专利名称：获得脱水河豚毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得脱水河豚毒素(Anhydro-tetrodotoxin，简称Anh-TTX)的新方法，可以用提取河豚毒素的残留溶液经过高效液相方法(HPLC)分离，再用化学方法除去杂质，即可获得脱水河豚毒素，纯度可达97％以上。
生物体内Anh-TTX的含量极微，直接提取难度大，过程复杂。而采用本发明的方法，在生产高纯度河豚毒素(Tetrodotoxin，简称TTX)的同时(制取高纯度TTX的方法请见中国专利申请00132673.2)，其杂质馏份的收集液即可作为生产Anh-TTX的原料，而且步骤很少、操作简便、收率高，做到废物利用、化废为宝，是大量获得Anh-TTX的极佳方法。
脱水河豚毒素是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，是河豚毒素的衍生物。Anh-TTX是生物细胞Na+通道阻断剂，其毒力比TTX小得多，其生物作用是快速可逆地阻断Na+通道，所以可以广泛用于神经生物学、生理学、医学及其它科学研究。其分子式和结构式如下分子式C11H15O7N5分子量301.27结构式 脱水河豚毒素在一般情况下和河豚毒素存在于同一生物体中。根据的中国发明专利申请公开说明书CN 1206009A，Anh-TTX主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏、皮肤和肠胃中，在其它的某些海洋生物和陆生生物体内甚至某些细菌中也有发现。
Anh-TTX在生物体内含量极小，约百万分之一至千万分之一，要获得纯品Anh-TTX较困难。根据文献报道，Munetomo Nakamura等人于1984年将1.5kg河豚肝用3.9升0.1％HAc加热浸取，浸取液分别通过活性炭柱和Bio-Gel P-2柱分离，用0.05N HAc洗脱，除去洗脱液的溶剂，残留物通过一根Bio-Rex 70柱用醋酸液进行梯度洗脱，然后换成高效Hitachi-gel柱梯度洗脱，最后经过TSK-gel柱用HPLC分离，再通过浓缩、沉淀、干燥等步骤，得到13.4mg的Anh-TTX。
Takeshi Yasumoto等人于1987年用同样的分离步骤从3.5kg蝾螈获得20mg的Anh-TTX。这两种获得Anh-TTX的方法都十分复杂，而且得率低。根据发明说明书(公开号CN1206009A)，黄致强等人从纯化河豚毒素的母液，经高压液相色谱分离，再经离子交换树脂、生物凝胶脱盐，回收得到脱水河豚毒素结晶。根据这一发明，从2g粗品TTX中可获得60mg纯度在97％以上的Anh-TTX。而本发明的方法以提纯TTX时所残留的溶液为原料，采用高效液相方法，以庚烷磺酸钠溶液为流动相及ODS柱分离，再经温热下减压浓缩，然后用浓氨水调节为碱性，低温下放置沉淀，然后水洗，真空干燥，即可得到脱水河豚毒素结晶，纯度达到97％以上。本发明的方法跟前述文献相比，不需要经过离子交换柱和生物凝胶脱盐，步骤较少，简便易行，而且Anh-TTX的得率也相应有较大的提高，从1g粗品TTX可获得65mg的Anh-TTX。而且，我们所获得的样品经由中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所和国家药物及代谢产物分析研究中心进行结构验证，采用当前最先进的新型科学测试仪器(FT-IR，HRMS和AM-500超导NMR)对其进行了较周密的测试考察，经过较详尽的全面解析及分析，确认该样品为真正脱水河豚毒素结构。
因此，本发明的目的是提供一种获得脱水河豚毒素的方法，其由以下步骤组成a.用高效液相法收集含脱水河豚毒素的流出液，b.浓缩脱水河豚毒素收集液，优选于40-60℃减压下进行，c.调节浓缩液pH值为碱性，优选使用氨水或其它碱性溶液调节pH值，并调节pH为9-11，d.放置沉淀，其中放置温度为0-25℃，优选是2-8℃，e.洗涤沉淀，优选使用去离子水洗涤沉淀，以及f.真空干燥、结晶脱水河豚毒素。
以下将参考附图对本发明进行详细的说明，在附图中
图1是根据本发明的方法的流程图2是脱水河豚毒素的HPLC图；图3是脱水河豚毒素的1H-NMR图；图4是脱水河豚毒素的1H-NMR图；图5是脱水河豚毒素的1H-NMR图；图6是脱水河豚毒素的1H-1H Cosy图；图7是脱水河豚毒素的13C-NMR图；图8是脱水河豚毒素的HRMS图；图9是脱水河豚毒素的IR图；以及图10是脱水河豚毒素的HPLC图(实施例3)。
根据本发明的方法，首先用HPLC提纯TTX时收集杂质馏份将100-1000mg粗品TTX加稀醋酸溶解，用制备型HPLC系统分离，收集TTX馏份，同时收集含Anh-TTX的馏份。
浓缩含Anh-TTX馏份收集液将得到的馏份收集液于40-60℃下减压浓缩。
用化学方法处理浓缩液用氨水或碱溶液调节浓缩液的pH值为9-11，于2-40℃下放置一段时间，使其中的杂质发生化学反应，分解或转变为Anh-TTX，并使Anh-TTX沉淀出来。
获得Anh-TTX将所得的Anh-TTX沉淀用去离子水洗涤3次，然后真空干燥即可得到高纯度Anh-TTX结晶。
现根据实施例更为详细地描述本发明，但应认识到这些实施例仅是用于说明本发明，而绝非对本发明范围的限制。
实施例
2)HPLC条件a.制备柱ODS(5um)，250×10mmb.流动相0.01M庚烷磺酸钠溶液，流速5ml/minc.定量进样200微升/次d.紫外检测器检测波长201nm3)分别收集TTX和杂质的馏份a.收集TTX馏份的保留时间为20.5～27.0minb.收集杂质馏份的保留时间为36.5～41.0minc.杂质馏份的收集液为250ml2、浓缩杂质馏份收集液使用旋转蒸发器在45℃下减压到0.005MPa浓缩杂质收集液，得到浓缩液15ml。
3、用化学方法处理浓缩液将浓缩液用5％氨水调pH9～10，然后在4℃下放置2天，得到沉淀物。
4、获得Anh-TTX将得到的沉淀物用去离子水洗涤3次，真空干燥，得Anh-TTX 10mg。实施例21、用HPLC提纯TTX时收集杂质馏份1)取粗品430mg，用4ml 8％HAc溶解，过滤，滤液用HPLC分离。
2)HPLC条件a.制备柱ODS(5um)，300×19mmb.流动相0.01M庚烷磺酸钠溶液，速流10ml/minc.定量进样200微升/次d.紫外检测器检测波长201nm3)分别收集TTX和杂质的馏份a.收集TTX馏份的保留时间为20～28minb.收集杂质馏份的保留时间为34～39minc.杂质馏份收集液为1000ml2、浓缩杂质馏份收集液使用旋转蒸发器在50℃下减压到0.005MPa浓缩杂质馏份收集液，得到浓缩液40ml。
3、用化学方法处理浓缩液将浓缩液用5％氨水调节pH为9-10，在室温下放置1天，然后在4℃下放置2天，得到沉淀物。
4、获得Anh-TTX将所得沉淀物用去离子水洗涤3次，真空干燥得Anh-TTX 30mg，纯度为97.5％，并取部分样品送到中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所、国家药物及代谢产物分析研究中心进行结构验证。(见附图2～9)
2)HPLC条件a.制备柱ODS(5um)，300×19mmb.流动相0.01M庚烷磺酸钠溶液，流速10ml/minc.定量进样200微升/次d.紫外检测器检测波长201nm3)分别收集TTX和杂质的馏份a.收集TTX馏份的保留时间为20～28minb.收集杂质馏份的保留时间为34～39minc.杂质馏份收集液为2000ml2、浓缩杂质馏份收集液使用旋转蒸发器在50℃下减压到0.005MPa浓缩杂质收集液，得到浓缩液60ml。
3、用化学方法处理浓缩液将浓缩液用1M NaOH调节pH为9-10，室温放置1天，然后于4℃下放置3天，得到沉淀物。
4、获得Anh-TTX将得到的沉淀物用25ml 0.5％HAc溶解，用10％氨水调节溶液pH为9-10，得到Anh-TTX沉淀用去离子水洗涤3次，真空干燥，得到Anh-TTX 65mg，纯度为98.3％。(见附图10)参考文献[1]Munetomo Nakamura and Takeshi Yasumoto(1985)Tetrodotoxinderivatives in puffer fish，Toxicon 23，271-276.[2]Takeshi Yasumoto、Mari Yotsu and Michio Murata(1988)New TetrodotoxinAnalogues from the Newt cynops ensicauda，J.Am.Chem.Soc.110，2344-2345.[3]黄致强、王宝君和黄海枫(1999)，脱水河豚毒素的提取方法，公开号CN1206009A.
权利要求
1.一种获得脱水河豚毒素的方法，其由以下步骤组成a.用高效液相法收集含脱水河豚毒素的流出液，b.浓缩脱水河豚毒素收集液，c.调节浓缩液pH值为碱性，d.放置沉淀，e.洗涤沉淀，以及f.真空干燥、结晶脱水河豚毒素。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中浓缩是于40-60℃减压下进行。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中是使用氨水或其它碱性溶液调节pH值。
4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中pH值调节到9-11。
5.如权利要求1所述的方法，步骤(d)中沉淀是在温度0-25℃下进行，首选是2-8℃。
6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)中可使用去离子水洗涤沉淀。
全文摘要
本发明提供一种获得脱水河豚毒素的新方法,其包括以下步骤:用高效液相法收集含脱水河豚毒素的流出液,浓缩脱水河豚毒素收集液,调节浓缩液pH值为碱性,放置沉淀,洗涤沉淀,以及真空干燥、结晶脱水河豚毒素。所用原料为提取河豚毒素后的残留溶液,纯度达到97%以上。
文档编号C07D491/22GK1361107SQ0013669
公开日2002年7月31日 申请日期2000年12月29日 优先权日2000年12月29日
发明者卢英柱, 罗燕 申请人:南宁枫叶药业有限公司