蜜蜂幼虫在核酸制备中的应用的制作方法

专利名称：蜜蜂幼虫在核酸制备中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蜜蜂幼虫的用途，尤其是涉及蜜蜂幼虫在核酸制备中的应用。
蜜蜂幼虫及蛹作为食品及药品的历史悠久。祖国传统医学对蜂王幼虫的药用价值，早就有过不少研究。据《神农本草经》载“蜂王幼虫能去头疯，除虫毒，补虚赢伤中，久服令人光泽，女子颜色不老。”五十年代以来，国内外学者对蜜蜂幼虫和蛹(我国学者主要是对蜂王幼虫和雄蜂蛹)的营养成份进行了大量分析测定工作，一致认为蜜蜂幼虫和蛹是一类低脂肪、高蛋白、营养成份较为齐全的天然食品。
美国学者Hank将蜜蜂幼虫和蛹与家庭中常用的几种食物——牛肉、牛奶、鸡蛋和鱼肝油的营养成份进行了比较研究，结果显示蜜蜂幼虫、蛹的蛋白质含量略低于牛肉，高于牛奶，与鸡蛋的含量相近；脂肪的含量与牛肉、牛奶相接近而大大低于鸡蛋中的含量；维生素A的含量低于鱼肝油，但都远远超过其它三种食品中的含量。用含蜂王幼虫的饲料喂养刚断奶的Wistar大白鼠幼鼠，剂量为1.2g/kg和1.8g/kg，食用剂量为1.2g/kg组的幼鼠在第14天，食用剂量为1.8g/kg组的幼鼠在第14天、21天和28天时，其体重显著地高于对照组，其差异的显著性分别为p＜0.01,p＜0.05,p＜0.01和p＜0.05。且幼鼠的生长速度与食服蜂王幼虫的量呈正相关性。近两年，我国学者对工蜂幼虫、蛹的营养价值进行了研究，结果表明，蜂幼虫、蛹的主要营养成份与蜂王幼虫、雄蜂幼虫和蛹比较接近。其含水量81.69-13.48％，干物质含量18.31-26.52％，干物质中含蛋白蛋42.36-48.47％、脂肪15.75-20.63％，灰分9.99-18.74％。同时，富含多种氨基酸，干物质中17种氨基酸的含量达26.35-44.72％，尤以谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和亮氨酸的含量最为丰富。此外，通过对9日龄幼虫和19日龄蛹的维生素和10种重要矿物质元素含量的测定发现，工蜂幼虫、蛹含有非常丰富的维生素和矿物质，尤其是Vc和Vd的含量特别多。从营养成份的组成来看，工蜂幼虫和肾具有很高的营养价值。
目前，对蜜蜂幼虫和蛹的开发利用工作还处于起步阶段，其主要应用情况如下1．在蜜蜂幼虫、蛹的生产季节，直接食用。即用油煎、盐炒蜜蜂幼虫和蛹，也有同其它食品混合烹制或做汤食用。
2．制做成蜜蜂幼虫和蛹的罐头食品。将新鲜的材料或用密(或糖)渍，或用盐渍保存后，加工成甜味或咸味的各种罐头食品，能保存较长时间。
3．制做成保健营养酒。在我国民间有使用蜜蜂幼虫、蛹配制药酒的传统配方和制作工艺，这种营养酒具有祛风湿、抗疲劳的作用。
4．与其它食品原料混合配制成各种营养食品。国外许多企业都在饼干、点心等食品的配方中加入了蜜蜂幼虫、蛹；近10年来，我国安徽、广东、湖北、湖南及北京的一些企业和研究单位开发了多种以蜜蜂幼虫和雄蜂蛹为原料的营养液、营养胶囊和冲剂。
5．加工成冰冻干粉或烤干粉后再与其它原料配伍制成营养食品或药品。七十年代初杭州牛奶公司制药厂开发的“蜂皇胎片”(原名蜂皇幼浆片)，可用作治疗肝炎、风湿性关节炎、神经衰弱、营养不良等疾患的辅助治疗药物。
6．配制动物饲料。我国很多地方试用蜜蜂幼虫、蛹的干粉作饲料添加剂喂养鸡、鸭、鱼、奶牛等禽畜和某些珍稀动物，取得了可喜的成效。
可见，当前对蜜蜂幼虫和蛹仅限于其中蛋白质含量、活性酶、微量元素和维生素等营养成份的研究，开发和利用的产品形式仍停止在原料的粗加工阶段。
近年来，随着营养学研究向分子水平推出，核酸被认为是继蛋白质、脂肪、糖类之后人类认识和利用的一种新的有机营养素。由于生命的一些最根本的现象如生长、遗传、变异等都与核酸有密切关系。因此，核酸被认为是创造生命、保护生命、延长生命的根本物质，对人体健康长寿有限重要作用，现代营养学把核酸称作“生命之源”，核酸营养则被认为是当代营养保健的最高层次。补充核酸，调节人体营养平衡，具有保健益智、延缓衰老、增强人体免疫的作用，特别是对心脑血管疾病、糖尿病等疾病的预防、治疗有显著作用。
目前，从组织或细胞中提取核酸都采用生物学研究的经典方法，但这些方法存在周期长，提取成本高等缺点，因而仅限于实验室小量、高纯度的提取，不适用于大量、高纯度核酸制剂的制备。为获取充足的核酸营养，人们相继发明了作为营养补给的核酸的制备方法，如在1996年3月6日发明专利公报上公开的一种从天然植物细胞中提取核酸的生产工艺(申请号94115437.8)，它以大豆粕为原料，但以植物细胞为原料制取的核酸含量较低，纯化、提纯的成本较高。1994年10月19日发明专利公报上公开了一种人体胎盘为原料，在-10℃—-70℃迅速冷冻，并在低温下破碎胎盘组织，采用透析方法提取高浓度核酸，但随着计划生育工作的展开，其原料来源日益减少，而且制备条件比较苛刻，周期长、成本高，不适于工业化生产。在此基础上，有人发明了“从鸡血中提取核酸及核蛋白的方法”(专利号97115706)，虽然鸡血原料来源较广泛，但影响鸡血质量的因素众多，核酸质量难以控制，而且制备工艺复杂，生产周期较长。对核酸的深入研究表明，人体对核酸的吸收和利用处于寡聚核苷酸、核苷酸水平。而现有技术都未提供寡聚核苷酸、核苷酸的制备方法。
本发明的目的是提供蜂幼虫、蛹的新用途，特别是在制备核酸、寡聚核苷酸和核苷酸中的应用。
本发明的另一目的是提供从蜂幼虫、蛹中提取核酸、寡聚核苷酸、核苷酸的制备工艺和方法。
本发明对蜂幼虫、蛹的核酸含量进行了检测，发现蜂幼虫、蛹的核酸平均含量为4941mg/100g，远大于鱿鱼280mg/100g、牛肉100mg/100g，鸡肝420mg/100g和红豆306mg/100g，是一般动植物组织细胞核酸含量的5-15倍。随后，本发明采用核酸一般粗提工艺进行了实验，检测提取物中核酸含量为72690-86936mg/100g。这提示蜂幼虫、蛹有可能成为核酸生产的重要物质来源，使蜂幼虫、蛹用于提取核酸、寡聚核苷酸和核苷酸成为可能，并具有更大的优势。
本发明所述的蜜蜂幼虫、蛹包括蜂王幼虫、雄蜂幼虫及蛹、工蜂幼虫及蛹。其中，蜂王幼虫、雄蜂幼虫和工蜂幼虫在68-72小时采集，雄蜂蛹在22-22天采集，工蜂蛹在16-18天采集。
从蜜蜂幼虫、蛹中提取核酸的方法，包括将蜜蜂幼虫(干粉或新鲜虫体)或蛹通过匀浆、细胞裂解、有机溶剂抽提、核酸沉淀与离心分离、核酸干品制备。
1)匀浆、细胞裂解取新鲜蜜蜂幼虫、蛹或蜜蜂幼虫干粉，在-4℃—0℃条件下，加入蜜蜂幼虫体积的5-10倍的提取液A(Tris-HCL PH6.4∶EDTA PH8.0=5∶1(mol/l))，匀浆，过滤；或取冷冻蜜蜂幼虫、蛹，在真空、室温条件下解冻，解冻后立即加入提取液A匀浆，过滤。
2)核酸溶液的抽提可采用下述方法之一。
a去垢剂法用阴离子去垢剂如十二烷基磺酸钠、磺酸十二烷基锂、磺酸十二烷肌氨酸钠、脱氧胆酸钠等，最好是用20％十二烷基磺酸钠，加入量为滤液体积的1/100，并用10％-20％的氢氧化钠调PH至9.0，处理约40分钟，在0℃-4℃,6000-8000rpm离心20分钟，过滤，取上清得到核酸溶液；b苯酚法向滤液中加入等体积的水饱和新蒸馏苯酚，混匀，震荡，6000-8000rpm冷冻离心，取上清，得到核酸溶液；3)核酸沉淀、离心分离及核酸纯化干品的制备向上清液中加入2.5倍体积的2％乙酸钠的无水乙醇或乙醚即得核酸沉淀，将沉淀干燥即得核酸干品。
从蜜蜂幼虫、蛹中提取核酸的另一种方法，包括将蜜蜂幼虫(干粉或新鲜虫体)或蛹通过匀浆、细胞裂解、沉淀核蛋白与蛋白质、有机溶剂抽提、离心分离、核酸干品制备。
1)匀浆、细胞裂解向原料中加入其体积5-10倍的蒸馏水，放入匀浆器中直接匀浆，过滤；2)沉淀核蛋白和蛋白质直接向滤液中加入预冷无水乙醇，混匀，以3000rpm离心10分钟，弃上清，重复操作一次。
3)核酸溶液的抽提。
向沉淀物中加入氯仿-甲醇(2∶1v/v)，混匀，以3000rpm离心10分钟，取上清，重复操作一次，即得核酸溶液。
4)沉淀核酸、离心分离、制备核酸干品。方法同上。
上述方法制得的核酸粗提物，可进一步提纯。提纯后的核酸可根据需要作为化妆品等产品的原料，或再进一步降解成寡聚核苷酸或核苷酸。
本发明的特点1．取材新颖开辟了蜂幼虫、蛹的新的利用途径，当前，对蜂幼虫、蛹的研究与开发仅限于蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素等营养成分的研究。而本发明的研究表明，在蜜蜂幼虫、蛹中，核酸含量明显高于现有所有动植物组织细胞中的核酸含量。这意味着从蜜蜂幼虫中提取核酸将有资源优势。国内外利用蜜蜂幼虫提取核酸尚属首次。
2、原料来源丰富，不受限制。我国是世界上最大的养蜂大国，养蜂资源丰富，现有蜂群约600群，按每年群产幼虫、蛹2千克计算，全国的年生产能力可达1.2万吨。
3、原料质量利于控制、稳定。将蜜蜂幼虫加工成幼虫干粉，工艺成熟、简单、成本低。而且加工制得的干粉在室温下，保质期为半年。
4、粗提物中核酸含量高达86.93％(质量比)，可直接满足核酸营养制剂的需要。在此基础上进一步纯化制成含量大于98％的高纯度的核酸，耗时短，成本低。
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案用进一步的说明
定磷法测定核酸含量1．样品消化取5mg核酸干品，置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成蛋黄色，取下稍冷，加10滴30％过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色，稍冷却，加1ml水，于100℃加热10分钟。冷至室温，用蒸馏水定容到50ml.。
2．制作磷标准曲线取标准磷溶液(5ug/ml)0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml，用水补足到3ml，含磷量分别为0,2.5,5,7.5,10,12.5,15ug，加定磷试剂3ml后摇匀，45℃置放20分钟，于660nm处测取OD值，并以含磷量为横坐标，OD660为纵坐标制作标准曲线。
3．核酸中总磷量的测定取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml，摇匀，45℃放置20分钟，于660nm处读取OD值。空白对照同样操作。
4．样品中无机磷含量的测定取未消化的样品液1ml用水定容到50ml.从中取1ml，加2ml水，3ml定磷试剂，摇匀后保温，然后读取OD660。
5．经换算，样品中核酸含量为86.93％。
实施例2取蜜蜂幼虫干粉，在-4℃—0℃条件下，加入蜜蜂幼虫体积的8倍的提取液A，匀浆，过滤。用去垢剂法提取得到核酸溶液，向核酸溶液中加入2.5倍体积的2％乙酸钠的无水乙醇或乙醚即得核酸沉淀，将沉淀干燥即得核酸干品。
权利要求
1.一种蜜蜂幼虫、蛹的新用途，即蜜蜂幼虫、蛹用于提取核酸。
2.一种从蜜蜂幼虫、蛹中提取核酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)匀浆、细胞裂解取新鲜蜜蜂幼虫、蛹或蜜蜂幼虫干粉，在-4℃—0℃条件下，加入蜜蜂幼虫体积的5-10倍的提取液A，匀浆，过滤；或取冷冻蜜蜂幼虫、蛹，在真空、室温条件下解冻，解冻后立即加入提取液A匀浆，过滤；2)用去垢剂法或苯酚法提取，得到核酸溶液；3)向核酸溶液中加入2.5倍体积的2％乙酸钠的无水乙醇即得核酸沉淀，将沉淀干燥即得核酸干品。
3.一种从蜜蜂幼虫、蛹中提取核酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)匀浆、细胞裂解，2)直接向滤液中加入预冷无水乙醇，混匀，以3000rpm离心10分钟，弃上清，重复操作一次，3)向沉淀物中加入氯仿-甲醇，混匀，以3000rpm离心10分钟，取上清，重复操作一次，得到核酸溶液。4)沉淀核酸、离心分离、制备核酸干品。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的蜜蜂幼虫、蛹包括蜂王幼虫、雄峰幼虫及蛹、工蜂幼虫及蛹。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于蜂王幼虫、雄峰幼虫、工蜂幼虫取68-72小时的幼虫。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于雄峰蛹取20-22天的蛹。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于工蜂蛹取16-18天的蛹。
全文摘要
本发明公开了一种蜜蜂幼虫、蛹的新用途,即用于提取核酸,以及从蜜蜂幼虫、蛹中提取核酸的方法。本发明的技术方案开辟了蜜蜂幼虫、蛹的新的利用途径,其原料来源丰富,不受限制,原料质量利于控制、稳定,方法简单、成本低。其粗提物中核酸含量高达86.93%(质量比),可直接满足核酸营养制剂的需要。可在此基础上进一步纯化制成含量大于98%的高纯度的核酸。因此,本发明具有重要应用价值。
文档编号C07H1/08GK1306004SQ0012814
公开日2001年8月1日 申请日期2000年12月25日 优先权日2000年12月25日
发明者陈明胜, 金建忠, 田育红, 潘爱平 申请人:武汉市康源蜂业有限公司