心衰治疗剂的制作方法

专利名称：心衰治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及心力衰竭的预防剂或治疗剂，筛选适于作为预防剂或治疗剂的活性成分的物质的方法，心力衰竭的诊断剂或诊断试剂盒以及非人转基因动物等。
背景技术：
慢性心力衰竭是心脏由于心肌收缩性下降而不能维持充足的心输出量至各器官的一种疾病，其传统疗法包括使用增加心肌收缩性的心脏刺激剂，如洋地黄和黄嘌呤药物。然而，这些药物由于在长期施用期间增加心肌能量消耗而显示出对生存预后产生不利影响。近来，用β-阻滞剂或ACE抑制剂进行的治疗盛行，其在心衰患者中降低由过度激活交感神经系统或肾素-血管紧张素系统而引起的对心脏的超负荷。但是，心衰患者的长期生存预后仍不良，期望开发一种基于新机制而治疗心衰的药物。
因此，本发明旨在提供一种心衰或类似情况的预防剂或治疗剂，其机制与现有的不同。更具体地说，本发明旨在提供一种通过抑制由OSF-2基因或蛋白导致的心脏疾病恶化而预防或治疗心衰的药物，筛选适于作为所述药物的活性成分的物质的方法，包括监测OSF-2基因的表达或变异或者OSF-2蛋白的产生的有用的心衰诊断方法，和用于诊断心衰的诊断剂或诊断试剂盒，以及能强制表达OSF-2基因的非人转基因动物。

发明内容
假设各种基因或蛋白在心脏中的表达随着心衰病变的进展而变化，并且这些变化与心衰病变紧密相关，我们使用适宜的心衰模型搜寻其表达水平随着心衰病变进展而变化的基因。结果我们发现，已知在成骨细胞中特异性表达的OSF-2基因的表达随着心衰的进展而增加。进一步的研究揭示所述基因或蛋白影响心衰的恶化，从而引导我们完成了本发明，其基础是任何抑制其表达或功能的药物应该成为心衰的新治疗剂。
在开发心衰治疗剂的过程中，使用了多种病理学模型，特别是在最初的筛选中，经常使用大鼠模型，因为该模型便于制备或易于分析。换句话说，大鼠模型被接受作为反映人类病理学的模型，尽管它们各有局限。
已知的心衰病理学模型大鼠包括主动脉狭窄大鼠、动静脉短路大鼠、冠状动脉结扎大鼠、自发性高血压大鼠(SHR)、Dahl盐敏感大鼠等。Dahl大鼠是Sprague-Dawley品系大鼠，以8％高盐饮食饲养，进行传代交配在第3代时分成易患高血压的盐敏感大鼠(Dahl-S)和对高血压抵抗的耐盐大鼠(Dahl-R)。Kyoto大学的Kihara等显示从6周龄起以8％高盐饮食饲养的Dahl-S大鼠发生代偿性左心室肥大，然后左心室扩张伴随收缩衰竭，即失代偿心力衰竭，并最终死于肺充血(Am.J.Physiol.，267，H2471-2482(1994))。我们选择了Dahl盐敏感大鼠作为心衰的病理学模型，因为可以无须任何特别技术而制备它们，而且它们不久即可发生心衰，在每一个体中还可以清楚地区分代偿性肥大阶段和失代偿心衰阶段，并且它们显示出与人高血压心衰相类似的发病过程。
已知的用于检测在病理条件下表达发生变化的基因的方法包括消减、示差展示、斑点印迹和微阵列技术。在本发明中，使用消减技术成功检测其表达在从心脏肥大阶段向心衰阶段转变时发生变化的基因。它们包括新的大鼠OSF-2基因，其显示出与已报道作为成骨细胞特异性因子的小鼠OSF-2基因具有高度的同源性。
OSF-2基因被分离和鉴定为在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中特异性表达的基因(Biochem.J.294,271-278，1993，JPA 1993/268982)，并被报道在成骨细胞中具有粘附促进活性(J.Bone.Miner.Res.14.1239-1249，1999)。在兔腹主动脉损伤模型中通过示差展示进行的分析中曾报道过OSF-2基因表达增加(J.Hum.Genet.43，9-13，1998)。最近的报道还显示在使用小鼠的试验中包括OSF-2在内的30或更多个基因的表达在心脏肥大阶段发生变化(J.Mol.Cell.Cardiol.，32，805-815，2000)，在大鼠心肌梗塞模型中包括OSF-2在内的200或更多个基因的表达发生变化(Circ.Res.，86，939-945，2000)。
但是，直到现在仍不知道在心脏肥大或心肌梗塞之后随着进展至心衰会诱导进一步的表达，特别是不清楚随着心衰病变的进展OSF-2基因或OSF-2蛋白是否作为促进或抑制病变进展的因子而起作用。
我们认为可以通过确定该基因在心脏中的表达与心衰病变之间的关系而开发一种新的心衰治疗剂，并在广泛研究之后完成了本发明。
首先，我们使用主动脉狭窄大鼠、动静脉短路大鼠和自发性高血压大鼠(SHR)研究了随着心衰病变进展OSF-2基因的表达，以证实OSF-2基因的变异不是Dahl心衰模型大鼠所特有的。结果，所有测试的模型都显示出相类似的基因表达增加，强烈提示这种变异可能是心衰病变中的普遍现象。
然后，将OSF-2基因引入大鼠心脏以检查OSF-2基因显示出的对心脏的作用。首先，新分离出全长大鼠OSF-2基因，因为大鼠OSF-2基因在此之前是未知的。将该基因插入合适的表达载体，并引入大鼠心脏。超声心动图检查和血液动力学检测显示在引入OSF-2基因的大鼠中诱发了充血性心肌病样的病变，如变薄的左心室壁、扩大的左心室腔和心功能下降所证实，表明OSF-2基因或OSF-2蛋白是心衰的恶化因子。分离大鼠基因是值得注意的，因为这些分析在除大鼠以外的其它动物中是困难的。还显示通过将抑制OSF-2基因表达的反义核苷酸引入Dahl大鼠心衰模型的心脏之中而延迟了心衰所致的死亡。这表明，与心衰病变进展同时发生的OSF-2基因表达或OSF-2蛋白产生恶化了心衰，充分提示含有具有抑制OSF-2基因表达或抑制OSF-2蛋白产生或其功能作用的物质作为活性成分的药物抑制心衰的恶化，从而产生本发明。
由此，本发明提供(1)一种心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2基因表达或OSF-2蛋白产生或OSF-2蛋白功能或OSF-2蛋白的靶分子的功能的物质作为活性成分；(2)一种心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2基因表达的物质作为活性成分；(3)一种心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2蛋白产生的物质作为活性成分；(4)如以上(1)-(3)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2基因表达或OSF-2蛋白产生的物质是反义核苷酸序列；(5)如以上(4)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述反义核苷酸序列包含与如SEQ ID NO5，19，20或21所示核苷酸序列中12或更多个连续核苷酸互补的核苷酸；(6)如以上(5)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述反义核苷酸序列包含至少一条选自SEQ ID NO12-16的序列；(7)如以上(1)或(2)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2基因表达的物质是以下通式(I)的化合物或其生物学上可接受的盐 其中R1代表氢原子、任选分支的烷基或其中烷基部分可以分支的芳烷基，R2代表氢原子、卤原子或氨基，R3和R4独立地代表氢原子或酰基，或者R3和R4一起代表异亚丙基，而n代表0，1，2或3的整数；(8)如以上(7)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2基因表达的物质是以上通式(I)的化合物，其中R3和R4均代表氢原子；
(9)如以上(7)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2基因表达的物质是以上通式(I)的化合物，其中R1、R3和R4代表氢原子，R2代表氯原子，而n是3；(10)如以上(7)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2基因表达的物质是以上通式(I)的化合物，其中R1代表(2-甲基苯基)甲基，R3和R4代表氢原子，而n是0；(11)如以上(1)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2蛋白功能的物质作为活性成分；(12)如以上(1)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2蛋白的靶分子的功能的物质作为活性成分；(13)如以上(11)或(12)中所定义的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2蛋白功能或OSF-2蛋白的靶分子功能的物质是针对OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子的抗体；(14)筛选具有预防或治疗心衰作用的物质的方法，包括使合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物接触(1)具有OSF-2基因表达调控区和OSF-2基因或报道基因的细胞或体外表达体系或(2)OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子，以检测OSF-2基因或报道基因的表达水平或OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子的量；(15)如以上(14)中所定义的方法，包括使合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物接触具有OSF-2基因表达调控区和OSF-2基因的细胞，以检测OSF-2基因的表达水平；(16)如以上(14)中所定义的方法，包括构建具有连接到报道基因翻译区上游和/或下游的OSF-2基因表达调控区的表达载体，然后培养用所述载体转染的合适的宿主细胞，将合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物加入培养的细胞，并在一段给定的时间之后检测报道基因的表达水平或报道蛋白的量；(17)如以上(14)中所定义的方法，包括使合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物与OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子接触，以检测结合的或未结合的OSF-2蛋白的靶分子或OSF-2蛋白的量；
(18)如以上(17)中所定义的方法，包括将OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子固定到支持体上，并将合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物和OSF-2蛋白的靶分子或OSF-2蛋白加到固定的OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子，以检测结合的或未结合的OSF-2蛋白的靶分子或OSF-2蛋白的量；(19)诊断心衰的方法，包括收集生物学组织和/或体液，并测定所述组织中OSF-2基因的表达水平或检测OSF-2基因或所述调控区中的变异；(20)诊断心衰的方法，包括收集生物学组织和/或体液，并分析测定所述体液中的OSF-2蛋白或所述片段；(21)用于心衰的诊断试剂或诊断试剂盒，包括用于测定OSF-2基因的表达水平或OSF-2蛋白的产生水平的手段；(22)编码以下的蛋白(a)或(b)的基因(a)包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白，(b)包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的变异体的蛋白，其中缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸，并具有OSF-2蛋白活性；(23)编码以下的DNA(a)或(b)的基因(a)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的DNA，(b)与SEQ ID NO5的序列在严格条件下杂交并编码具有OSF-2蛋白活性的蛋白的DNA；(24)以下的重组蛋白(a)或(b)(a)包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白，(b)包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的变异体的蛋白，其中缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸，并具有OSF-2蛋白活性；(25)非人转基因动物，过量表达OSF-2基因并适于用作心衰的病理模型；(26)评价或筛选能成为心衰预防剂或治疗剂的活性成分的物质的方法，该方法使用如以上(25)中所定义的非人转基因动物；(27)通过如以上(14)-(18)或(26)中所定义的方法获得的物质；(28)一种心衰的预防剂或治疗剂，其包含如以上(27)中所定义的物质作为活性成分；(29)治疗心衰的方法，包括施用如以上(1)-(13)或(27)中所定义的物质；(30)如以上(29)中所定义的治疗心衰的方法，包括将OSF-2基因的反义核苷酸序列直接引入或掺入适于基因疗法的载体(如源于腺病毒的载体)或脂质体而引入；(31)如以上(1)-(13)或(27)中所定义的物质用于制备心衰预防剂或治疗剂的用途。
附图简要说明

图1显示在多种动物模型中用GAPDH基因的表达水平标准化的OSF-2基因的表达水平。
图2显示SEQ ID NO12-16的反义核苷酸序列针对OSF-2蛋白产生的抑制活性。C指对照。
图3显示反义核苷酸序列(SEQ ID NO12)、有义核苷酸序列(SEQ ID NO17)和倒频(scramble)核苷酸序列(SEQ ID NO18)针对OSF-2蛋白产生的抑制活性。
本发明优选的实施方案以下物质(1)-(3)可用作本发明中的心衰预防剂或治疗剂的活性成分。
(1)抑制OSF-2基因表达的物质抑制OSF-2基因表达的物质可以是任何合成的化合物或基因工程化合物或天然化合物或其衍生物，包括作用于OSF-2基因的启动子或增强子区以抑制OSF-2基因转录成mRNA的物质(如反义核苷酸，包括DNA、RNA、硫代磷酸类型或其它经修饰的核苷酸和PNA(蛋白核酸))，或通过细胞中的特定元件(如转录因子)而具有类似作用的物质(如与转录因子或辅激活物结合以抑制与DNA或其它转录因子或辅激活物结合的物质)。
关于本文中的反义核苷酸，术语“核苷酸”指包括从天然存在的碱基和糖部分通过适当的磷酸二酯键连接而产生的核苷酸及其类似物。因此，该术语所包含的第一组包括天然存在的种类或从天然存在的亚单位或其同源物产生的合成种类。在此亚单位指通过磷酸二酯键或其它键连接至相邻亚单位的碱基-糖组合。第二组核苷酸包括第一组的类似物，其意指具有核苷酸样功能但具有非天然存在部分的残基。这些包括在磷酸基团、糖部分或3’或5’端经化学修饰以增加稳定性的核苷酸。实例为通过将核苷酸之间的磷酸二酯基团的氧原子之一分别替换为硫原子和-CH3而获得的硫代磷酸和甲基膦酸酯。还可以使用含有经修饰的碱基形式的嘌呤和嘧啶的核苷酸类似物，即通常天然发现以外的。
用于本发明的优选的反义核苷酸为与如SEQ ID NO5，19，20或21所示核苷酸序列中12或更多个连续核苷酸，优选16或更多个连续核苷酸，更优选18或更多个连续核苷酸互补的核苷酸。特别优选的反义核苷酸具有至少一条选自SEQ ID NO12-16的序列。
在本发明中，也可以使用肽核酸(Bioconjug.Chem.，4，373-378，1994)来代替反义核苷酸。
抑制OSF-2基因表达的化合物的具体实例包括以下通式(I)的化合物或其生物学上可接受的盐。 在上式中，R1代表氢原子、任选分支的烷基或其中烷基部分可以分支的芳烷基。任选分支的烷基的实例包括甲基、乙基、异丙基、异丁基和叔丁基。对于其中烷基部分可以分支的芳烷基，芳基部分可以被低级烷基(如甲基、乙基或丙基)、低级烷氧基(如甲氧基或乙氧基)、卤原子、硝基、氰基、羧基、烷氧羰基或类似基团所取代。代表性的实例包括苄基、(2-甲基苯基)甲基、(3-甲基苯基)甲基、(4-甲基苯基)甲基、(2-氯苯基)甲基、(2-乙基苯基)甲基、(2-甲氧基苯基)甲基、(2-甲氧羰基苯基)甲基、2-苯乙基、(1-萘基)甲基、(2-萘基)甲基和2-(2-萘基)乙基。其中，R1的优选的实例包括氢原子和其中烷基部分可以分支的芳烷基，其中氢原子和(2-甲基苯基)甲基是特别优选的。
R2代表氢原子、卤原子或氨基。R2的优选的实例包括氢原子和氯原子。
R3和R4独立地代表氢原子或酰基，或者R3和R4共同代表异亚丙基。酰基的实例包括低级烷酰基如乙酰基和丙酰基。
n代表0、1、2或3，其中特别优选0和3。当n是1、2或3时，在磷酸酯部分中的一个或多个氢原子可以与碱金属或碱土金属如钠、钾、钙或镁或有机胺形成盐。
(2)抑制OSF-2蛋白产生的物质抑制OSF-2蛋白产生的物质可以是任何合成的化合物或基因工程化合物或天然化合物或其衍生物，包括通过OSF-2基因的反义核苷酸序列而抑制OSF-2 mRNA翻译成为OSF-2蛋白的物质。在此所称反义核苷酸中术语“核苷酸”如以上(1)中所定义。反义核苷酸包括RNA、DNA、硫代磷酸类型或其它经修饰的核苷酸或PNA(蛋白核酸)并可以被设计成以OSF-2基因的任何结构基因区、3’-非翻译区、5’-非翻译区或内含子/外显子接点为目标。可以直接或通过引入被设计成转录为反义RNA的载体而将反义链引入靶组织。
还可以使用识别OSF-2 mRNA的特定结构以进行切割的核酶。核酶是具有酶活性的核酸分子，它能以对靶核苷酸序列特异性的方式切割其它RNA分子，并可以形成例如锤头或发夹基序(Nature，324，429，1986；Ann.Rep.Med.Chem.，30，285-294，1995；J.Med.Chem.，38，2023-2037，1995)。可以直接或以与脂或脂质体形成的复合体的形式将核酶引入靶组织。或者，可以将表达核酶的DNA或RNA载体引入靶组织。
(3)抑制OSF-2蛋白功能的物质或抑制OSF-2蛋白靶分子功能的物质。
在本发明中，抑制OSF-2蛋白功能的物质或抑制OSF-2蛋白靶分子功能的物质可用于心衰预防剂或治疗剂中。OSF-2蛋白的靶分子意味着其结构或活性受到OSF-2蛋白影响的分子，包括但不限于底物、结合配偶体和受体。
抑制OSF-2蛋白功能的物质或抑制OSF-2蛋白靶分子功能的物质可以是任何合成的化合物或基因工程化合物或天然化合物或其衍生物，包括抑制OSF-2蛋白与OSF-2蛋白作用的靶分子(如受体)结合的物质，或抑制胞内信号转导以抑制OSF-2蛋白活性的物质。例子是针对OSF-2蛋白的抗体或针对OSF-2蛋白的靶分子的抗体。所述抗体可以是多克隆的或单克隆的。这些抗体可以通过例如以下方法制备按照标准方法从表达细胞或重组宿主的培养物中纯化蛋白并用经纯化的蛋白及合适的佐剂免疫兔或类似动物以从血清中获得抗体部分。或者，可以使用小鼠或大鼠制备单克隆抗体，或可以使用基因工程技术或转基因动物制备人源化抗体或单链单体，虽然本发明并不限于这些具体的方法。所述物质还包括特异性降解OSF-2蛋白或OSF-2蛋白靶分子的蛋白酶、失活的OSF-2蛋白(包括变异体)或OSF-2靶分子的引诱物(假目标)和可溶性受体分子。
当以上的物质(1)-(3)是肽时，它们还包括肽类似物，其酶作用位点经过修饰以使本发明的药物在施用于对象之后在体内不被或不易被肽酶或蛋白酶降解。所述类似物包括其中在酶作用位点的一个或多个肽键被另一个共价键替代的肽类似物，或其中在酶作用位点的一个或多个氨基酸是D-氨基酸的肽类似物。
(4)药物制剂使用标准制剂所用的载体或赋形剂或其它添加剂制备含有如上所述的物质作为活性成分的药物制剂。
本发明的药物组合物中的活性成分可以是游离酸或游离碱，或其可药用盐。合适的盐包括与无机酸如盐酸、硫酸和磷酸所成的盐或与有机酸如甲酸、乙酸、丁酸、琥珀酸和柠檬酸所成的盐。与金属如钠、钾、锂和钙所成的盐或与有机碱所成的盐也是合适的。
优选活性成分与已知的可药用载体、赋形剂、稀释剂等等相混合并以药学常规方式如口服或胃肠外给药(包括静脉内、肌内或皮下给药)的方式施用。本发明的药物组合物可以通过例如以下方法制备适当混合活性成分与生理学可接受的载体、调味剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂、乳化剂、增溶剂、分散剂、糖浆等等，并可作为片剂、粉剂、颗粒、溶液等使用。片剂可含有添加剂，包括例如粘合剂如明胶和润滑剂如玉米淀粉，或者可用糖或胃/肠薄膜包衣。可以通过在所述组合物中进一步包括液态载体而制备胶囊。还可以通过应用常规配方制备用于注射的无菌组合物。用于注射的水溶液包括含有葡萄糖等的等渗溶液，并可与合适的增溶剂如聚乙二醇组合。它们还可以含有缓冲剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、舒缓剂等。当活性成分通过口服在胃肠道中容易受到降解时，它们可以作为在胃肠道中不易降解的制剂口服给药，例如将活性成分包封在脂质体中的微胶囊。它们也可以通过非胃肠粘膜吸收，如直肠、鼻或舌下给药。在这种情况下，它们可以采用栓剂、鼻喷剂或舌下片剂的形式进行给药。
为了用于基因疗法，可以将反义核苷酸等整合入适于基因疗法的已知载体如腺病毒中。
当本发明的药物组合物用于治疗时，对各病例根据对象的年龄和体重、疾病的严重程度和给药途径及其它因素确定治疗有效剂量。通常，口服剂量为大约0.1-1000毫克/成人/天，可以一次或分成几个亚剂量服用。对于连续静脉内给药，剂量可以从0.01μg/kg/min到1.0μg/kg/min，优选从0.025μg/kg/min到0.1μg/kg/min。
(5)筛选方法例如，可以如下所述筛选可用作本发明的预防剂或治疗剂的活性成分的物质。
用于筛选抑制OSF-2基因表达的物质或抑制OSF-2蛋白产生的物质的OSF-2基因或OSF-2蛋白或其衍生物可以来自于任何来源，包括哺乳动物如人、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴和豚鼠。即它们除新发现的大鼠基因(SEQ ID NO5)或由其编码的蛋白(SEQ ID NO6)之外还包括已知的基因或蛋白。本发明的OSF-2基因和OSF-2蛋白包括多种已知的OSF-2基因的剪接变体和由其翻译产生的蛋白，由于已知多种OSF-2基因的剪接变体。例如小鼠OSF-2基因和OSF-2蛋白包括如SEQ ID NO19所示的序列，而人OSF-2基因和OSF-2蛋白包括如SEQ ID NO20(来自胎盘)和21(来自原发肿瘤)所示的序列。OSF-2基因的部分序列也可以单独使用或作为与另一个基因的嵌合基因而使用。类似地，OSF-2蛋白的部分序列可以单独使用或与另一个肽融合。
其中，优选使用人的基因或蛋白进行研究/开发用于人的预防剂或治疗剂。那些来源于动物如小鼠和大鼠的基因或蛋白优选用于使用动物模型的研究/开发，即由于强制表达OSF-2基因而患有心衰病症的非人转基因动物。
抑制OSF-2基因表达的物质或抑制OSF-2蛋白产生的的物质一般通过使用报道基因的方法进行筛选。合适的报道基因包括，例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和荧光素酶。抑制OSF-2基因表达的物质可以通过例如以下方法进行筛选构建表达载体，其中OSF-2基因的表达调控区(启动子、增强子或类似区域)连接到报道基因编码区的上游和/或下游，将所述载体转染到合适的培养细胞中，将测试物质加入培养细胞(所述物质可以是任何合成的化合物或基因工程化合物或天然化合物或其衍生物)，并在一段给定的时间之后测定报道基因的表达水平或报道蛋白的量。OSF-2基因的表达调控区(启动子、增强子或类似区域)可以从市售基因组文库中使用OSF-2cDNA片段作为探针通过噬菌斑杂交而得到。例如，在以下的实施例中，抑制OSF-2基因表达的物质是通过将在荧光素酶基因上游连接有OSF-2基因启动子区的“报道载体”引入COS-1细胞并在添加候选化合物之后测定荧光素酶活性而发现的。本发明的物质还包括引诱物，即针对作用于OSF-2基因的转录因子的引诱物-类型的核酸药物(Science，250，997-1000，1990)等等。报道蛋白的量可以测定为酶活性或使用抗体等测定为蛋白的表达水平。
抑制OSF-2蛋白产生的反义核苷酸或核酶或诸如此类可以通过将反义核苷酸或核酶通过例如电穿孔或脂质体技术引入表达OSF-2蛋白的培养细胞，并测定OSF-2蛋白的表达水平而进行筛选。例如，在以下的实施例中，抑制OSF-2蛋白表达的反义核苷酸是通过将以OSF-2的起始密码子为目标的一系列反义核苷酸引入过量表达OSF-2蛋白的COS-1细胞而发现的。具有这种作用的任何反义核苷酸都可能是合适的，如抑制转录、mRNA剪接或mRNA通过核膜的那些反义核苷酸。类似的方法可用于筛选核酶。合适的培养细胞包括用OSF-2基因转染的细胞以及任何原本表达OSF-2基因的细胞如MC3T3-E1细胞(Biochem.J.294，271-278，1993)诸如此类。
抑制OSF-2蛋白功能的物质或抑制OSF-2蛋白靶分子功能的物质可以通过例如以下方法进行筛选将OSF-2蛋白的靶分子或OSF-2蛋白固定到平板或类似物上，然后添加测试物质(所述物质可以始任何合成的化合物或天然化合物或其衍生物)和OSF-2蛋白或其靶分子，并通过ELISA、RIA、荧光标记等测定结合的或未结合的OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子的量。它们也可以通过以下方法进行筛选使用表达OSF-2的靶分子的细胞，与标记的OSF-2和测试药物共处，在一段给定的时间之后进行合适的清洗处理，然后通过FACS、吸光度、显色或其它方式测定标记的细胞的数目或标记的程度。或者，还可以基于OSF-2所显示的作用(如粘附活性)进行筛选通过将测试物质(所述物质可以是任何合成的化合物或天然化合物或其衍生物)加入培养细胞的培养基中并测定OSF-2所显示的作用强度。
(6)诊断方法、诊断剂和诊断试剂盒本申请的发明人显示OSF-2基因随着心衰的恶化而增加表达水平。心衰的恶化程度可以通过使用心衰患者的活检样本测定OSF-2基因的表达水平来诊断。例如，可以通过使用ISOGEN(Nippon Gene)从患者的活检样本分离总RNA，并用DNA酶处理，然后合成cDNA，使用合适的引物PCR扩增OSF-2基因，并通过凝胶电泳测定相应于OSF-2的条带的强度来确定OSF-2基因的表达水平。OSF-2基因的表达也可以通过用于定量测定RNA或DNA的任何其它技术来测定，如在实施例3中描述的方法、RNA印迹杂交或cDNA阵列技术。
鉴于本发明显示OSF-2基因是心衰的恶化因子，可以容易地预测OSF-2基因或其调控区具有某些变异的个体倾向于易发生心衰或心衰恶化，如果这种变异的存在增强了OSF-2蛋白的功能或增加了基因表达水平。因此，通过检测所述基因中的这些变异可以诊断危险因子。所述基因中的变异可以通过以下方法来检测根据标准方法从患者血样分离DNA，按照实施例1-5中描述的方法测定核苷酸序列，并将其与正常序列作比较。一旦明确了变异与心衰之间的关系，则可以应用DNA芯片或SSCP技术来特异性检测这种变异。
由于已知OSF-2是一种分泌性蛋白，容易预测基因表达的增加伴有心脏和血液中OSF-2蛋白水平的增加。因此，可以通过测定血液中OSF-2蛋白的水平了解心衰的恶化程度。合适的测定方法包括使用针对OSF-2的抗体的ELISA或RIA，或HPLC或质谱分析。在此，OSF-2蛋白可以不是总体的形式，而可以分成几部分，只要其可以进行测定。
本发明还包括用于心衰的诊断剂或诊断试剂盒，包含使用如上所述的测定方法测定OSF-2基因表达水平或OSF-2蛋白产生水平的手段。
(7)用OSF-2基因转染的非人转基因动物在本发明中用于创建由于强制过量表达OSF-2基因而发生心衰病症的非人转基因动物的非人宿主动物包括小动物如小鼠、大鼠和兔，以及大动物如狗、猪、绵羊和牛，和任何其它表达OSF-2基因并显示OSF-2蛋白的功能或生理学作用的动物。用于表达OSF-2基因的合适启动子包括组成型表达启动子(CMV启动子、SV40早期启动子等)以及组织特异性启动子(αMHC启动子、α-肌动蛋白启动子等)，诱导型表达启动子(Cre-loxP体系、四环素诱导系统、蜕皮素诱导系统等)和任何其它能诱导基因表达的系统。
本发明提供诱导性和心脏组织特异性表达OSF-2基因的转基因动物。合适的诱导表达体系包括，例如蜕皮素诱导系统(Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，3346-3351，1996；Nature，366，476-479，1993；Cell，71，63-72，1992)。该诱导表达体系被设计成组成型表达蜕皮素受体和类维生素A X受体(RXR受体)，从而由这两种受体组成的受体异二聚体在蜕皮素的存在下与蜕皮素效应区域结合以诱导其下游的靶基因的表达。例如，可以分别制备表达蜕皮素受体和RXR受体的“诱导用转基因动物”以及表达蜕皮素效应区域和靶基因的“表达用转基因动物”，并使其进行杂交来制备双重转基因动物。可通过向该双重转基因动物施用蜕皮素来诱导靶基因。
首先，通过标准方法制备特征为诱导型表达OSF-2蛋白的转基因动物，该动物是这样获得的通过将OSF-2基因连接到蜕皮素效应区域的下游而得到用于制备转基因动物的重组基因，用该重组基因转染全能细胞，使该全能细胞长成个体，及其后代(用于表达的转基因动物)。
另一方面，制备特征为在心脏组织中特异性表达蜕皮素受体蛋白并全身表达RXR蛋白的转基因动物，该动物是这样获得的将蜕皮素受体基因连接到心脏组织特异性表达启动子的下游，将RXR基因连接到非组织特异性启动子的下游，用具有这两种表达单位的用于制备转基因动物的重组基因转染全能细胞，使该全能细胞长成个体，及其后代(用于诱导的转基因动物)。
此处的全能细胞指能潜在分化成为任何细胞的细胞。例如对于小鼠，全能细胞可以是受精卵和早期胚胎以及培养细胞如多能ES细胞。可以通过静电脉冲、脂质体、磷酸钙和其它技术将DNA片段引入培养细胞。特别优选将DNA溶液物理注射入受精卵(微注射)。
在制备本发明的转基因动物的过程中所使用的重组基因理想地是在胚胎发生阶段插入。将用DNA转染的细胞植入替代母体动物，对其进行喂养并使其生下预期的用目标基因转染的后代转基因动物(始祖转基因动物)。转基因的存在可以通过对从动物体一部分(如尾梢)的切片中分离的体细胞DNA进行PCR或DNA印迹而得到证实。
此外，本发明的转基因动物的后代动物可以通过进一步包括以下步骤来制备使各始组转基因动物与正常动物杂交，以产生F1动物(后代动物)，并使在所述F1动物之中表达性状的转基因动物彼此杂交或与正常动物杂交，以得到纯合或杂合的F2动物(后代动物)。本发明人事实上成功制备了这些转基因动物。
双重转基因动物可以如下获得使用于表达的转基因动物与用于诱导的转基因动物杂交，并证实两个基因的存在，然后可以通过将蜕皮素施用于所述双重转基因动物而获得可诱导并且心脏组织特异性表达OSF-2基因的转基因动物。
本发明的转基因动物可用于病理学研究和药物筛选，作为其中涉及OSF-2基因的疾病的模型(如心衰模型)。
此外，通过将候选物质给予本发明的转基因动物，并测定OSF-2基因的表达水平、OSF-2蛋白的产生或心功能的改变等，可以评价或筛选作为用于其中涉及OSF-2基因的疾病(如心衰)的预防剂或治疗剂的活性成分的物质。因此，本发明还包括使用本发明的转基因动物评价或筛选作为用于其中涉及OSF-2基因的疾病的预防剂或治疗剂的活性成分的物质的方法。
工业实用性本发明提供的心衰治疗剂对于其中涉及OSF-2基因或蛋白的轻度到严重的心衰展示其对特定靶的活性并具有基于不同于常规机制的效力。本发明的筛选方法可开发用于其中涉及OSF-2基因或蛋白的所有疾病包括心衰的治疗剂。根据本发明的诊断方法，可以预测心衰的恶化程度或发生心衰的危险，这有助于改善生活方式或治疗。此外，本发明的转基因动物可作为其中涉及OSF-2基因的疾病的模型用于病理学研究或药物筛选。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅供举例说明的目的，而不应理解为是对本发明范围的限制。
实施例实施例1通过消减方法搜寻OSF-21-1 制备心衰的病理模型大鼠并收集左心室样本将雄性Dahl盐敏感大鼠(Dahl-S)(SHIMIZU LABORATORYSUPPLIES)从6周龄起以8％高盐饮食喂养，并分别在心脏肥大阶段(11周龄)和心衰阶段(14周龄)各从3只动物收集左心室。
1-2制备mRNA利用ISOGEN(Nippon Gene)按照制造商提供的使用说明从约500mg的所述左心室制备总RNA。然后，利用Fast Track 2.0试剂盒(Invitrogen)按照制造商提供的使用说明从约400μg的来自分别处于心脏肥大阶段和心衰阶段的各3只动物的合并的总RNA纯化mRNA，从而回收大约3μg的处于各阶段的mRNA。
1-3 cDNA消减使用PCR-Select cDNA消减试剂盒(Clontech)按照制造商提供的使用说明进行cDNA消减。即，从2μg在以上1-2中获得的各mRNA合成cDNA，并用限制酶RsaI消化。然后使用从14周龄动物的左心室合成的cDNA作为测试cDNA并使用从11周龄动物合成的cDNA作为驱动cDNA，在试剂盒中所包括的2个连接物被分别连接到测试cDNA之后进行扣除杂交。然后，使用与所述连接物互补的引物通过PCR特异性扩增表达水平改变的cDNA片段以得到扩增产物1。
使用从11周龄动物的左心室合成的cDNA作为测试cDNA并使用从14周龄动物的左心室合成的cDNA作为驱动cDNA进行类似的消减操作，以得到扩增产物2。
1-4 点印迹筛选A.制备点印迹将扩增产物1 TA克隆至PCR II载体(Invitrogen)中以选择具有插入片段的克隆。对各1μl其中各克隆的插入片段得到扩增的PCR反应溶液进行热处理，然后在2个尼龙膜滤器(Boehringer)上进行点印迹，并用UV交联剂(Stratagene)固定。
B.制备cDNA探针将扩增产物1用限制酶RsaI、EaeI和SmaI消化以去除所述连接物，并使用DIG High Prime DNA标记/检测试剂盒II(Boehringer)按照制造商提供的使用说明用DIG-dUTP进行随机引物标记以制备cDNA探针1。类似地，从扩增产物2制备cDNA探针2。
C.筛选将在以上A中制备的点印迹薄膜之一与cDNA探针1进行杂交，另一薄膜与cDNA探针2杂交(按照Boehringer提供的DIG HighPrime DNA标记/检测试剂盒II的使用说明，杂交条件为在DIG EasyHyb溶液中42℃杂交过夜，并用2×SSC，0.1％ SDS在室温下洗2次5分钟，用0.1×SSC，0.1％ SDS在68℃洗2次15分钟)，并在试剂盒中所包括的封闭缓冲液中与碱性磷酸酶标记的DIG抗体反应，然后加入CSPD ready-to use进行化学发光显色并将X线胶片曝光。选择对于cDNA探针1比对cDNA探针2显示出更强信号的克隆作为阳性克隆并测序。
1-5 测序使用THERMO SequenaseTMII染料终止子循环测序试剂盒(Amersham Pharmacia)通过在自动DNA测序仪373A型(PEApplied Biosystems)上进行分析来测定核苷酸序列。将所得的基因序列与GenBank数据库相比较，显示所述克隆之一(SF014)是与小鼠OSF-2(GenBank Accession No.D13664)具有86％同源性的基因。
实施例2大鼠OSF-2 cDNA的克隆使用引物(1)5’-GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC-3’(SEQID NO1)和引物(2)5’-GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3’(SEQ ID NO2)(所述引物是基于SF014的核苷酸序列设计的)通过PCR筛选10个大约4000个克隆的噬菌体亚库(总共约40,000个克隆)分离大鼠OSF-2 cDNA，得到3个阳性亚库，其中噬菌体亚库是从插入λgt11载体的大鼠主动脉cDNA文库(Clontech)制备的。使用通过上述PCR扩增的片段作为探针(使用AlkPhos DirectTM(AmershamPharmacia)用碱性磷酸酶标记)通过杂交筛选上述亚库之一，得到一个阳性克隆大鼠OSF-2#1。将插入片段整合入pBluescript II(Stratagene)的EcoRI位点，并根据实施例1-5的方法测定全核苷酸序列。
所得的克隆长度大约3kb对应于小鼠OSF-2(GenBank AccessionNo.D13664)从292到3’端的核苷酸序列，提示它是5’-截短的克隆。由此，使用SMARTTMRACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)按照制造商提供的使用说明进行5’-RACE反应，其中使用大鼠主动脉cDNA作为模板，并使用所述引物(2)5’-GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3’(SEQ ID NO2)和基于大鼠OSF-2#1的核苷酸序列设计的引物(3)5’-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3’(SEQ ID NO3)。将所得的PCR产物TA克隆至Invitrogen的PCR II载体中，得到大鼠OSF-2 5RACE#1。按照实施例1-5的方法测定核苷酸序列。
结果显示大鼠OSF-25RACE#1是比最初获得的大鼠OSF-2#1在5’方向长大约300bp的克隆，其5’端比小鼠OSF-2(GenBankAccession No.D13664)的5’端长15bp。使用基于大鼠OSF-25RACE#1的核苷酸序列设计的引物(4)5’-ACGGAGCTCAGGGCTGAAGATG-3’(SEQ ID NO4)和所述引物(3)5’-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3’(SEQ ID NO3)通过PCR筛选从所述大鼠主动脉cDNA文库制备的10个大约40,000个克隆的噬菌体亚库(总共大约400,000个克隆)，得到2个阳性亚库。使用由上述PCR扩增得到的片段作为探针通过杂交筛选其中一个亚库，得到一个阳性克隆，命名为大鼠OSF-2#2。将插入片段整合入pBluescript II(Stratagene)的EcoRI位点，并根据实施例1-5的方法测定其核苷酸序列。
所得的克隆长度为约2.6kb，其5’端与用5’-RACE得到的克隆相同，而3’端对应于直至小鼠OSF-2(GenBank Accession No.D13664)的核苷酸2410。先前获得的大鼠OSF-25RACE#1的核苷酸序列与大鼠OSF-2#2相关区域的核苷酸序列完全相同。由大鼠OSF-2#1和大鼠OSF-2#2完成了大鼠OSF-2 cDNA的全长。该全长cDNA的核苷酸序列与从该核苷酸序列翻译得到的氨基酸序列如SEQ ID NO5和6所示。
实施例3分析OSF-2基因在多种心衰模型大鼠中的表达通过消减选择OSF-2基因，为在Dahl大鼠心衰阶段以更高水平表达的基因。测试该基因实际显示出表达改变的程度及其是否在除Dahl大鼠以外的多种心衰模型中显示出类似的改变。
3-1 制备模型大鼠并收集样本A.Dahl心衰模型大鼠将雄性Dahl盐敏感大鼠(Dahl-S)(SHIMIZU LABORATORYSUPPLIES)从6周龄起用8％高盐饮食喂养，并在心脏肥大阶段(11周龄)和心衰阶段(14周龄)收集左心室。将以正常饮食喂养的10周龄Dahl-S大鼠用作对照。
B.腹主动脉狭窄大鼠(压力超负荷模型)B-1.制备压力超负荷诱发心脏肥大的大鼠模型的方法将9周龄的Sprague-Dawley品系雄性大鼠用于实验。在将大鼠固定成俯伏位并通过腹膜内施用戊巴比妥钠(40mg/kg)在麻醉下切开腹部后，在右肾动脉和左肾动脉之间暴露并解剖出腹主动脉。沿主动脉放置一根21G针头，并将其与右肾动脉和左肾动脉之间的主动脉一起用丝线结扎，然后抽出针头，以形成主动脉狭窄。在该模型中，这种腹主动脉狭窄升高了收缩血压，从而增加了心脏的后负荷，以诱发左心室肥大。
B-2.收集样本在手术后3个月和17个月的收缩血压显示出高于正常的值，即分别为232mmHg和188mmHg，这是由于动脉狭窄造成的。在第3个月，观察到心脏重量/体重之比显著增高，并且指示心功能的缩短分数(FS)在大鼠中从3个月时的52％降至17个月时的26％。由此，在狭窄形成之后3个月和17个月收集左心室分别作为代偿性肥大阶段和失代偿心衰阶段的样本。10周龄大鼠用作对照。
C.腹动静脉短路大鼠(容量超负荷模型)C-1.制备容量超负荷诱发心脏肥大的大鼠模型的方法将9周龄Sprague-Dawley品系雄性大鼠用于实验。在将大鼠固定成俯伏位并通过腹膜内施用戊巴比妥钠(40mg/kg)在麻醉下切开腹部后，暴露腹主动脉和腔静脉，在主动脉分叉为肾动脉和股动脉处进行钳夹而阻断血流。在钳夹位点将一根18G针头插入主动脉以贯穿入腔静脉，从而形成动静脉短路。将针头抽出，用外科手术粘合剂关闭主动脉的创口，并移除钳夹。证实在短路中动脉血流入静脉后，关闭腹腔。在该模型中，形成这种腹动静脉短路导致静脉压增高，因此心脏前负荷增加，继而接连对右心房、右心室、左心房和左心室施加超负荷，导致肥大。此外，静脉系统的低顺应性引起血液潴留，从而诱发肺充血。
C-2.收集样本在手术后3个月和11个月通过超声心动图测定心脏功能，然后解剖动物，以检测心脏重量和尸检发现。大鼠在手术后11个月时与手术后3个月相比，在每例中均显示出红细胞比容值降低和肺水肿，提示晚期的容量超负荷。右心系统显示出心脏重量/体重之比或肺重量/体重之比升高，提示从右心室到肺区域的水肿。FS从57％降至31％。由此，在发生短路后3个月和11个月时收集左心室分别作为代偿阶段和失代偿心衰阶段的样本。10周龄大鼠用作对照。
D.自发性高血压大鼠(压力超负荷模型)喂养称为自发性高血压大鼠的SHR大鼠，并随时间测量血压和超声心动图。3月龄的SHR显示出血压和心脏重量/体重之比高于正常，并由于高血压而发生心脏肥大。19月龄的动物表现出竖毛和蹲伏，以及FS从56％降至32％，及收缩血压降低，并发生心衰。还发现了诸如腹水和水肿的症状。在各个阶段通过解剖收集左心室。
3-2分析基因表达使用ABI PRISM 7700(PE Applied Biosystems)通过实时PCR测定系统分析基因表达。
使用ISOGEN(Nippon Gene)按照制造商提供的使用说明从各个模型的左心室制备总RNA，并用DNA酶处理。用TaqMan逆转录试剂(PE Applied Biosystems)在50μl反应溶液中从各1μg经DNA酶处理的总RNA合成cDNA。用于检测OSF-2的引物和所用的TaqMan探针为(5)5’-TGCAAAAAGAGGTCTCCAAGGT-3’(SEQID NO7)，(6)5’-AGGTGTGTCTCCCTGAAGCAGT-3’(SEQ ID NO8)，和(7)5’-FAM ACAAAGTTCATTGAAGGTGGCGATGGTCTAMRA-3’(SEQ ID NO9)，上述序列是基于大鼠OSF-2 cDNA的核苷酸序列，使用引物设计软件ABI PRISM Primer Express设计的。用作内标的GAPDH用TaqMan啮齿动物GAPDH对照试剂(PEApplied Biosystems)进行检测。使用在实施例1中所述的SF014作为对照质粒，通过系列稀释制备OSF-2的校正曲线，使用通过扩增大鼠GAPDH的部分序列得到的PCR产物作为对照质粒(在TA克隆至PCR II载体(Invitrogen)以证实核苷酸序列之后)通过系列稀释制备GAPDH的校正曲线。
使用TaqMan Universal PCR Master Mix(PE AppliedBiosystems)按照制造商提供的使用说明，以0.4-0.8μl所述cDNA作为模板，在40μl反应溶液中进行实时PCR测定反应。将分析结果标准化为用作内标的GAPDH的量，如图1所示。结果显示在所有模型中OSF-2的表达随着心衰病变的进展而增加。
实施例4构建Myc-His-rOSF-2融合蛋白表达载体制备一种表达载体，其在从大鼠OSF-2基因的编码区翻译得到的蛋白的羧基末端具有Myc表位和6个组氨酸标记，并且具有CMV启动子。
首先，将通过用限制酶EcoRI和HindIII消化实施例2中得到的大鼠OSF-25RACE #1而获得的约500bp的片段和通过用限制酶HindIII和HpaI消化实施例2中得到的大鼠OSF-2#1而获得的约2780bp的片段使用连接试剂盒(TAKARA SHUZO)连接到通过用限制酶EcoRI和EcoRV消化pTracer-CMV2载体(Invitrogen)而获得的载体片段，从而得到命名为pTracer-CMV2/rOSF-2的质粒。将如此制备的pTracer-CMV2/rOSF-2用限制酶EcoRI和SmaI消化，得到含有大鼠OSF-2基因编码区的约2330bp的片段。分别地，使用实施例2中得到的大鼠OSF-2#1作为模板，和基于模板的序列设计的引物(8)5’-GACCCGGGAAGAACGCATCATC-3’(SEQ ID NO10)和被设计成紧靠大鼠OSF-2终止密码子之前插入BstEII位点的引物(9)5’-TGGGTGACCCTGAGAACGGCCTTCTCTTGATC-3’(SEQ IDNO11)进行PCR，纯化扩增产物，然后用限制酶SmaI和BstEII消化，得到约270bp的片段。使用连接试剂盒(TAKARA SHUZO)将这两个片段连接到通过用限制酶EcoRI和BstEII消化用于构建表达载体pcDNA4/Myc-His/type C(Invitrogen)的质粒而获得的载体片段，得到命名为pcDNA4/Myc-His/rOSF-2的质粒。通过实施例1-5中所述的方法证实插入片段的全核苷酸序列。
实施例5构建rOSF-2蛋白表达载体制备含有在实施例2中得到的大鼠OSF-2基因的全编码区和CMV启动子的表达载体。将在实施例4中获得的pTracer-CMV2/rOSF-2用限制酶EcoRI和PmeI消化，得到含有大鼠OSF-2基因编码区的约3300bp的片段，使用连接试剂盒(TAKARASHUZO)将该片段连接到通过用限制酶EcoRI和PmeI消化所述pcDNA4/Myc-His/type C(Invitrogen)而得到的载体片段，得到命名为pcDNA4/rOSF-2的片段。通过实施例1-5中所述的方法证实插入片段的全核苷酸序列。
实施例6通过将OSF-2基因转染入大鼠心脏进行功能性分析6-1 大规模纯化表达质粒用在实施例5中制备并用EndoFreeTMPlasmid Giga试剂盒(QIAGEN)纯化然后溶于磷酸缓冲盐水的表达质粒(pcDNA4/rOSF-2)转化大肠杆菌DH5α菌株。
6-2 制备HVJ-脂质体将50μl的HMG-1，-2混合物(1mg/ml，Wako Pure ChemicalIndustries)加入200μg所述质粒溶液，并将混合溶液置于室温1小时，然后添加BSS溶液至总体积为200μl。将混合溶液加入含有贮存于-20℃的混合脂质(Avanti Polar Lipid Inc.，Sigma，Hum.Gene Ther.8(17)，2133-2141(1997)，Cell biology，a laboratory hand book，第二版，Vol.4，122-123(1998))的玻璃试管，并将试管在涡旋混合器上剧烈振荡30秒，置于37℃温箱中静置30秒。将该操作重复循环8次之后，将玻璃试管在注满水的超声发生器中超声处理6秒，并在涡旋混合器上(120rpm)再振荡30秒。然后，将1ml的HVJ(20000 HAU或更高)(KanedaHVJ-liposome method(Experimental Procedures forGene Transfer & Expression Analysis；Yodosha)70-79(1997)，Saeki，KanedaHVJ-liposome vector(Gene Therapy，Handbook forDevelopment and Studyeds.Japan Gene Therapy Association)429-438(1999)，Hnm.Gene Ther.8(17)，2133-2141(1997)，Cellbiology，a laboratory hand book，2ndedition，vol.4，122-123(1998))分散于直径30mm的塑料培养皿中，在UV交联器中将培养皿的盖子敞开通过以1980mJ/cm2进行紫外线照射而灭活。将该经灭活的HVJ加入玻璃试管中，并置于冰上10分钟，加入1.3ml的BSS，然后在振荡培养箱中于37℃振荡1小时。然后，将全部体积的HVJ-脂质体溶液(来自玻璃试管)轻轻倒到10ml超速离心管中的7.5ml 30％蔗糖溶液之上，在4℃以62,800×g超速离心1.5小时。用巴斯德吸管回收聚积为在蔗糖溶液之上的白色颗粒的脂质体，用BSS稀释至总体积3ml，然后贮存于4℃。
6-3 基因转染入大鼠使用30-口径针头将HVJ-脂质体/DNA溶液(浓度为6.7μg/ml)注射入12周龄Sprague-Dawley大鼠(雄性)的左心室(尖端和侧面部位)，注射量为3个部位各100μl(总体积为300μl)(rOSF-2组)。作为对照，以相同方式注射pcDNA4/His-Myc载体(对照组)。
6-4 超声心动描记术在转染后6周用氯胺酮(50mg/ml)和赛拉嗪(10mg/ml)麻醉之后，使用Core Vision Pro SSA 350A(探头7 MHz，Toshiba)进行超声心动描记。结果如表1所示，显示在rOSF-2组中诱发了心脏扩张，正如与对照组相比LVIDD(舒张末期左心室内径)和LVIDS(收缩末期左心室内径)的显著差异所证实。
表1.超声心动描记的结果(6周后)评价项目 对照 大鼠OSF-2n11 10IVSTD(mm)2.06±0.08 1.69±0.06#LVIDD(mm)5.78±0.16 7.68±0.20#LVPWD(mm)2.34±0.09 1.98±0.05#IVSTS(mm)2.56±0.13 2.44±0.08LVIDS(mm)2.54±0.18 3.81±0.28#LVPWS(mm)2.90±0.12 2.87±0.07EDV(μl) 166.8±10.6 316.9±17.1#ESV(μl) 25.1±4.4 67.1±11.5#FS (％) 56.3±2.5 50.8±2.7#P＜0.01 vs.对照缩写IVSTD舒张末期心室间隔厚度LVIDD舒张末期左心室内径LVPWD舒张末期左心室后壁厚度IVSTS收缩末期心室间隔厚度LVIDS收缩末期左心室内径LVPWS收缩末期左心室后壁厚度
EDV舒张末期容积ESV收缩末期容积FS左心室内径缩短分数6-5 血液动力学测试在转染后6周用盐酸戊巴比妥(50mg/ml)麻醉之后，测量心内压和血压。结果如表2所示。与对照组相比，在rOSF-2组中LVP(左心室压力)、LVEDP(左心室舒张末期压力)、+LVdP/dT和-LVdP/dT存在显著差异，提示心功能下降。
表2 血液动力学测试(6周后)评价项目 对照 大鼠OSF-2n10 10BW(g) 411.8±6.9 415.6±12.3HW(g/kg)2.63±0.08 2.67±0.12LVW(g/kg) 1.97±0.04 1.99±0.04HR(次/分) 444±8 417±12MBP(mmHg) 128.7±4.7 119.7±5.4LVP(mmHg) 171.1±7.1 143.5±8.7#LVEDP(mmHg) 0.16±0.07 1.00±0.30#+LVdP/dt(mmHg/sec) 8511±468 6120±466#-LVdP/dt(mmHg/sec) 7356±226 5580±470##P＜0.01 vs.对照缩写BW体重，HW心脏重量，LVW左心室重量HR心率，MBP平均血压，LVEDP左心室舒张末期压力LVP左心室压力LVdP/dT最大左心室压力一次微分实施例7设计和选择OSF-2基因的反义寡核苷酸7-1 设计反义核苷酸序列通过选择含有起始密码子AUG但不含3个连续鸟嘌呤(三联G)并且不能形成发夹结构或自退火的区域而设计如SEQ ID NO12-16所示的5条反义核苷酸序列并由外承包人合成。所有的反义核苷酸序列都是硫代磷酸型的。
7-2 选择反义核苷酸序列将实施例5中所述的Myc-His-rOSF-2融合蛋白表达载体pcDNA4/Myc-His/rOSF-2引入COS-1细胞，并将以上1中制备的反义核苷酸序列引入以筛选抑制Myc-His-rOSF-2融合蛋白表达的反义核苷酸序列。使用Myc特异性单克隆抗体(Invitrogen)通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定Myc-His-rOSF-2融合蛋白的表达水平。具体地说，将COS-1细胞以2×104细胞/孔的密度在96孔板中平板培养。16-24小时后，将320ng DNA(pcDNA4/Myc-His/rOSF-2)溶于OPTI-MEMI培养基(GIBCO)中，并与含有1μl的LipofectAMINE2000试剂(GIBCO)的相同量OPTI-MEM I培养基混合，将混合物置于室温反应20分钟，然后加入COS-1细胞，于37℃温育进行转染。然后，在加入DNA后1-4小时加入一系列溶于磷酸缓冲盐水的反义核苷酸序列至终浓度为100nM，将该混合物于37℃再温育3天。
通过将50μl培养上清于37℃温育1-2小时而将其固定到EIA/RIA平板(Costar)上，用200μl含有0.1％Tween的Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBST)洗2次。为了封闭非特异性吸附，用封闭液(含有1％牛血清白蛋白的PBST)于37℃处理平板1小时，并用200μl的PBST洗3次。然后将溶于50μl封闭液中的稀释至1∶4000的辣根过氧化物酶标记的抗Myc单克隆抗体(Invitrogen)通过于室温温育1小时而偶联至平板，并用200μl的PBST洗3次，再用PBS洗1次。与50μl的TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)试剂(KPL)于室温温育30分钟之后，通过加入50μl 0.1N的硫酸终止反应，用微量反应板读取器测量在450nm的吸光度。
结果，以起始密码子为目标的一系列反义核苷酸序列均具有抑制OSF-2蛋白产生的活性，其中如SEQ ID NO12所示的反义核苷酸序列最为强烈地抑制表达，如图2所示。
然后，制备有义核苷酸序列(SEQ ID NO17)(它是相应于SEQID NO12的有义链)和5’、3’方向与SEQ ID NO12相反的倒频(scramble)核苷酸序列(SEQ ID NO18)，并进行如上所述的试验，各核苷酸的终浓度为10nM。结果显示反义核苷酸序列抑制OSF-2蛋白产生的活性强于有义和倒频核苷酸序列，如图3所示。
实施例8反义核苷酸对OSF-2基因表达的抑制8-1制备HVJ-脂质体如实施例6中所述制备HVJ-脂质体将50μl的HMG-1，-2混合物(1mg/ml，Wako Pure Chemical Industries)加入200μg在实施例6.1中制备的质粒溶液和1.4mg在实施例7中选择的反义核苷酸溶液中。以相同的方式还制备了有义和倒频核苷酸序列。
8-2 基因转染入大鼠使用30-口径针头将HVJ-脂质体/DNA溶液注射入13周龄Sprague-Dawley大鼠(雄性)的左心室(尖端和侧面部位)，注射量为3个位点各100μl(总体积为300μl)(rOSF-2/反义组，rOSF-2/有义组和rOSF-2/倒频组)。类似地，注射pcDNA4/rOSF-2作为阳性对照组，注射pcDNA4/His-Myc载体作为阴性对照组。
8-3 超声心动描记在转染后3周用氯胺酮(50mg/ml)和赛拉嗪(10mg/ml)麻醉之后，使用Core Vision Pro SSA 350A(探头7MHz，Toshiba)进行超声心动描记。结果如表3所示，显示rOSF-2/反义组类似于阴性对照组(对照)抑制了心脏扩张，正如与阳性对照组(rOSF-2)或rOSF-2/有义组和rOSF-2/倒频组相比，显著较小的LVIDD(舒张末期左心室内径)和LVIDS(收缩末期左心室内径)所证实。
表3.超声心动描记的结果评价项目 对照 大鼠OSF-2 反义 有义 scramblen 6 6 6 7 5IVSTD(mm) 1.80±0.11 1.30±0.17*1.68±0.12 1.26±0.07*1.26±0.12*LVIDD(mm) 6.18±0.23 7.90±0.29*6.42±0.09# 7.93±0.18*7.60±0.11*LVPWD(mm) 2.22±0.11 1.45±0.15*2.20±0.13# 1.46±0.11*1.68±0.07*IVSTS(mm) 3.15±0.13 2.60±0.17*3.07±0.16 2.50±0.07*2.60±0.15*LVIDS(mm) 3.07±0.16 3.95±0.24*3.25±0.15# 4.24±0.22*4.06±0.18*LVPWS(mm) 2.92±0.10 2.42±0.16*2.80±0.17 2.30±0.15 2.66±0.07*EDV(μl) 194.7±16.8338.0±26.8*210.0±6.8# 339.2±17.9*307.6±10.4*ESV(μl) 37.8±4.9 69.8±9.8*43.3±5.1# 82.4±10.2*73.4±7.5*FS(％)50.5±1.1 50.1±1.8 49.5±1.746.7±1.6 46.7±1.6*P＜0.05 vs.对照#P＜0.05 vs.大鼠OSF-2缩写IVSTD舒张末期心室间隔厚度LVIDD舒张末期左心室内径LVPWD舒张末期左心室后壁厚度IVSTS收缩末期心室间隔厚度LVIDS收缩末期左心室内径LVPWS收缩末期左心室后壁厚度EDV舒张末期容积ESV收缩末期容积FS左心室内径缩短分数实施例9反义核苷酸对心衰发病的抑制9-1制备HVJ-脂质体如实施例6.2中所述制备HVJ-脂质体将50μl的HMG-1，-2混合物(1mg/ml，Wako Pure Chemical Industries)加入1.4mg溶于BSS缓冲液中的在实施例7中选择的反义核苷酸溶液中。以相同的方式还制备了有义核苷酸。
9-2 基因转染入大鼠使用30-口径针头将HVJ-脂质体/DNA溶液注射入从8周龄起以8％盐饮食喂养的13周龄Dahl-S大鼠(DIS/Eis，Eisai，雄性)的左心室(尖端和侧面部位)，注射量为4个位点各75μl(总体积为300μl)(反义组13只大鼠，有义组13只大鼠)。转染后继续用8％盐饮食喂养大鼠，并测试存活率，显示转染后30周与有义组(61.5％)相比，在反义组中存活率提高(100％)。
实施例10制备人OSF-2报道质粒10-1克隆人OSF-2基因的上游区域使用基于含有人OSF-2基因(GenBank Accession No.AL138679)上游区域的草拟序列的核苷酸序列设计的引物(10)5’-AAGAATATTAAAAGTTATTTGTGGGCAGGAGACAGATG-3’(SEQ ID NO22)和引物(11)5’-CATTTAAAAGCCTATCAAGTGTCAGGTCCACTCTC-3’(SEQ ID NO23)通过PCR筛选从插入EMBL-3载体的人基因组文库(Clontech)制备的10个大约25,000个克隆的亚库(总共约250,000个克隆)，鉴定出2个阳性亚库，使用通过上述PCR扩增的片段作为探针，使用AlkPhos DirectTM(Amersham Pharmacia)用碱性磷酸酶进行标记，通过杂交筛选这些亚库，得到2个阳性克隆人OSF-2基因#1，2。将人OSF-2基因#2中的插入片段整合入pBluescript II(Stratagene)的XhoI识别位点，得到pB-hOSFg#2，根据实施例1-5的方法对其进行部分测序。所得的克隆长度为约13.5kb，对应于人草拟序列(GenBank Accession No.AL138679，version 11)的核苷酸16397-30002，并含有人OSF-2基因的内含子2上游的区域。测定从位于起始密码子(ATG)上游约2kb的SpeI识别位点至起始密码子的全核苷酸序列。该约2 kb的核苷酸序列如SEQ ID NO24所示。与GenBank Accession No.AL138679，version 11的序列相比，该约2kb的核苷酸序列含有4个碱基的变异从SpeI识别位点开始，核苷酸764G(T)，936T(C)，1099C(T)和2106G(C)(在AL138679 version 11中的核苷酸显示于括号中)。
10-2 制备人OSF-2报道质粒使用在实施例10-1中获得的人OSF-2基因#2作为模板和引物(12)5’-TGAGCATATATCATGCTTTC-3’(SEQ ID NO25)和(13)5’-AATCATCTCGAGTCTCTCCGTTGCAGTTAGTCCCC-3’(SEQID NO26)通过PCR扩增从起始密码子上游约2kb延伸到紧靠起始密码子之前的区域。引物(13)被设计成将限制酶XhoI识别位点插入5’端，并将该扩增片段用限制酶SpeI和XhoI消化得到大约2kb的片段，然后使用连接反应试剂盒(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)将其连接到用位于荧光素酶基因上游的限制酶NheI和XhoI消化的pGL3-enhancer(Promega)载体片段，得到pGL3-hOSFgE。根据实施例1-5的方法测定插入片段的核苷酸序列以证实它与在实施例10-1中确定的核苷酸序列相同。
实施例11筛选影响人rOSF-2基因表达的化合物11-1 使用COS-1细胞进行报道基因测定将COS-1细胞以3×104细胞/孔的密度平板接种于96孔板，并置于37℃温育16-24小时，然后使用LipofectAMINE 2000试剂(GIBCO)用实施例10中所示的OSF-2报道质粒pGL3-hOSFgE瞬时转染，置于37℃温育24小时之后，更换培养基。24小时后，加入候选化合物，再过24小时后，测定荧光素酶活性。按照荧光素酶测定体系(Promega)的方案测定荧光素酶活性，并用1420多标记计数器(Wallac)检测。对含有连接至SV40启动子下游的荧光素酶基因的pGL3-control(Promega)进行类似的试验作为对照。通过这种方法筛选了多种化合物，显示2-氯腺苷5’-三磷酸四钠和腺苷地尔(N-[(2-甲基苯基)甲基]-腺苷)特异性针对OSF-2启动子而抑制荧光素酶活性。这些化合物具有以下化学结构式。
2-氯腺苷5’-三磷酸四钠 腺苷地尔(N-[(2-甲基苯基)甲基]-腺苷) 11-2 使用MC3T3-E1细胞进行表达分析将原本表达OSF-2的小鼠成骨细胞样细胞MC3TS-E1(购自RIKEN Gene Bank)以5×105细胞/孔的密度平板接种于6孔板，并将平板置于37℃温育24小时。24小时后，以30μM的浓度加入所述化合物，再过24小时后回收细胞，使用RNeasyMini(QIAGEN)从细胞制备总RNA，根据实施例3-2的方法通过PCR测定体系测定OSF-2 mRNA和内标GAPDH mRNA的表达水平(将OSF-2 mRNA的表达水平用内标GAPDH mRNA的表达水平标准化)。结果证实2-氯腺苷三磷酸四钠和腺苷地尔抑制OSF-2 mRNA的表达。
由此显示可以通过使用本发明中所示的筛选体系发现影响OSF-2基因表达的化合物。
序列表<110>SUNTORY LIMITEDSUNTORY BIOMEDICAL RESEARCH LTD.<120>心衰治疗剂<130>YCT-652<160>26<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1gttcattgaa ggtggcgatg gtc<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2gagataaaat ccctgcatgg tcct<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3cacggtcgat gacatggaca acacc<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4acggagctca gggctgaaga tg<210>5<211>3295<212>DNA<213>大鼠<400>5gaattccggg gatctcttcc tggacggagc tcagggctga agatggttcc tctcctgccc 60ttatctgctc tgctgctgct gttcctgtgt gacgttgacc ccgcaaatgc caacagttac 120tatgacaagg tcctagctca cagccgcatc aggggtcggg atcagggccc aaatgtctgt 180gccctccagc agattctggg caccaaaaag aaatacttca gctcctgtaa gaactggtat 240caaggtgcta tctgcgggaa gaaaaccact gtgctatatg aatgctgccc cggctatatg 300agaatggaag ggatgaaagg ctgcccagca gtgatgccca ttgaccatgt ttatggcacg 360ctgggcatcg tgggagccac gaccactcaa cactattctg atgtctcgaa gctcagggaa 420gagattgaag gaaaagggtc ctacacatac ttcgcgccga gtaacgaagc ttgggacaac 480ctggattccg acatccgcag aggactagag aacaatgtca atgttgagtt actgaacgct 540ttacacagcc acatggttaa taagagaatg ctaaccaagg acctgaaaca cggcatggtt 600attccttcaa tgtacaacaa tctggggctt tttatcaatc attatcccaa tggggttgtc 660actgtgaact gtgctcgagt aatccacggg aaccagattg ccacaaatgg tgttgtccat 720gtcatcgacc gtgtcctgac acaaattggc acctccatcc aagacttcat tgaagcagaa 780gatgagcttt catcattcag agcggctgcc atcacttctg accttttgga gtcccttgga 840agagacggtc acttcacact ctttgctccc accaatgagg ctttcgagaa actcccacga 900ggagtcctag aaaggatcat gggagacaaa gtggcttctg aagctctcat gaagtaccac 960atcctgaata ccctccagtg ctctgaggct atcacaggag gagcggtgtt tgagaccatg 1020gaaggaaaca ctattgaaat agggtgtgag ggagacagca tctccattaa cggaatcaag 1080atggtgaaca agaaagacat tgtgacgaag aatggtgtca tccacctgat tgatgaagtc 1140ctcattcctg attctgctaa acaagttatt gagctggctg gaaaacagca aaccactttc 1200acggacctgg tagcccagtt agggttggcg tcttctctga agccggatgg agagtacacg 1260ctgttagcgc ctgtgaacaa tgcgttctct gatgacactc tgagcatgga ccagcgcctt 1320cttaagctaa ttctgcaaaa tcacatattg aaagtaaaag tcggccttag tgatctctac 1380aatggacaga ttctggagac cattggaggc aaacaactcc gtgtcttcgt gtatcggacg 1440gctatctgca tagaaaactc atgcatggtg agaggaagca agcaggggag gaacggtgcc 1500attcacatat tccgagagat catccaaccg gcggagaagt ccctgcacga aaaactgcgc 1560caagataagc gcttcagcat cttcctcagc ctcctcgaag ctgcagatct gaaagatctt 1620ctgacacagc ccggagattg gaccttgttt gcaccaacca atgatgcctt caagggaatg 1680actaatgaag aaagggagat tctgattggg gataaaaatg ctctccaaaa catcattctt 1740taccacctga ccccaggggt ttatattgga aagggatttg aacccggagt caccaacatc 1800ctgaagacca cacagggaag caaaatctat gtgaaaggag tcaatgagac gcttttggtg 1860aatgagttga agtccaaaga atctgacatc atgacaacaa acggcgtcat tcacgttgtg 1920gacaaactcc tctatccagc agacattccg gttggaaatg atcagctctt ggaattactg 1980aacaaactga taaaatacat ccaaattaag ttcgttcgtg gcagcacctt caaagaaatc 2040cccatgactg tctatacaac taaaattata accaaactcg tggaaccaaa aattaaagtc 2100attcaaggca gtcttcagcc tattatcaaa acagaaggac ctgcaatgac gaagatccac 2160attgaaggcg agcctgactt caggctgatt aaagaaggtg aaacagtgac agaagtgatc 2220cacggagaac cagtcattaa aaagtacacc aaaatcatag acggggttcc tgttgaaata 2280actgaaaaag agacccggga agaacgcatc atcacaggtc ctgagataaa atacactagg 2340atttccacag gaggtgggga aacagaagag accctgcaga aattcttgca aaaagaggtc 2400tccaaggtca caaagttcat tgaaggtggc gatggtcact tatttgaaga tgaggcgatt 2460aaaagactgc ttcagggaga cacacctgca aagaagatac aagccaacaa aagggttcaa 2520gggtctagaa ggcgatcaag agaaggccgt tctcagtgaa aattcaaagg ccagacaaca 2580gagtttatat aatcctaaat caacaatctg atttttaagg gaaattataa gagccccatt 2640gacttcggaa tctgaaatgg caacaaacag aagctaattg tcaagcaaat ctgaacgcag 2700agttaatttg tttctgaatg agaaacatag gaaaatgata gtctcctgtg gggtaggaac 2760tgaaggaaat ataggaccat gcagggattt tatctcaatg agagaagttc tgattatatt 2820aggaatccac caaagaccat cattgtgact ggatccacac agctaagtct ttgctcagtg 2880aacatggtca agaagaggct ggaaaaaccc aaagcacaca gttacctttc catgggaggc 2940taagctatca aaagcggtgt tcagttatac aacaagcaag ccaagccacc aaattacaaa 3000cagtggtgtt acatatttct cgtgcaatgt gggtttcctg ctaaattttg ttgtttttac 3060acttgattta tatcctcgag atgattgtca tatgcttttt gcagtacaaa tgtttctctc 3120aaacatttca ataaaaacat tcttcaggta taaagagaat tacttcagac ttggtaattc 3180agaaaactca aggtttaagt taaaagtgag tttagacttt ggaataggac ttcatacctt 3240tttttattgt taacaagtac tcaataaagg aatctgaata aaaaaaacgg aattc 3295<210>6<211>838<212>PRT<213>大鼠<400>6Met Val Pro Leu Leu Pro Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu Phe Leu Cys1 5 10 15Asp Val Asp Pro Ala Asn Ala Asn Ser Tyr Tyr Asp Lys Val Leu Ala20 25 30His Ser Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu35 40 45Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Ser Cys Lys Asn
50 55 60Trp Tyr Gln Gly Ala Ile Cys Gly Lys Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu65 70 75 80Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala85 90 95Val Met Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala100 105 110Thr Thr Thr Gln His Tyr Ser Asp Val Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile115 120 125Glu Gly Lys Gly Ser Tyr Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp130 135 140Asp Asn Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Asn Asn Val Asn145 150 155 160Val Glu Leu Leu Asn Ala Leu His Ser His Met Val Asn Lys Arg Met165 170 175Leu Thr Lys Asp Leu Lys His Gly Met Val Ile Pro Ser Met Tyr Asn180 185 190Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val195 200 205Asn Cys Ala Arg Val Ile His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val210 215 220Val His Val Ile Asp Arg Val Leu Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln225 230 235 240Asp Phe Ile Glu Ala Glu Asp Glu Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala245 250 255Ile Thr Ser Asp Leu Leu Glu Ser Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr260 265 270Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val275 280 285Leu Glu Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys290 295 300Tyr His Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ala Ile Thr Gly Gly305 310 315 320Ala Val Phe Glu Thr Met Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Glu325 330 335Gly Asp Ser Ile Ser Ile Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp
340 345 350Ile Val Thr Lys Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Glu Val Leu Ile355 360 365Pro Asp Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr370 375 380Thr Phe Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ser Leu Lys385 390 395 400Pro Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser405 410 415Asp Asp Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln420 425 430Asn His Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Asn Gly435 440 445Gln Ile Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr450 455 460Arg Thr Ala Ile Cys Ile Glu Asn Ser Cys Met Val Arg Gly Ser Lys465 470 475 480Gln Gly Arg Asn Gly Ala Ile His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Gln Pro485 490 495Ala Glu Lys Ser Leu His Glu Lys Leu Arg Gln Asp Lys Arg Phe Ser500 505 510Ile Phe Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys Asp Leu Leu Thr515 520 525Gln Pro Gly Asp Trp Thr Leu Phe Ala Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys530 535 540Gly Met Thr Asn Glu Glu Arg Glu Ile Leu Ile Gly Asp Lys Asn Ala545 550 555 560Leu Gln Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Tyr Ile Gly565 570 575Lys Gly Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly580 585 590Ser Lys Ile Tyr Val Lys Gly Val Asn Glu Thr Leu Leu Val Asn Glu595 600 605Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His610 615 620Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Ile Pro Val Gly Asn Asp625 630 635 640Gln Leu Leu Glu Leu Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys645 650 655Phe Val Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Met Thr Val Tyr Thr660 665 670Thr Lys Ile Ile Thr Lys Leu Val Glu Pro Lys Ile Lys Val Ile Gln675 680 685Gly Ser Leu Gln Pro Ile Ile Lys Thr Glu Gly Pro Ala Met Thr Lys690 695 700Ile His Ile Glu Gly Glu Pro Asp Phe Arg Leu Ile Lys Glu Gly Glu705 710 715 720Thr Val Thr Glu Val Ile His Gly Glu Pro Val Ile Lys Lys Tyr Thr725 730 735Lys Ile Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr Glu Lys Glu Thr Arg740 745 750Glu Glu Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser755 760 765Thr Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Gln Lys Phe Leu Gln Lys770 775 780Glu Val Ser Lys Val Thr Lys Phe Ile Glu Gly Gly Asp Gly His Leu785 790 795 800Phe Glu Asp Glu Ala Ile Lys Arg Leu Leu Gln Gly Asp Thr Pro Ala805 810 815Lys Lys Ile Gln Ala Asn Lys Arg Val Gln Gly Ser Arg Arg Arg Ser820 825 830Arg Glu Gly Arg Ser Gln835<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7tgcaaaaaga ggtctccaag gt<210>8
<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8aggtgtgtct ccctgaagca gt<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>该序列在5’-端和3’-端分别有荧光FAM和TAMRA。
<400>9acaaagttca ttgaaggtgg cgatggtc<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10gacccgggaa gaacgcatca tc<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>11tgggtgaccc tgagaacggc cttctcttga tc<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12aggaaccatc ttcagccctg<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13gagaggaacc atcttcagcc<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14aggagaggaa ccatcttcag<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15gcaggagagg aaccatcttc<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>16agggcaggag aggaaccatc<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17cagggctgaa gatggttcct<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18gtcccgactt ctaccaagga<210>19<211>3215<212>cDNA至mRNA<213>小鼠(Mus musclus)<400>19GAATTCGCGG CCGCCGGAGC TCAGGGCTGA AG ATG GTT CCT CTC CTG CCC TTA 53Met Val Pro Leu Leu Pro Leu-20TAT GCT CTG CTG CTG CTG TTC CTG TGT GAT ATT AAC CCT GCA AAT GCC 101Tyr Ala Leu Leu Leu Leu Phe Leu Cys Asp Ile Asn Pro Ala Asn Ala-15 -10 -5AAC AGT TAC TAT GAC AAG GTC CTG GCT CAC AGC CGC ATC AGG GGT CGG 149Asn Ser Tyr Tyr Asp Lys Val Leu Ala His Ser Arg Ile Arg Gly Arg1 5 10 15GAT CAG GGC CCA AAC GTC TGT GCC CTC CAG CAA ATT CTG GGC ACC AAA 197Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys20 25 30AAG AAA TAC TTC AGC TCC TGT AAG AAC TGG TAT CAA GGT GCT ATC TGC 245Lys Lys Tyr Phe Ser Ser Cys Lys Asn Trp Tyr Gln Gly Ala Ile Cys35 40 45GGG AAG AAA ACC ACT GTG CTA TAT GAA TGC TGC CCT GGC TAT ATG AGA 293Gly Lys Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg50 55 60ATG GAA GGG ATG AAA GGC TGC CCC GCA GTG ATG CCT ATT GAC CAT GTT 341Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Met Pro Ile Asp His Val65 70 75 80TAT GGC ACG CTG GGC ATT GTG GGA GCC ACT ACC ACT CAG CAC TAC TCC 389Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr Thr Gln His Tyr Ser85 90 95GAT GTC TCG AAG CTG AGA GAA GAG ATT GAA GGA AAA GGG TCA TAC ACG 437Asp Val Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly Lys Gly Ser Tyr Thr
100 105 110TAC TTC GCG CCG AGT AAC GAG GCT TGG GAG AAC CTG GAT TCT GAC ATT 485Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Glu Asn Leu Asp Ser Asp Ile115 120 125CGC AGA GGA CTG GAG AAC AAT GTC AAT GTT GAG CTA CTG AAT GCC TTA 533Arg Arg Gly Leu Glu Asn Asn Val Asn Val Glu Leu Leu Asn Ala Leu130 135 140CAC AGC CAC ATG GTT AAT AAG AGA ATG TTA ACC AAG GAC CTG AAA CAC 581His Ser His Met Val Asn Lys Arg Met Leu Thr Lys Asp Leu Lys His145 150 155 160GGC ATG GTT ATT CCT TCA ATG TAC AAC AAT CTG GGG CTT TTT ATT AAC 629Gly Met Val Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn165 170 175CAT TAT CCC AAT GGG GTT GTC ACT GTG AAC TGT GCT CGA GTC ATC CAT 677His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Val Ile His180 185 190GGG AAC CAG ATT GCC ACA AAT GGT GTC GTC CAT GTC ATT GAC CGT GTC 725Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Asp Arg Val195 200 205CTG ACA CAA ATT GGT ACC TCC ATC CAA GAC TTC CTT GAA GCA GAA GAC 773Leu Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe Leu Glu Ala Glu Asp210 215 220GAC CTT TCA TCA TTT AGA GCA GCC GCC ATC ACC TCT GAC CTC TTG GAG 821Asp Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr Ser Asp Leu Leu Glu225 230 235 240TCC CTT GGA AGA GAT GGT CAC TTC ACG CTC TTT GCT CCC ACC AAT GAA 869Ser Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu245 250 255GCT TTC GAG AAA CTG CCA CGA GGT GTC CTA GAA AGG ATC ATG GGA GAC 917Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu Arg Ile Met Gly Asp260 265 270AAA GTG GCT TCT GAA GCT CTC ATG AAG TAC CAC ATC CTA AAT ACC CTC 965Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His Ile Leu Asn Thr Leu275 280 285CAG TGC TCT GAG GCC ATC ACT GGA GGA GCC GTG TTT GAG ACC ATG GAA 1013Gln Cys Ser Glu Ala Ile Thr Gly Gly Ala Val Phe Glu Thr Met Glu
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权利要求
1.一种心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2基因表达或OSF-2蛋白产生或OSF-2蛋白功能或OSF-2蛋白靶分子功能的物质作为活性成分。
2.一种心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2基因表达的物质作为活性成分。
3.一种心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2蛋白产生的物质作为活性成分。
4.权利要求1-3任一项所述的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2基因表达或OSF-2蛋白产生的物质是反义核苷酸序列。
5.权利要求4所述的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述反义核苷酸序列包含与如SEQ ID NO5，19，20或21所示的核苷酸序列中12或更多个连续核苷酸互补的核苷酸。
6.权利要求4所述的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述反义核苷酸序列包含至少一条选自SEQ ID NO12-16的序列。
7.权利要求1或2所述的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2基因表达的物质是以下通式(I)的化合物或其生物学上可接受的盐 其中R1代表氢原子、任选分支的烷基或其中的烷基部分可以分支的芳烷基，R2代表氢原子、卤原子或氨基，R3和R4独立地代表氢原子或酰基，或者R3和R4一起代表异亚丙基，而n代表0，1，2或3的整数。
8.权利要求1所述的心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2蛋白功能的物质作为活性成分。
9.权利要求1所述的心衰的预防剂或治疗剂，其包含抑制OSF-2蛋白的靶分子功能的物质作为活性成分。
10.权利要求8或9所述的心衰的预防剂或治疗剂，其中所述抑制OSF-2蛋白功能的物质或抑制OSF-2蛋白靶分子功能的物质是针对OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子的抗体。
11.筛选具有预防或治疗心衰作用的物质的方法，包括使合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物接触(1)具有OSF-2基因表达调控区和OSF-2基因或报道基因的细胞或体外表达体系或(2)OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子，以检测OSF-2基因或报道基因的表达水平或OSF-2蛋白或OSF-2蛋白靶分子的量。
12.权利要求11所述的方法，包括构建具有连接到报道基因翻译区上游和/或下游的OSF-2基因表达调控区的表达载体，然后培养用所述载体转染的合适的宿主细胞，将合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物加入培养的细胞，并在一段给定的时间之后检测报道基因表达水平的改变。13.权利要求11所述的方法，包括将OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子固定到支持体上，并将合成物质或基因工程物质或天然物质或其衍生物以及OSF-2蛋白的靶分子或OSF-2蛋白加到固定的OSF-2蛋白或OSF-2蛋白的靶分子，以检测结合的或未结合的OSF-2蛋白靶分子或OSF-2蛋白的量。
14.用于心衰的诊断试剂或诊断试剂盒，包括用于测定OSF-2基因的表达水平或OSF-2蛋白的产生水平的手段。
15.过量表达OSF-2基因并适于用作心衰病理模型的非人转基因动物。
16.评价或筛选能作为心衰预防剂或治疗剂的活性成分的物质的方法，其中使用权利要求15所述的非人转基因动物。
全文摘要
本发明提供了用于筛选抑制OSF－2基因表达或由其编码的蛋白的产生或功能的药物的方法以及具有这种作用的心衰治疗剂。通过监测所述基因的表达或变异或由其编码的蛋白的产生可提供用于诊断心衰的有用方法。本发明还提供了强制表达OSF－2基因的转基因动物，和使用它们研究随着心衰病变的进展基因表达或蛋白产生的改变或多种基因或蛋白的功能的方法，以及心衰的新治疗剂。
文档编号C07K14/475GK1466466SQ01816531
公开日2004年1月7日 申请日期2001年9月7日 优先权日2000年9月8日
发明者河岛佳代子, 葛城鸣门, 杉村惠二郎, 古谷真优美, 森下龙一, 一, 二郎, 优美, 门 申请人:第一三得利制药株式会社, 株式会社第一三得利生物医学研究所