型糖尿病的药物治疗中占有相当大的比例。口服药物治疗方面目前应用比较多的降糖药物主要有四类:促胰岛素分泌剂(磺脲类和格列奈类)、双胍类、α-糖苷酶抑制剂类和胰岛素增敏剂类。这些药物以及胰岛素作用于全身各个代谢器官(α-糖苷酶抑制剂除外)，所以在纠正血糖的同时也会产生很多的副作用【2】，比如增加体重(双胍类除外)，其他副作用具体见下:
I)促进胰岛素分泌剂的不良反应主要是低血糖，吃药后会出现心慌、出汗、有饥饿感症状，严重者甚至会出现意识障碍，有时也会出现皮疹等过敏反应以及肝肾功能损害。
[0005]2)双胍类主要是胃肠道反应(患者服药后会有恶心、食欲不振的现象)以及乳酸酸中毒(服用降糖灵后，患者会出现乏力、意识障碍甚至昏迷的症状)，还有一部分病人会有肝肾功能损害和过敏性反应以及大细胞性贫血反应。
[0006]3) α -糖苷酶抑制剂是通过延缓葡萄糖的吸收从而达到降低血糖的目的，由于自身不吸收，对全身的副作用就相对小一些，其最主要的副作用是胃肠道反应，患者服药后会有腹胀、腹痛、腹泻和肠排气过多等现象。[0007]4)胰岛素增敏剂是通过激活PPAR-而起作用的，其最大的副作用是肝损害以及增加血容量，从而加重心脏负担。
[0008]由于糖尿病人需要终身服药，很多患者对长期服药的副作用比较担心，而这些副作用的控制也往往成为降糖治疗成败的关键因素之一。
[0009]肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a , TNF-α )是一个多功能细胞因子，它是细胞凋亡、炎症和免疫的主要调节因子。TNF-α信号失调与人类一系列疾病密切相关，包括败血症、糖尿病、癌症、骨质疏松以及动脉粥样硬化等【3】。因此，TNF-α也常被列为促糖尿病因子。胰岛素是体内唯一的降血糖的激素，胰岛素的生物学作用是通过胰岛素受体进行信号传导。TNF-α在致胰岛素抵抗和2型糖尿病中的作用机制一方面是直接作用于胰岛素信号转导系统，干扰胰岛素受体后信号转导而改变胰岛素的敏感性【4】;另一方面通过刺激其他细胞或组织产生代谢效益间接作用于胰岛素信号转导系统或者影响体内一些酶的活性而干扰糖代谢【5】。TNF-α是通过与靶细胞膜上两种不同的受体特异性结合发挥作用的。一类为肿瘤坏死因子受体I (TNFR1)，分子量为55KD (啮齿动物，p55)，60KD (人类，P60)。另一类为肿瘤坏死因子受体2 (TNFR2)，分子量为75KD (啮齿动物，p75)，80KD (人类，P80)。受体均是单一跨膜的糖基化蛋白，两种受体在不同的组织分布比例是不同的。到目前为止，认为TNFRl主要负责TNF-α的大部分生物学效应，如介导凋亡、分化、增殖等，而TNFR2主要负责信号传导，并且TNFR2可以激动转录因子NF- κ B,在特定的条件下可以调节细胞凋亡【6】。 [0010]RECSl (responsive to centrifugal force and shear stress gene I)是血液剪切力应答蛋白。Nojima实验室【7】最早报道血液剪应力诱导RECSl的转录表达，并克隆得到RECSl的cDNA和氨基酸序列。人RECSl是I个有311个氨基酸的7次跨膜蛋白，与Lifeguard和谷氨酸结合蛋白具有很高的同源性。有报道表明稳定表达RECSl的小鼠成纤维细胞对TNFR2特异的激动性抗体表现出一定的耐受性，显示RECSl可能参与TNF- α信号的调控【8】。近期的研究结果显示，RECSl结合TNFR1，并抑制过量表达TNFRl诱导的核转录因子-κΒ (NF-κΒ)活化【9】，从而负调控TNF-α信号。由此推测RECSl基因的表达很可能通过调节TNF-α信号,影响胰岛素的功能。
[0011]【参考文献】
1、S.Wild, G.Roglic, A.Green, R.Sicree, H.King, Diabetes Care 27,1047 (May,
2004).2、D.M.Nathan, N.Engl.J.Med.347,1342 (Oct, 2002).3> J.1.Barzilay, L.Abraham, S.R.Heckbert, Diabetes.50, 2384 (Oct, 2001)
4、G.S.Hotamisligil, D.L.Murray, L.N.Choy, Proc Natl Acad Sci USA 91, 4854 (May,1994).5、R.J.Grigsby, R.T.Dobrowsky, Biochem Biophys Res Commun 287, 1121 (Oct,2001).6、L.Tartaglia, P.Pennica, D.Goeddel, J Biol Chem 268, 18542 (Sep, 1993).7>H.Yoshisue, K.Suzuki, A.Kawabatal, Atherosclerosis 162,323(Jun, 2002).8、蔡慈峰，吴明江，廖志勇.中国生物化学与分子生物学报26，36(Jan, 2010)
9、廖志勇.中国生物化学与分子生物学报27，412(May, 2011)。
【发明内容】

[0012]鉴于上述现有降糖治疗技术中存在的问题，本发明的目的是确定RECSl的表达与脂肪肝、糖尿病之间的相互关系，提供一种RECSl作为药物靶标在筛选治疗脂肪肝、糖尿病的药物中的应用，提供一个用于治疗脂肪肝、糖尿病的靶基因RECSl的新用途。
[0013]本发明的目的通过下述的技术方案来实现:
本发明以野生型C57小鼠与RECSl基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity, DIO)模型，结果表明与野生型WT小鼠对比，RECSl基因敲除小鼠表现出肥胖，其体重明显高于同种饲料饲养的WT小鼠，并且RECSl基因敲除小鼠空腹血糖、空腹血清胰岛素水平均高于对照组WT小鼠，通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现RECSl基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从小鼠肝脏大体外观，肝脏重量及肝脏/体重比值和病理染色，肝脏组织脂质成分定量分析等均说明HFD组(Highfat diet,高脂饮食)的RECSl KO小鼠脂肪肝病变严重，脂质蓄积增加显著。这表明RECSl基因敲除会加剧脂肪肝、糖尿病的发生，RECSl具有维持糖代谢稳态和改善脂肪肝、糖尿病的功能。
[0014]针对RECSl的上述功能，RECSl可在制备预防、缓解和/治疗脂肪肝、糖尿病疾病的药物中的应用。
[0015]针对RECSl的上述功能，RECSl可在制备用于治疗糖尿病的药物方面应用。
[0016]一种治疗脂肪肝疾病的药物，包含RECS1。
[0017]一种治疗糖尿病的药物，包含RECSl。
[0018]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.本发明发现RECSl基因的新功能，即RECSl基因能够改善脂肪肝、糖尿病的作用。
[0019]2.RECSl在改善脂肪肝、糖尿病中的作用，制备用于治疗脂肪肝和糖尿病药物方面应用。
【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1是WT和RECSl-KO小鼠的体重、血糖、胰岛素结果图。
[0021]A为小鼠体重结果图；
B为空腹血糖水平统计图；
C图为血清空腹胰岛素水平统计图。
[0022]图2是WT和RECSl-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图。
[0023]A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图；
B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve, AUC)比较图。
[0024]图3是RECSl-KO和WT小鼠的肝脏大体外观结果图。
[0025]A为肝脏大体结果图；
B为肝脏重量、肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图。
[0026]图4是RECSl-KO和 WT小鼠的肝脏组织脂质成分及脂质代谢情况结果图。A图为HE和油红O染色图；
B图为甘油三酯，总胆固醇及游离脂肪酸的含量定量分析统计柱状图。【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0028]实验用动物及饲养:
实验动物:C57BL/6小鼠和RECSl KO小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司(WT，质量合格证号:949431) ；RECSI基因敲除小鼠(RECS1-K0，购自日本RIKEN 公司，货号:RBRC01772)。
[0029]实验动物饲料配方:高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942):热量 百分比:蛋白质:20%;碳水化合物:20%;脂肪:60%，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B):热量百分比:蛋白质:20%;碳水化合物:70%;脂肪:10%，总的热量质量比:3.85kcal/g。
[0030]动物饲养及环境条件:所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级动物房(许可证号=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2°C，湿度40%-70%，小鼠自由饮水进食。
[0031]【实施例1】小鼠脂肪肝、糖尿病模型(DIO)获得
1.实验动物分组:选用8周龄，雄性，WT小鼠和RECSl KO小鼠，分别给予两种特殊饲料D12942 高脂饲料(Highfat diet, HFD)和 D12450B 低脂饲料(Normal chow, NC)饲养，即 WTNC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。
[0032]2.高脂饲料诱导模型操作流程:
采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确RECSl基因对代谢性疾病发病发挥重要作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和RECSl KO小鼠，分别给予两种特殊饲料D12942 高脂饲料(Highfat diet, HFD)和 D12450B 低脂饲料(Normal chow, NC)饲养，即 WTNC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔4周检测I次。在实验O周和第24周，小鼠用乙醚吸入麻醉，经眶静脉采血，分离血清，检测血清中的胰岛素含量。实验第22周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第24周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醒溶液中固定或0.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue Freezing Medium)包埋作为病理分析用，另一部分放入液氮中，后置于_80°C冰箱保存。
[0033]【实施例2】脂肪肝、糖尿病模型(DIO)小鼠体重，血糖及胰岛素水平测定 1.小鼠空腹体重，食量检测，眶静脉窦采血。
[0034]I)体重检测
①禁食:上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。
[0035]②称重:分别在O周、4周、8周、12周、16周、20周、24周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测:待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。
[0036]2)乙醚吸入麻醉后眶静脉窦采血，分离血清。
[0037]①麻醉:将蘸取乙醚棉球放入麻醉缸中，同时迅速将小鼠放入，盖好盖子，乙醚吸入法全身麻醉。
[0038]②常规抓取小鼠，置于采血台上，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。
[0039]③右手持采血管，将尖端与小鼠面部成45 °的夹角，沿内眦插入内眼入滑眼球后方，向眼底方向刺入，当感到有阻力时即旋转轻采血管以切开静丛，血液即流入采血管。
[0040]④缓慢调整采血管的角度使之水平或稍向下倾斜，辅助者将0.5mLEP管置于采血管末端的下方收集血液，并在0.5mLEP管上标上耳标号。采血结束后，拔出采血管，放松左手，使用无菌纱布块轻轻压迫眼眶帮助止血。
[0041]⑤分离血清:收集血液的EP管于室温下静置l_2h使血液自然凝固。4°C，4000rpm/min，离心30min，充分分离血清。用微量移液器分别吸取血清置无菌EP管中，对EP管进行标记，随后保存于_80°C冰箱。
[0042]2.空腹血糖及血清胰岛素水平检测实验
将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。
[0043]I)测血糖
①血糖仪准备:检查血糖仪(美国强生公司，0NET0UCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。
[0044]②固定小鼠:右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。
[0045]③剪尾:眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。
[0046]④血糖检测:将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸,血糖仪倒计时5秒显示读数。
[0047]2) ELISA法检测小鼠胰岛素 ①试剂及耗材准备:
样品(冰冻血清)，去离子水一瓶(1000mL),小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Millipore，货号EZRM1-13K)含胰岛素ELISA酶标板(I块，储存于2_8°C )、酶标板封口膜(I片)、10 XHRP洗脱缓冲液(2瓶，每瓶50 mL,使用前使用去离子水稀释10倍)、胰岛素标准品(浓度为:
0.2,0.5,1,2,5, IOng/ mL,每种量为0.25mL)、胰岛素质量对照buffer (0.25 mL)、基质溶液(0.5 mL )、分析缓冲液(20 mL )、胰岛素检测抗体(IO mL )、酶溶液(12 mL )、底物(12 mL )、终止溶液(12mL)。
[0048]②实验步骤:
A.确认温箱开启，熟悉酶标仪操作，将待检测的血清标本从一80°C冰箱中找出；
B.将待检测的血清在室温下复融至液态，准备检测；
C.稀释10XHRP洗脱缓冲液，每瓶用450mL去离子水稀释；
D.将取下来的酶标板条 安装到一个空的酶标板架上300μ LTBS洗脱缓冲液洗涤3次。洗涤完毕将酶标板倒扣在吸水纸上，轻轻拍几次，将残液吸净(注意:在进行下一步之前避免酶标板干燥，将未使用的酶标板条密封在装酶标板的袋子里，2-8°C保存)；
E.将10μ L分析缓冲液加入非特异性孔(NSB)和所有的样品孔；
F.在NSB孔，标准孔和对照孔加入IOyL基质溶液；
G.在预设的标准孔里加入10μ L胰岛素标准品；H.在预设的质量对照孔里加入胰岛素质量对照bufferl和2各10μ L ;
1.在每个样品孔里加入10μ L样品；
J.每孔中加入80 μ L胰岛素检测抗体(以上所有加样步骤在I个小时之内完成，室温孵育2小时，在此期间将酶标板至于酶标板振荡器上，调整转速为400-500rpm震荡)；
K.取下封口膜，弃去液体，在吸水纸上轻轻拍打，吸净残液；
L.使用洗脱缓冲液洗板3次，每次300 μ L，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液；
Μ.每孔加入酶溶液IOOy L，封口膜封口后，室温下酶标板振荡器震荡30分钟，取下封口膜，弃去溶液，拍打吸干；
N.使用洗脱缓冲液洗板6次，每次300 μ L，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液加入100 μ L底物溶液，酶标板震荡器上震荡15分钟左右。此时可以看到标准孔出现深浅渐变的蓝色。(注意:在这一步，蓝色的出现和进展可能明显快于15分钟，也可能明显慢于15分钟，取决于室温温度。请通过视觉来判断孵育的时间。或者使用酶标仪370nm波长检测，读数在1.2到1.8之间，则为合适的孵育时间)
0.加入100 μ L终止溶液，震荡酶标板确保充分的混匀，此时蓝色变为黄色。5分钟内在450nm和590nm处分别读 取吸光值。根据测定的标准曲线，通过吸光值换算出浓度。
[0049]糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖及胰岛素水平，这些指标均与糖尿病严重程度正相关。体重、血糖及胰岛素变化结果如图1所示，我们发现WT小鼠在给与HFD饲料饲养后的体重明显高于NC饲料组，给予RECSl KO小鼠24周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第4周开始HFD组的RECSl KO小鼠体重明显高于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第24周(见图1A)，表明RECSl在在高脂饮食诱导引起的糖尿病中可能起到重要作用。
[0050]经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从4周开始，空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，且HFD组的RECSl KO小鼠空腹血糖水平比HFD组的WT小鼠空腹血糖水平更高(见图1B)。经检测各组小鼠的血清空腹胰岛素水平比较，HFD组的WT小鼠和RECSl KO小鼠在24周均比O周时显著升高，RECSl KO组明显要高于WT小鼠(见图1C)。这表明敲除RECSl基因后就显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，并产生了显著的胰岛素抵抗。说明RECSl基因能显著改善小鼠的糖代谢稳态，有利于胰岛素功能的发挥。
[0051]【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 实验第22周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。
[0052]①在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μ L/g计算葡萄糖的注射体积。
[0053]②先检测葡糖糖注射前即O分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。
[0054]③腹腔注射操作方法:(I)固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。(2)进针定位及注射:从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
[0055]④分别于腹腔注射后15分,30分,60分，120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值,并记录血糖数值和检测时间。[0056]我们又进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucosetolerancetests, IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的耐受能力，在实验第22周,通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和RECSl KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(O分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且RECSl KO小鼠血糖水平从O分钟至2小时一直处于高于WT小鼠的血糖水平(图2A)。各组小鼠血糖曲线下面积(areaunder the curve, AUC)比较，我们发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，RECSl KO HFD组的AUC显著大于WT HFD组的AUC(图2B)，表明RECSl对维持糖代谢稳态具有强大的调控能力。
[0057]【实施例4】肝脏大体外观，肝脏组织脂质成分及脂质代谢情况测定
1.终末肝脏组织取材
①小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。
[0058]②用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。
[0059]③迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。
[0060]④石蜡标本:置于10%中性福尔马林中固定。冰冻标本:切取部分肝脏，置于有OCT的锡纸模具中包埋，放在 干冰上冰冻固定。
[0061]2.肝脏组织处理及病理染色相关实验 I)肝脏脱水，透明，浸蜡
切取10%中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水:75%酒精(45分钟)一75%酒精(45分钟)一85%酒精(45分钟)一85%酒精(45分钟)一95%酒精(45分钟)一95%酒精(45分钟)一无水酒精(I小时)一无水酒精(I小时)；②透明:二甲苯(I小时)一二甲苯(I小时)；③浸腊(65°C ):石蜡(I小时)一石蜡(I小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。
[0062]2)肝脏组织切片
本实验室切片机切片(切片厚度5um)
3)肝脏组织苏木精-伊红(HE)染色
将肝脏组织石蜡切片放入65°C烘箱(30分钟)一二甲苯中(5分钟X3次)一100%酒精(I分钟)一90%酒精(I分钟)一70%酒精(I分钟)一蒸馏水洗一苏木素(5分钟)一自来水洗去切片上的浮色一1%盐酸酒精(I至3秒)一自来水洗数下一Scott促蓝液(碳酸氢钠
0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL) (I分钟)一自来水洗数下一伊红(I分钟)一蒸馏水洗去切片上的浮色一70%酒精一下一90%酒精一下一100%酒精(30秒X3次)一二甲苯(2分钟X 3次)一在二甲苯未干时封片，拍照。
[0063]4)肝脏组织油红O染色
①将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30分钟，4%多聚甲醛固定10分钟。置于双蒸水中稍洗10分钟，以除去组织表明的多聚甲醛。[0064]②以60%异丙醇处理I分钟。
[0065]③用油红O (公司sigma，货号00625，浓度0.5克/100mL 100%异丙醇)染色30分钟。
[0066]④之后以60%异丙醇漂洗I分钟X 3次，直至背景干净。
[0067]⑤用Mayer’ s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。
[0068]⑥水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。
[0069]⑦用甘油明胶封片，拍照。
[0070]3.小鼠肝组织脂质检测
①从-80°C冰箱取出肝脏组织样品，称量50mg组织，使用研磨器将肝脏组织研磨成粉末状，溶于ImLPBS中，混匀后再与ImL氯仿/甲醇(2:1)共孵育过夜。
[0071]②以12000g高速离心15min后，收集管底脂质层物质，风干，以去除水分。
[0072]③将分离出的脂质层物质溶于200 μ L含1% Triton X-100的PBS溶液中，仔细吹吸混匀。
[0073]④开启电脑Iabman软件，打印机，再开启生化分析仪；
⑤选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；
⑥在Iabman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等。
[0074]⑦将制得的混匀液上机检测，分析。
[0075]肝脏大体外观，肝脏组织脂质成分及脂质代谢测定结果见图3所示，通过大体取材拍照，我们观察到在HFD组的RECSl KO小鼠的肝脏体积稍较HFD组的WT小鼠的肝脏大，且前者肝脏色泽泛黄，油脂较多(如图3A)。在HFD组的RECSl KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠高，说明RECSl KO小鼠脂肪肝明显(如图3B)。我们进一步通过组织切片，进行HE和油红O染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织的病理改变。通过肝脏HE染色，我们可以观察到在HFD饲养条件下，WT小鼠和RECSl KO小鼠肝脏组织均有较多的脂肪沉积，可以看到肝细胞发生脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态已几乎完全破坏，尤其在RECSl KO小鼠显著，而在NC组小鼠均肝细胞形态较为完整(如图4A上)。通过肝脏油红O染色来检测肝组织中脂质，我们可以发现在HFD组的RECSl KO小鼠的肝门静脉周围呈大片红色，提示有大量的脂质沉积，而在HFD组的WT小鼠的肝门静脉周围则有较少脂质沉积，在NC饲料饲养的两组小鼠脂质沉积最少(如图4A下)。
[0076]我们又检测了 WT和RECSl KO小鼠高脂饮食后的肝脏组织中的甘油三酯(triglyceride, TG),总胆固醇(total cholesterol, TC)及游离脂肪酸(non-esterlfiedfatty acid, NEFA)的含量。定量分析结果发现RECSl KO小鼠在HFD条件下肝脏组织TG，TC和NEFA的总量远大于其对照WT组，这表明RECSl基因敲除小鼠清除脂质和抗脂肪肝形成的能力明显下降(如图4B)。
[0077] 在本部分研究中，我们观察到了 RECSl KO小鼠在HFD的诱导下发生糖代谢紊乱，胰岛素抵抗，糖耐量明显下降，RECSl基因敲除的小鼠脂肪肝病变严重，脂质蓄积增加显著。这些结果表明，RECSl对维持糖代谢稳态具有强大的调控能力，有强大的肝脏脂质清除和抗脂肪肝形成的能力。这表明RECSl基因在脂肪肝、糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。
[0078]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效 的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.离心力和剪应力应答基因IRECSl在制备预防、缓解和/治疗脂肪肝糖尿病疾病的药物中的应用。
2.一种治疗脂肪肝疾病的药物，其特征在于:包含RECS1。
3.一种治疗糖 尿病的药物，其特征在于:包含RECS1。
【文档编号】A61P3/10GK104001188SQ201410260281
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】李红良, 赵光年, 汪涛, 杜成 申请人:武汉大学