治疗和诊断Her-2/neu相关恶性肿瘤的组合物和方法

专利名称：治疗和诊断Her-2/neu相关恶性肿瘤的组合物和方法
发明
背景技术：
领域本发明一般涉及癌症(尤其是乳腺癌)的治疗和诊断。更具体地，本发明涉及至少含有Her-2/Neu蛋白的免疫原性片断的多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸。这些多肽和多核苷酸可用于药物组合物(如疫苗)以及其它用于诊断和治疗人类恶性肿瘤的组合物。
背景技术：
尽管财力和人力资源投资巨大，但癌症仍然是死亡的主要原因之一。例如，癌症是年龄在35到74岁之间的妇女死亡的主要原因。乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤，而且乳腺癌的发病率仍在增长。九分之一的妇女诊断有此疾病。治疗乳腺癌的标准方法集中在组合采用手术、放射疗法和化学疗法。这些方法对某些恶性肿瘤获得了一些惊人的成功。但是，这些方法并没有对所有恶性肿瘤都成功，而且当在某一阶段以后试图治疗时乳腺癌常常不可治愈。需要预防和治疗的替代方法。
恶性肿瘤的共同特征是细胞生长不受控制。癌细胞似乎经历了从正常表型到能自主生长的恶性表型的转化过程。体细胞基因的扩增和过表达被认为是导致正常细胞向癌性细胞转化的共同基本事件。致癌基因编码的恶性表型特征在细胞分裂过程中传递给转化细胞的子代细胞。
与癌基因有关的研究已经鉴定了至少40个在恶性细胞中起作用、并负责转化或与转化有关的癌基因。根据基因产物(如癌基因表达的蛋白质)的推测功能或定位，癌基因被分为不同类群。
据信癌基因是正常细胞生理某些方面所必需的。在这点上，HER-2/neu癌基因是癌基因的酪氨酸蛋白激酶家族的成员，并与表皮生长因子受体有高度的同源性。推测HER-2/neu在细胞生长和/或分化中起作用。HER-2/neu似乎通过由本质上正常的基因产物的增加表达或失控表达引起的定量机制诱导恶性肿瘤。
HER-2/neu(p185)是HER-2/neu癌基因的蛋白产物。在许多癌症(包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和血癌)中HER-2/neu基因被扩增，HER-2/neu蛋白被过表达。HER-2/neu与恶性转化有关。发现它在50％-60％导管原位癌(ductal in situ carcinoma)和20％-40％的全部乳腺癌以及相当大比例的卵巢、前列腺、结肠和肺中发生的腺癌中存在。HER-2/neu不仅与恶性表型有密切联系，而且与恶性肿瘤的进攻性(aggressiveness)有密切联系，这在四分之一的全部侵袭性乳腺癌中发现。HER-2/neu过表达与乳腺癌和卵巢癌的预后差有关。HER-2/neu是相对分子量为185kD的跨膜蛋白，大约长1255个氨基酸(aa)。它具有与表皮生长因子受体(EGFR)有40％同源性的约645个氨基酸的细胞外结合域(ECD)、高度疏水的跨膜锚定域(TMD)和与EGFR有80％同源性的大约580个氨基酸的羧基端细胞质域(CD)。
由于与HER-2/neu有关的癌症的治疗中存在的困难，本领域需要改进的化合物和组合物。本发明满足了该需要，并进一步提供其它相关优点。
发明概述一方面，本发明提供具有免疫原性的Her-2/neu多肽和多核苷酸组合物，也就是说，它们能引起免疫应答，特别是体液和/或细胞免疫应答，如本文进一步所述。在一个优选实施方案中，该组合物是包含SEQ ID NO3所示的HLA-B44限制的、天然加工的Her-2/neu表位的多肽序列，或编码该多肽的多核苷酸组合物。
本发明进一步提供这里公开的多肽和/或多核苷酸序列的片断、变体和/或衍生物，其中，所述片断、变体和/或衍生物优选具有这里所示多肽序列免疫原活性(immunogenic activity)水平的至少约50％，优选至少约70％，更优选至少约90％的免疫原性水平。
本发明还提供包含所述多核苷酸的表达载体和转化或转染了这种表达载体的宿主细胞。
在其它方面，本发明提供包含上述多肽或多核苷酸和生理可接受载体的药物组合物。
在本发明的有关方面，提供用于预防或治疗的药物组合物，例如疫苗组合物。这些组合物一般含有本发明的免疫原性多肽或多核苷酸和免疫刺激剂，如佐剂。
本发明还提供含有下列成分的药物组合物(a)可与本发明的多肽或其片段特异结合的抗体或其抗原结合片段；和(b)生理学可接受的载体。
在其它方面，本发明提供含有下列成分的药物组合物(a)表达如上所述的多肽的抗原呈递细胞，和(b)药学可接受的载体或赋形剂。示例性抗原呈递细胞包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和B细胞。
在相关方面，提供含有下列成分的药物组合物(a)表达如上所述的多肽的抗原呈递细胞，和(b)免疫刺激剂。
在其它方面，本发明还提供含有至少一个如上所述多肽的融合蛋白，以及编码这种融合蛋白的多核苷酸，它们一般是采用药物组合物的形式，例如疫苗组合物，含有生理学可接受的载体和/或免疫刺激剂。融合蛋白可含有如此处所述的多个免疫原性多肽或其部分/变体，还可含有一个或多个有助于多肽表达、纯化和/或免疫原性的多肽片段。
在其它方面，本发明提供刺激患者免疫应答，优选地刺激病人的T细胞应答的方法，包括施用Her-2/neu多核苷酸组合物，优选编码ICD区域中一些或全部的Her-2/neu多核苷酸，更优选至少编码HLA-B44限制的、天然加工的SEQ ID NO3所示Her-2/neu表位的多核苷酸。患者可能患有癌症，在这种情况中，该方法提供对疾病的治疗，或者可以预防性地处置认为有患该病危险的患者。
在其它方面，本发明还提供从生物样品中除去肿瘤细胞的方法，包括使生物样品接触可与本发明的多肽特异反应的T细胞，其中在足以从样品中去除表达该多肽的细胞的条件下和时间内进行此接触步骤。
在有关方面，提供抑制患者癌症发展的方法，包括对患者施用如上所述处理的生物样品。
在其它方面，还提供刺激和/或扩增对于本发明的多肽特异的T细胞的方法，包括在足以刺激和/或扩增T细胞的条件下和时间内，使T细胞接触下列成分中的一种或多种(i)如上所述的多肽；(ii)编码这种多肽的多核苷酸；和/或(iii)表达这种多肽的抗原呈递细胞。也提供含有如上所述制备的T细胞的分离的T细胞群体。
在其它方面，本发明提供抑制患者癌症发展的方法，包括对患者施用有效量的如上所述的T细胞群体。
本发明还提供抑制患者癌症发展的方法，包括下列步骤(a)将自患者分离的CD4+和/或CD8+T细胞与下列成分之一或多种一起孵育(i)含有此处公开的多肽的至少免疫原性部分的多肽；(ii)编码这种多肽的多核苷酸；和(iii)表达这种多肽的抗原呈递细胞；和(b)对患者施用有效量的增殖T细胞，从而抑制患者癌症的发展。在对患者施用前，增殖的细胞可以但不必须克隆化。
在其它方面，本发明提供确定患者是否患有癌症(优选癌)的方法，包括(a)使从患者获得的生物样品接触能与上述多肽结合的结合剂；(b)检测样品中可与该结合剂结合的多肽的量；和(c)将多肽的量与预定的截断值相比较，从而确定患者是否患有癌症。在优选实施方案中，结合剂是抗体，更优选地是单克隆抗体。
在其它方面，本发明也提供监测患者癌症进展的方法。这些方法包括下列步骤(a)使第一时间点从患者获得的生物样品接触能与上述多肽结合的结合剂；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的量；(c)使用在随后的时间点从患者获得的生物样品重复步骤(a)和(b)；和(d)比较步骤(b)和(c)中检测的多肽的量，从而监测患者癌症的进展。
在其它方面，本发明提供可与上述多肽结合的抗体，如单克隆抗体，以及含有这些抗体的诊断试剂盒。也提供含有一种或多种上述寡核苷酸探针或引物的诊断试剂盒。
在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献均在此完整地引入作为参考，就象每一篇文献单独引入一样。
附图简述

图1显示了51Cr释放实验的结果，说明用AdV致敏的CD8+T细胞系的ICD反应性。正常供体PBMC用感染了表达ICD的重组AdV的DC致敏。该实验是标准的4小时51Cr释放实验；靶标是未感染的或感染了表达ICD或EGFP的重组痘苗病毒的自体B-LCL，如图所标示。
图2显示了在MCF-7肿瘤细胞上进行表面Her-2/neu的流式细胞计量分析的结果。细胞用抗表面Her-2/neu的mAb(单克隆抗体)染色，然后用与PE缀合的(conjugated)第二兔抗小鼠Ig抗体染色。用流式细胞术分析标记的细胞。平均荧光强度值如下MCF-7＝32；MCF-7+RTV-H2N＝165；MCF-7+Ad-H2N＝683；MCF-7+RTV-H2N+Ad-H2N＝651。
图3说明了EL4-Her-2/neu的生长被编码Her-2/neu的质粒DNA的接种所抑制。在第0天(d0)和21天(d21)用pVR101 Her-2/neu，pVR1012-ECD或pVR1012-ICD(100μg)免疫(i.m.(肌内))小鼠(每组5只)。在第35天(d35)皮下用200,000个EL4-Her-2/neu细胞攻击小鼠。在肿瘤攻击后监测肿瘤大小25天。
图4说明了EL4-Her-2/neu的生长被Her-2/neu ICD而不被ECD蛋白亚单位的接种所部分抑制。在第0天(d0)和21天(d21)用Montanide 720中的Her-2/neu ICD或Her-2/neu ECD蛋白质(50μg)免疫(s.q.)小鼠(每组4只)。在第35天(d35)皮下用200,000个EL4-Her-2/neu细胞攻击小鼠。在肿瘤攻击后监测肿瘤大小25天。
序列标识SEQ ID NO1描述了编码Her-2/neu蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO2描述了Her-2/neu蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO3描述了Her-2/neu的天然加工的HLA-B44限制性表位的氨基酸序列，相当于Her-2/neu蛋白质的第1021-1030位氨基酸。
SEQ ID NO4是克隆HICD_CT_His_coding_region的测定的cDNA。
SEQ ID NO5是克隆HICD_plus_8_HIS的测定的cDNA。
SEQ ID NO6是克隆HICD_native_coding_region的测定的cDNA。
SEQ ID NO7是克隆HICD_in_pPDM_coding_sequence的测定的cDNA。
SEQ ID NO8是SEQ ID NO4公开的cDNA所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是SEQ ID NO6公开的cDNA所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO10是SEQ ID NO7公开的cDNA所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO11是SEQ ID NO5公开的cDNA所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO12是克隆68499(17D5 T细胞克隆的TCRβ链)的测定的cDNA。
SEQ ID NO13是克隆68498(17D5 T细胞克隆的TCRα链)的测定的cDNA。
SEQ ID NO14是SEQ ID NO12公开的cDNA所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO15是SEQ ID NO13公开的cDNA所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO16是引物PDM-44的DNA序列。
SEQ ID NO17是引物PDM-45的DNA序列。
SEQ ID NO18是引物PDM-591的DNA序列。
SEQ ID NO19是引物PDM-592的DNA序列。
SEQ ID NO20是引物PDM-72的DNA序列。
SEQ ID NO21是引物PDM-61的DNA序列。
SEQ ID NO22是引物TCRVα-16 5’的DNA序列。
SEQ ID NO23是引物TCRα3’的DNA序列。
SEQ ID NO24是引物TCRVβ-14. 5’的DNA序列。
SEQ ID NO25是引物TCRβ3’的DNA序列。
发明详述本发明一般涉及组合物及其在癌症(特别是乳腺癌)治疗和诊断中的应用。如下进一步所述，本发明的示例性组合物包含但不限于Her-2/neu多肽，特别是免疫原性多肽，编码这些多肽的多核苷酸，抗体和其它结合剂，抗原呈递细胞(APC)和免疫系统细胞(例如T细胞)。
除非特别指明与之不同，本发明的实施将使用常规病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学方法和本领域技术内的重组DNA技术，为了举例说明的目的，其中许多技术在下面描述。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如，Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第二版，1989)；Maniatis等人，《分子克隆实验室指南》(Molecular CloningALaboratory Manual)(1982)；《DNA克隆使用手册》(DNA CloningA Practical Approach)第I卷和第II卷(D.Glover编写)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait编写，1984)；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.Hames和S.Higgins编写，1985)；《转录和翻译》(Transcription and Translation)(B.Hames和S.Higgins编写，1984)；《动物细胞培养》(AnimalCell Culture)(R.Freshney编写，1986)；Perbal，《分子克隆实践指南》(A practical Guide to Molecular Cloning)(1984)。
无论在上文还是在下文引用的所有公开文本、专利和专利申请，在此均完整引用作为参考。
在本说明书和附加权利要求书中使用时，单数形式包括复数形式，除非该内容清楚地指明。
Her-2/neu多肽组合物在此使用时，术语“多肽”为其普通含义，即，是一种氨基酸序列。多肽不限于特定长度的产物；因此，多肽的定义中包括肽、寡肽和蛋白质，这些术语在此可交换使用，除非另外特别指明。该术语也并非是指或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域所知的自然发生的和非自然发生的其它修饰。多肽可以是完整的蛋白质，或其亚序列。本发明中的特定目的多肽是含有表位(即主要负责多肽的免疫原性并且能引发免疫应答的抗原决定簇)的氨基酸亚序列。
如上所述，本发明涉及在温血动物中引发和增强对HER-2/neu癌基因表达的蛋白质产物的免疫(包括对恶性肿瘤)的组合物和方法，其中扩增的HER-2/neu基因与恶性肿瘤有关联。扩增的HER-2/neu基因与恶性肿瘤相关联并不要求该基因的蛋白表达产物存在于该肿瘤上。例如，蛋白质表达产物的过表达可能与肿瘤的起始有关，但蛋白质表达可能随后消失。本发明的一个实施方案涉及体内引发或增强对表达Her-2/neu的癌细胞的有效免疫应答。
更具体地，一方面，本发明公开基于以下事实提供多肽，即，HER-2/neu基因的蛋白表达产物的特定部分(HER-2/neu多肽)可以被胸腺依赖性淋巴细胞(以下称“T细胞”)识别，因此，可以利用免疫T细胞应答预防或治疗其中这种蛋白质正在或曾经过量表达的恶性肿瘤。
在这方面，特别优选的多肽组合物来自Her-2/neu蛋白质的ICD区，优选含有SEQ ID NO2的大约第676-1255位氨基酸区域的一些或全部，更优选至少含有SEQ ID NO3所示天然加工的HLA-B44限制性Her-2/neu表位。
一般地，CD4+T细胞群被认为在被特定抗原刺激时通过释放淋巴因子而起辅助者/诱导者的作用；但是，CD4+细胞的一个亚群可充当细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。类似地，CD8+T细胞被认为通过直接溶解抗原靶标而起作用；但是，在许多情况下，它们能分泌淋巴因子以提供辅助细胞或DTH功能。尽管可能功能重叠，但CD4和CD8表型标志与结合II类或I类MHC抗原的肽的识别相联系。II类或I类MHC背景下抗原的识别要求CD4+和CD8+T细胞应答不同抗原或不同情况下呈递的相同抗原。免疫原性肽与II类MHC抗原结合最常发生在被抗原呈递细胞摄取的抗原上。因此，CD4+T细胞一般识别已经位于肿瘤细胞外部的抗原。相反，在正常情况下，肽与I类MHC的结合仅发生在在胞质溶胶中存在和由靶标自身合成的蛋白质上，外部环境中的蛋白质被排除在外。这种情况的一个例外是外源肽与以高浓度存在于细胞外的精确的I类结合基序的结合。因此，CD4+和CD8+T细胞具有十分不同的功能，并倾向于识别由抗原正常情况下存在位置所反应的不同抗原。
正如本发明所公开的，HER-2/neu癌基因表达的蛋白质产物的多肽部分被T细胞识别。循环的HER-2/neu多肽被降解成肽片断。来自该多肽的肽片断与主要组织相容性复合物(MHC)抗原结合。通过与MHC抗原结合的肽在细胞表面的展示和宿主T细胞对肽加自身MHC抗原之组合的识别，HER-2/neu多肽(包括恶性细胞上表达的那些)对T细胞将是免疫原性的。T细胞受体的强烈特异性使得各T细胞能区分有单个氨基酸不同的肽。
在对来自该多肽的肽片断的免疫应答过程中，表达对该肽-MHC复合物有高亲和性结合的T细胞受体的T细胞将结合此肽-MHC复合物，并由此被活化和诱导增殖。在初次遇到肽时，少量的免疫T细胞将分泌淋巴因子、增殖和分化成效应和记忆T细胞。将在体内发生初次免疫应答，但体外难以检测。记忆T细胞后来遇到相同抗原将导致更快更强的免疫应答。再次应答将在体内或体外发生。体外应答可以通过测量再次接触抗原的T细胞群的增殖、细胞因子产生程度或细胞毒活性的产生来容易地评价。T细胞群应答特定抗原而大量增殖被认为指示先前被抗原接触或致敏。
本发明的某些化合物一般包含指导这些肽表达的HER-2/neu多核苷酸分子，其中该DNA分子可以存在于病毒或其它递送载体中。如上所述，本发明多肽包括仍具有刺激免疫应答的能力的变体。这些变体包括天然多肽的各种结构形式。例如，由于存在可电离的氨基和羧基基团，HER-2/neu多肽可以是酸式盐或碱式盐的形式，或可以是中性形式。还可以通过氧化或还原对各氨基酸残基进行修饰。
本发明还包括糖基化或未糖基化的HER-2/neu多肽。酵母或哺乳动物表达系统中表达的多肽可以在分子量和糖基化方式上与天然分子类似或稍有差别，这取决于表达系统。例如，在细菌如大肠杆菌中表达编码多肽的DNA将典型地提供未糖基化的分子。真核蛋白质的N-糖基化位点的特征在于氨基酸三联体Asn-A1-Z，其中A1是除Pro之外的任何氨基酸，而Z是ser或Thr。具有失活的N-糖基化位点的HER-2/neu多肽变体可以通过本领域普通技术人员已知的技术(如寡核苷酸合成和连接或位点特异性诱变技术)来制备，并属于本发明的范围。或者，可以将N-连接的糖基化位点添加至HER-2/neu多肽之上。
一般地，可以使用编码HER-2/neu多肽的基因组或cDNA克隆来获得该蛋白质。编码全长HER-2/neu的基因组序列显示在SEQ ID NO1中，推导的氨基酸序列显示在SEQ ID NO2中。可以通过从适当的表达文库中筛选表达HER-2/neu蛋白质的克隆获得这些克隆。文库的制备和筛选一般可以使用本领域普通技术人员已知的方法来进行，例如Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratories，ColdSpring Harbor，NY，1989(在此引入作为参考)中描述的方法。简而言之，可以将噬菌体表达文库铺板，并转移至滤膜。然后可以将滤膜和检测试剂一起孵育。在本发明上下文中，“检测试剂”是能够和HER-2/neu蛋白质结合然后可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法中的任一种检测的任何化合物。典型的检测试剂含有与报道基团偶联的“结合剂”，如A蛋白、G蛋白、IgG或凝集素。优选的报道基团包括酶、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、化学发光基团、荧光基团和生物素。更优选该报道基团是辣根过氧化物酶，其可以通过和底物如四甲基联苯胺或2，2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸一起孵育进行检测。分离含有表达HER-2/neu蛋白质的基因组或cDNA序列的噬菌斑并通过本领域普通技术人员已知的技术纯化。适宜的方法可以参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，ColdSpring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989。
在另一实施方案中，本发明多肽组合物还可以包含与抗本发明多肽，尤其是具有此处公开的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片断或变体而产生的T细胞和/或抗体有免疫反应活性的一种或多种多肽。
在本发明的另一实施方案中，提供包含一种或多种能够引发如下T细胞和/抗体的多肽的多肽，所述T细胞和/或抗体与此处描述的一种或多种多肽、或此处公开的多核苷酸序列中所含的连续核酸序列编码的一种或多种多肽、或它们的免疫原性片断或变体、或和这些序列中的一个或多个在中等至高等严紧条件下杂交的一个或多个核酸序列编码的一种或多种多肽有免疫反应性。
另一方面，本发明提供多肽片断，其包含此处给出的多肽组合物(例如，SEQ ID NOs2-3，8-11和14-15中显示的那些多肽组合物，或序列SEQ ID NOs1，4-7和12-13中所示多核苷酸序列编码的那些多肽组合物)的至少约5、10、15、20、25、50或100个或更多个连续氨基酸(包括所有的中间长度)。
另一方面，本发明提供本文描述的多肽组合物的变体。本发明一般所包括的多肽变体典型地表现出在全长范围内与本文给出的多肽序列有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的一致性(按下述方式确定的)。
在一个优选实施方案中，本发明提供的多肽片断和变体与能够和本文具体给出的多肽反应的抗体和/或T细胞具有免疫反应性。
本文中，术语多肽“变体”是指典型地与本文具体公开的多肽相差一个或多个替换、缺失、添加和/或插入的多肽。该变体可以是天然的或可以通过合成方式产生，例如通过修饰一个或多个上述本发明多肽序列并按本文所述和/或利用本领域熟知的众多技术中的任一种评价它们的免疫原活性来产生。
例如，本发明多肽变体的一些例子包括其中一个或多个部分(如N端前导序列或跨膜域)已被除去的那些。变体的其它例子包括已从成熟蛋白质的N端和/或C端除去一小部分(例如1-30个氨基酸，优选5-15个氨基酸)的变体。
在许多情况下，变体将含有保守替代。“保守替代”是指一种氨基酸替换为具有相似性质的另一种氨基酸，以致肽化学领域的技术人员可以预期该多肽的二级结构和亲水性质基本上未发生改变。如上所述，可以对本发明多核苷酸和多肽的结构进行修饰而仍获得编码具有期望特征(如具有免疫原性特征)的变体或衍生多肽的功能性分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以构建本发明多肽的等价物，或甚至是改良的免疫原性变体或部分时，本领域技术人员将典型地按照表1来改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
例如，可以将蛋白质结构中的某些氨基酸替换为其它氨基酸而不明显丧失与诸如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点等结构的相互作用结合能力。由于蛋白质的生物学功能活性是由蛋白质的相互作用能力和性质定义的，故可以在蛋白质序列，当然也可以在其DNA编码序列中进行某些氨基酸序列替换，而仍获得具有相似性质的蛋白质。因此，可以设想可能对本文公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行各种改变而不使其明显丧失生物学用途或活性。
表1氨基酸密码子丙氨酸Ala AGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys CUGC UGU天冬氨酸 Asp DGAC GAU谷氨酸Glu EGAA GAG苯丙氨酸 Phe FUUC UUU甘氨酸Gly GGGA GGC GGG GGU组氨酸His HCAC CAU异亮氨酸 Ile IAUA AUC AUU赖氨酸Lys KAAA AAG亮氨酸Leu LUUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 Met MAUG天冬酰胺 Asn NAAC AAU脯氨酸Pro PCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Gln QCAA CAG精氨酸Arg RAGA AGG CGA CGC CGG CGU丝氨酸Ser SAGC AGU UCA UCC UCG UCU苏氨酸Thr TACA ACC ACG ACU缬氨酸Val VGUA GUC GUG GUU色氨酸Trp WUGG酪氨酸Tyr YUAC UAU在实施这些改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。氨基酸亲水指数对赋予蛋白质相互作用生物学功能所具有重要性是本领域通常明了的(Kyte和Doolittle，1982，在此并入作为参考)。氨基酸的相对亲水特性被认为与最终蛋白的二级结构有关，而这又限定了蛋白质与其它分子(如，酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等)的相互作用。每个氨基酸均基于其疏水性和电荷特征被分配了一个亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些值是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域已知，可以将某些氨基酸替换为具有类似亲水指数或分值的其它氨基酸而仍导致具有相似生物学活性的蛋白质，即仍获得生物学功能等价蛋白。在实施这些改变时，亲水指数相差在±2范围内的氨基酸替换是优选的，尤其优选±1范围内的替换，甚至更优选±0.5范围内的替换。本领域也明了，相似氨基酸的替换可以基于亲水性有效地实现。美国专利4,554,101(特此完整地引入此处作为参考)描述了蛋白质的最大局部平均亲水性(由相邻氨基酸的亲水性控制)与蛋白质的生物学性质相关。
美国专利4,554,101中详细描述了分配给氨基酸残基的如下亲水性值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，可以将一种氨基酸替换为具有相似亲水性值的另一种氨基酸而仍获得生物学等价物，尤其是免疫学等价蛋白。在这些改变中，优选两者的亲水性值相差在±2范围内的氨基酸替换，尤其优选±1范围内的替换，甚至更优选±0.5范围内的替换。
如上所述，因此氨基酸替换一般以氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等为基础。考虑了前述各种性质的替换的实例是本领域技术人员已知的，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
此外，还可以对任何多肽作进一步修饰以增加其体内稳定性。可能的修饰包括，但不限于，在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸或2’O-甲基而非磷酸二酯键；和/或包括非常规碱基，如肌苷、queosine和wybutosine，以及乙酰基-、甲基-、硫基-和其它修饰形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
还可以基于氨基酸残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性进行氨基酸替换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性头部基团和相似的亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以进行保守改变的其它氨基酸组包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)csy，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。变体还可以，或者是作为备择方案含有非保守改变。在优选实施方案中，变体多肽与天然序列相差5个或更少的氨基酸替换、缺失或添加。还(或者是作为可选择方案)可以通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质有微小影响的氨基酸来修饰变体。
如上所述，多肽可以在蛋白质的N端含有信号(或前导)序列，该序列在翻译时或在翻译后引导该蛋白质的转移。多肽也可以与接头或其它序列偶联，以便于多肽的合成、纯化或鉴定(例如聚-His)，或增强该多肽与固体载体的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区偶联。
当比较多肽序列时，如果按如下所述进行比对达到最大一致性时两种序列的氨基酸序列相同，则称这两种序列“一致”。两种序列的比较一般通过在比较窗口中比较序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。在此使用时，“比较窗口”是指具有至少约20个，通常30至约75个，40至约50个连续位置的片段，在该片段中可以在一个序列和具有相同数目连续位置的参考序列最佳比对后对这两个序列进行比较。
为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。该程序体现了以下文献中所述的几个比对策略Dayhoff，M.O.(1978)蛋白质的进化改变模型-检测远缘关系的矩阵，见Dayhoff，M.O.(编)《蛋白质序列和结构图集》(Atlas of ProteinSequence and Structure)，国立生物化学研究基金会，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358页；Hein J.(1990)比对和系统发生的统一方法，第626-645页，《酶学方法》(Methods in Enzymology)第183卷，Academic Press公司，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《数值分类学-数值分类学的原理和实践》(Numerical Taxonomy-the Principles and Practiceof Numerical Taxonomy)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80726-730。
或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对Smith和Waterman的局部一致性算法((1982)Add.APL.Math 2482)；Needleman和Wunsch的一致性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性查询方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目测。
适合于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如这里所述参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。对于氨基酸序列，可以采用评分矩阵计算累积分。当该比对累积分从其最大获得值降低了量X；由于积累一或多个负分残基比对，该累积分达到零或更低；或任一序列达到末端时，终止每个方向上字符命中(word hits)的延伸。BLAST算法的参数W、T和X确定了比对的敏感度和速度。
在一个优选方法中，“序列一致性百分数”通过在至少有20个位置的比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了获得两个序列的最佳比对，与参考序列(不含有插入或缺失)相比，比较窗中的该多肽序列部分可以含有20％或更少，通常5-15％，或10-12％的插入或缺失(即间隔区)。该百分数的计算方法是确定这两个序列中出现相同氨基酸残基的位置的数目以获得匹配位置数，用该匹配位置数除以参考序列的总位置数(即窗的大小)，然后将所获结果乘以100以产生该序列一致性百分数。
在其它说明性实施方案中，多肽可以是融合多肽，其含有如此处所述的多个多肽，或者含有至少一个此处所述的多肽和无关序列，如已知的肿瘤蛋白。例如，融合配偶体(fusion partner)可以帮助提供T辅助细胞表位(免疫学融合配偶体)，优选地可被人体识别的T辅助细胞表位，或者可以有助于以高于原始重组蛋白的产量表达该蛋白质(表达增强子)。某些优选的融合配偶体既是免疫学的又是增强表达的融合配偶体。可以选择其它融合配偶体，以提高多肽的溶解度，或使多肽能导向希望的胞内区室。再有其它融合配偶体包括有利于多肽纯化的亲和标签。
融合多肽一般可以利用包括化学偶联(conjugation)在内的标准技术制备。优选地，融合多肽表达为一种重组多肽，使得在表达系统中的生产水平高于非融合多肽。简言之，编码多肽成分的DNA序列可以分开装配，并连接到合适的表达载体中。编码一种多肽成分的DNA序列的3’端在有或没有肽接头的情况下与编码第二多肽成分的DNA序列的5’端连接，使序列的阅读框同步。这导致翻译为保留了两种成分多肽的生物活性的一种融合多肽。
可以采用肽接头序列将该第一和第二多肽成分分开一段足够长的距离，以保证每一个多肽都折叠成其二级和三级结构。该多肽接头序列可以采用本领域熟知的标准技术并入融合蛋白中。适合的肽接头序列可以基于以下因素进行选择(1)其能够采取柔性伸展构象；(2)不能采取能与该第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可以和该多肽的功能性表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于该接头序列中。可以用作接头的有用氨基酸序列包括那些公开于如下文献中的序列Maratea等，基因(Gene)4039-46，1985；Murphy等，美国国家科学院院刊838258-8262，1986；美国专利4,935,233和美国专利4,751,180。接头序列一般可以长1-约50个氨基酸。当该第一和第二多肽具有能够用以分开这些功能域并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，则无需接头序列。
将这些相连的DNA序列可操作地与适当的转录或翻译调节元件连接在一起。负责DNA表达的调节元件仅置于编码该第一多肽的DNA序列的5’端。同样，终止翻译所必需的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码该第二多肽的DNA序列的3’端。
融合多肽能含有如此处所述的多肽和无关免疫原性蛋白质，如一种能引发回忆反应的免疫原性蛋白质。这类蛋白质的例子包括破伤风、结核和肝炎蛋白(参见，例如，Stoute等人，New Engl.J.Med.33686-91，1997)。
在一个优选实施方案中，免疫融合配偶体来源于分枝杆菌属的种，如来自结核分枝杆菌的Ra12片段。美国专利申请60/158,585描述了Ra12组合物和方法提高异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的用途，其公开内容在此完整引用作为参考。简言之，Ra12是指一个多核苷酸区，它是结核分枝杆菌MTB32A核酸的亚序列。MTB32A是一种分子量为32KD的丝氨酸蛋白酶，由结核分枝杆菌的毒力株和无毒力株的基因编码。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已经描述(例如，美国专利申请60/158,585；参见Skeiky等人，Infection and Immun.(1999)673998-4007，在此引用作为参考)。MTB32A编码序列的C端片段高水平表达，在纯化过程中保持为可溶性多肽。而且，Ra12可以提高与之融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。一种优选的Ra12融合多肽含有对应于MTB32A的氨基酸残基192-323的14KD的C端片段。其它优选的Ra12多核苷酸一般含有编码Ra12多肽之一部分的至少约15个连续核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约200个核苷酸，或至少约300个核苷酸。Ra12多核苷酸可以含有天然序列(即，编码一种Ra12多肽或其部分的内源序列)，或者可以含有该序列的一种变体。Ra12多核苷酸变体可以含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，使得编码的融合多肽的生物活性基本上不低于含有天然Ra12多肽的融合多肽。这些变体优选地显示与编码天然Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列有至少约70％的一致性，更优选地至少约80％的一致性，最优选地至少约90％的一致性。
在其它优选实施方案中，免疫融合配偶体来源于蛋白D——革兰氏阴性菌B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza)的一种表面蛋白(WO 91/18926)。优选地，蛋白D衍生物含有该蛋白质的大约前三分之一(例如，N端前100-110个氨基酸)，蛋白D衍生物可以脂化。在某些优选实施方案中，在N端含有脂蛋白D融合配偶体的前109个残基，以产生含有其它外源T细胞表位的多肽，并提高在大肠杆菌中的表达水平(从而作为表达增强子)。脂质尾确保抗原向抗原呈递细胞最佳递呈。其它融合配偶体包括来源于流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。一般使用N端81个氨基酸，但也可使用含有T辅助细胞表位的不同片段。
在另一个实施方案中，免疫融合配偶体是被称作LYTA的蛋白质或其部分(优选地C端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，该菌合成一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，被称作酰胺酶LYTA(由LytA基因编码；Gene 43265-292，1986)。LYTA是一种自溶素，可特异性降解肽聚糖主链中的某些键。LYTA蛋白的C端域负责与胆碱或某些胆碱类似物(如DEAE)的亲和力。这种性质已用于发展用于融合蛋白表达的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。在氨基端含C-LYTA片段的杂种蛋白的纯化已有描述(参见，Biotechnology10795-798，1992)。在一个优选实施方案中，LYTA的重复部分可以掺入融合蛋白中。在C端区中发现一个开始于残基178的重复部分。一个特别优选的重复部分含有残基188-305。
另一个示例性实施方案涉及融合多肽，和编码它们的多核苷酸，其中融合配偶体含有能将多肽导向内体/溶酶体区室的导向信号，如美国专利号5,633,234所述。本发明的免疫原性多肽当与这种导向信号融合时，将更有效地与MHC II类分子结合，从而使该多肽特异的CD4+T细胞的体内刺激增强。
本发明的多肽利用本领域周知的多种合成和/或重组技术制备，后者在下面有进一步的描述。一般少于约150个氨基酸的多肽、部分和其它变体能利用本领域技术人员周知的技术通过合成法产生。在一个说明性实例中，利用可商业获得的固相技术，如Merrifield固相合成法合成这些多肽，其中向延长的氨基酸链中连续添加氨基酸。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。多肽自动合成装置可购自供应商，如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City，CA)，可以按照使用说明书操作。
本发明的多肽组合物(包括融合多肽)通常是分离的。“分离的”多肽是从其原始环境中分离出的多肽。例如，如果将一种自然存在的蛋白质或多肽与自然系统中的一些或全部共存物质分开，则该蛋白质或多肽是分离的。优选地，这些多肽也是纯化的，例如，纯度至少约90％，更优选地至少约95％，最优选地至少约99％。
多核苷酸组合物在其它方面，本发明提供Her-2/neu多核苷酸组合物。术语“DNA”和“多核苷酸”在此基本上可交换使用，是指已经分离不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。“分离的”在此使用时是指多核苷酸基本上不含其它编码序列，而且DNA分子不含无关编码DNA的较大部分(如大染色体片段或其它功能基因或多肽编码区)。当然，是指最初分离的DNA分子，不排除后来人工加到该片段中的基因或编码区。
本领域技术人员应当理解，本发明的多核苷酸组合物能包含基因组序列、基因组外和质粒编码的序列，和较小的工程化基因片段，它们表达或者可以被改造表达蛋白质、多肽、肽等。这些片段可以是自然分离的，或是人工合成修饰的。
熟练技术人员也应当认识到，本发明的多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子可包括含有内含子并一一对应于DNA分子的HnRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。本发明的多核苷酸中可以但不必须存在其它编码或非编码序列，多核苷酸可以但不必须与其它分子和/或支持材料连接。
多核苷酸可以含有天然序列(即，编码本发明的多肽/蛋白质或其部分的内源序列)，或可以含有编码该序列的变体或衍生物(优选地是一种免疫原性变体或衍生物)的序列。
因此，根据本发明的另一方面，提供含有下列多核苷酸序列一部分或全部的多核苷酸组合物SEQ ID NO1、4-7和12-13所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO1、4-7和12-13所示多核苷酸序列的互补序列，和它们的简并变体。在某些优选实施方案中，此处所述的Her-2/neu多核苷酸序列编码Her-2/neu蛋白质ICD区域的免疫原性表位序列，优选SEQ ID NO3中所示的表位序列。
在其它有关实施方案中，本发明提供与本文公开的序列基本一致的多核苷酸变体，例如，通过用此处所述的方法(例如使用标准参数的BLAST分析，如下所述)与本发明的多核苷酸序列比较，具有至少70％的序列一致性，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些。本领域技术人员将认识到，可以适当地调节这些值，以便在考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等之后，确定两种核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。
多苷酸变体一般含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，优选地使变体多核苷酸编码的多肽的免疫原性基本上不低于此处具体给出的多核苷酸序列编码的多肽。应当理解，术语“变体”也包括异种来源的同源基因。
在其它实施方案中，本发明提供含有以下序列各种不同长度的连续序列段的多核苷酸片段，该序列与这里公开的一种或多种序列相同或互补。例如，本发明提供这样的多核苷酸它们含有这里公开的一种或多种序列的至少约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000个或更多连续核苷酸，以及所有中间长度。应当理解，“中间长度”在本文中是指介于所述值之间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1000等等之间的所有整数。
在本发明的另一个实施方案中，提供在中度到高度严紧条件下能与此处所述多核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交的多核苷酸组合物。杂交技术在分子生物学领域众所周知。为举例说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤20分钟两次。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严格性，如通过改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严格杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。
在某些优选实施方案中，上述多核苷酸，如多核苷酸变体、片段和杂交序列，编码与此处所述Her-2/neu多肽序列有免疫学交叉反应性的多肽。在其它优选实施方案中，这些多核苷酸编码免疫原活性水平为此处所述多肽序列的至少约50％、优选地至少约70％、更优选地至少约90％的多肽。
本发明的多核苷酸或其片段，无论编码序列本身的长度如何，都可以与其它DNA序列(如启动子、聚腺苷酸化信号、其它限制酶位点、多克隆位点、其它编码片段等)结合，使其总长度可能大大改变。因此预期可以使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受限于制备和在预期重组DNA方案中的应用的容易程度。例如，总长度为约10000、约5000、约3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有中间长度)的示例性多核苷酸片段考虑可用于本发明许多实施方案中。
当比较多核苷酸序列时，如果在如下所述比对最大对应性时两种序列的核苷酸序列相同，则称这两种序列“一致”。两种序列的比较一般通过在比较窗口中比较序列，鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。在此使用时，“比较窗口”是指至少约20个，通常30至约75个，优选地40至约50个连续位置的片段，其中可以在最佳比对两种序列后将一种序列与连续位置数量相同的参照序列相比较。
序列的最佳比对可以利用Lasergene生物信息学软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序进行，使用缺省参数。该程序包括下列参考文献中所述的几种比对方案Dayhoff，MO(1978)“蛋白质进化改变模型-用于检测远缘关系的矩阵”，在Dayhoff，M.O.编写的《蛋白质序列与结构图谱》中，国家生物医学研究基金会，华盛顿，第5卷，增3，345-358；Hein J.(1990)“比对与系统发生的统一方法”，626-645，《酶学方法》，183卷，学院出版社，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《数量分类学——数量分类学原理与实践》，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726-730。
或者，序列的最佳对比也可以如下进行利用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2482的局部一致性算法、利用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的一致性比对算法、利用Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的相似性检索法、通过这些算法的计算机实现方法(GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA，Wisconsin遗传学软件包，遗传学计算机组(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过观察。
适于确定百分序列一致性和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，分别在Altschul等人(1977)Nucl.AcidsRes.253389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410描述。例如能以此处所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0，确定本发明的多核苷酸的百分序列一致性。进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心公开获得。在一个示例性实施例中，对于核苷酸序列，能用参数M(匹配残基对的奖分＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。在下列情况时每个方向的字段命中延伸停止累积比对得分从获得的最大值降低数值X时；由于一个或多个负分残基比对的积累，累积得分为0或更低时；或到达每个序列的末端时。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用11的字长(W)、10的期望值(E)，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)比对，(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，比较两条链。
优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两种最佳比对的序列测定“百分序列一致性”，其中与用于最佳比对两种序列的参照序列(不含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸序列的部分可含有20％或更低、通常5％-15％或10％-12％的添加或缺失(即缺口)。此百分数的计算方法是测定在两种序列中存在相同核酸碱基的位置数，得到匹配的位置数，匹配位置数除以参照序列中的位置总数(即窗口大小)，结果乘以100，得到百分序列一致性。
本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码此处所述的多肽的核苷酸序列。其中一些与任一天然基因的核苷酸序列有最小同源性。但是，本发明特别涉及由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。另外，含有此处所述多核苷酸序列的基因的等位基因也在本发明的范围之内。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变(如核苷酸的缺失、添加或置换)而改变的内源基因。得到的mRNA和蛋白质可能，但不必须具有改变的结构或功能。等位基因可用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定。
因此，在本发明的另一个实施方案中，利用诱变法(如位点特异性诱变)制备此处所述多肽的免疫原性变体和/或衍生物。使用该方法，能通过诱变编码多肽的基本多核苷酸进行多肽序列的特定修饰。这些技术提供制备和检测序列变体的直接方法，例如，通过向多核苷酸中引入一个或多个核苷酸序列改变，掺入前述一个或多个考虑。
位点特异性诱变可产生突变体，这是通过使用编码带有希望突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列，以及足够量的相邻核苷酸，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，在横穿的缺失连接处两侧形成稳定的双链来进行的。可以在选择的多核苷酸序列中应用突变，以提高、改变、降低、修饰或以其它方式改变多核苷酸本身的性质，和/或改变编码的多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。
在本发明的某些实施方案中，发明者想诱变公开的多核苷酸序列以改变编码的多肽的一种或多种性质，如多肽疫苗的免疫原性。位点特异性诱变技术在本领域中众所周知，广泛用于产生多肽和多核苷酸的变体。例如，位点特异性诱变通常用于改变DNA分子的特定部分。在这些实施方案中，使用一般含有大约14-25个核苷酸的引物，待改变序列连接处两侧有约5-约10个残基。
本领域技术人员应当理解，位点特异性诱变技术通常使用存在单链和双链形式的噬菌体载体。在位点特异性诱变中有用的典型载体包括载体，如M13噬菌体。这些噬菌体易于购得，它们的使用为本领域技术人员所周知。在定点诱变中也通常使用双链质粒，这省去了从质粒向噬菌体转移目的基因的步骤。
此处所述的定点诱变通常如下进行首先获得单链载体，或者解开双链载体的两条链，在载体的序列中包含编码希望的多肽的DNA序列。制备(通常是合成)含有希望的突变序列的寡核苷酸引物。该引物然后与单链载体退火，与DNA聚合酶(如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段)反应，以完成含突变链的合成。于是形成异源双链，其中一条链编码原始的未突变序列，第二条链含有希望的突变。然后用该异源双链载体转化合适的细胞，如大肠杆菌细胞，选择包含具有突变序列排列的重组载体的克隆。
利用定点诱变制备选择的肽编码DNA片段的序列变体提供了一种产生可能有用的种类的方法，并非意在限制，因为存在获得肽的序列变体和编码它们的DNA序列的其它方法。例如，可以用诱变剂(如羟胺)处理编码希望的肽序列的重组载体，获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节见Maloy等人，1994；Segal，1976；Prokop和Bajpai，1991；Kuby，1994；Maniatis等人，1982所述，在此均引用作为参考。
在此使用时，术语“寡核苷酸指导的诱变法”是指模板依赖的方法和载体介导的繁殖，它导致特异核酸分子的浓度比最初的浓度提高，或者可检测信号的浓度提高(如扩增)。在此使用时，术语“寡核苷酸指导的诱变法”是指涉及引物分子依赖模板延长的方法。术语依赖模板的方法是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列遵循众所周知的互补碱基配对原则(参见，例如，Watson，1987)。载体介导的方法一般包括向DNA或RNA载体中导入核酸片段，载体的克隆性扩增，扩增的核酸片段的回收。美国专利号4,237,224中给出了这些方法的实例，在此完整引用作为参考。
在制备本发明的多肽变体的另一种方法中，如美国专利号5,837,458所述，可以使用循环序列重组(recursive sequencerecombination)。在该方法中，进行重组和筛选或选择的重复循环，以“进化”本发明的多核苷酸变体，它们具有例如提高的免疫原性。
在本发明的其它实施方案中，此处所述的多核苷酸序列能方便地用作核酸杂交的探针或引物。因而，含有至少约15个连续核苷酸的序列区(其与此处公开的15个核苷酸长的连续序列有相同序列或与之互补)的核酸片段预计将特别有用。更长的相同或互补的连续序列，例如约20、30、40、50、100、200、500、1000(包括所有中间长度)、甚至可达全长的序列，在某些实施方案中也是有用的。
这些核酸探针与目的序列特异性杂交的能力将使它们能用于检测特定样品中互补序列的存在。然而，也可设想有其它用途，如序列信息的应用，用于制备突变种引物，或可用于制备其它遗传构建体的引物。
具有由与此处公开的多核苷酸序列相同或互补的大约10-14、15-20、30、50乃至100-200个核苷酸的连续核苷酸段(也包括中间长度)组成的序列区的多核苷酸分子特别可用作杂交探针，例如用于Southern和Northern印迹。这将能分析基因产物或其片段，无论是在不同细胞类型中还是在不同细菌细胞中。片段的总大小以及互补延伸片段的大小最终取决于特定核酸片段的预期用途。较小的片段一般用于杂交实施方案，其中连续互补区的长度可能不同，如约15-约100个核苷酸，但是也可以根据希望检测的互补序列的长度，使用较大的相邻互补序列段。
利用长度约为15-25个核苷酸的杂交探针能形成既稳定又具选择性的双链分子。通常优选在长度超过15个碱基的序列段上含有连续互补序列的分子，以提高杂合体的稳定性和选择性，从而提高获得的特异杂种分子的质量和程度。通常优选设计含有15-25个连续核苷酸乃至更长(希望时)的基因互补序列段的核酸分子。
杂交探针可以选自此处公开的任一序列的任一部分。所需要的只是检查希望用作探针或引物的此处所述的序列，或者这些序列的连续部分，长度从约15-25个核苷酸到包括全长序列。探针和引物序列的选择可取决于多种因素。例如，可能希望使用朝向全序列末端的引物。
例如可以通过化学法直接合成片段，容易地制备小的多核苷酸片段，通常应用自动寡核苷酸合成仪。也可通过应用核酸增殖技术，如美国专利4,683,202(在此引用作为参考)的PCRTM技术，通过向用于重组生产的重组载体中导入选择的序列，通过分子生物学领域技术人员公知的其它重组DNA技术，获得这些片段。
可以根据与完整基因或目的基因片段的互补片段选择性形成双链分子的能力，使用本发明的核苷酸序列。根据目的用途，典型地希望使用不同的杂交条件实现探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，一般希望使用相对严格的条件形成杂合体，例如，选择相对低盐和/或高温的条件，如约0.02M-约0.15M的盐和约50℃-约70℃的温度产生的条件。这种选择性条件允许极少的(如果有的话)探针与模板或靶链之间的错配，特别适用于分离有关序列。
当然，对于某些用途，例如，在希望利用可与基本模板杂交的突变引物链制备突变体时，一般需要较低的严格(严格性降低)杂交条件形成异源双链。在这些情况中，可能希望使用0.15M-约0.9M的盐和约20℃-约55℃的温度。从而能把交叉杂交种容易地确定为相对于对照杂交的阳性杂交信号。在任何情况下，一般认为，通过添加含量提高的甲酰胺——用来以与温度升高相同的方式使杂合双链去稳定，能使条件更加严格。因此，杂交条件能容易地操作，一般是根据希望的结果进行选择的方法。
多核苷酸鉴定、表征和表达可以使用多种成熟技术中的任一种(一般参见，Sambrook等，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，1989，和其它类似参考文献)鉴定、制备和/或操作本发明的多核苷酸组合物。
许多依赖模板的方法可用来扩增样品中存在的靶序列。最著名的扩增方法之一是聚合酶链反应(PCRTM)，在美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159中有详细描述，均在此引用作为参考。简言之，在PCRTM中，制备两条与靶序列相对互补链上的区域互补的引物序列。向反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。如果样品中存在靶序列，引物将与靶序列结合，聚合酶将通过加入核苷酸使引物沿靶序列延伸。提高和降低反应混合物的温度，延伸的引物就可从靶序列上分离下来，形成反应产物，过量的引物将与靶序列和反应产物结合，该过程重复进行。为了确定扩增的mRNA的量，优选地可以进行反转录和PCRTM扩增过程。聚合酶链反应方法在本领域众所周知。
其它许多依赖模板的方法在本领域已知并可使用，其中许多是PCRTM扩增技术的变型。例如，这些方法包括连接酶链反应(称为LCR)，如欧洲专利申请公开号320,308和美国专利号4,883,750所述；Qβ复制酶，如PCT国际专利申请公开号PCT/US87/00880所述；链置换扩增(SDA)和修复链反应(RCR)。英国专利申请号2202328和PCT国际专利申请公开号PCT/US89/01025还描述了其它扩增方法。其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)(PCT国际专利申请公开号WO 88/10315)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR。欧洲专利申请公开号329,822描述了一种核酸扩增方法，它包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)。PCT国际专利申请公开号WO 89/06700描述了一种核酸序列扩增方法，它是基于启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssRNA”)杂交，随后该序列的许多RNA拷贝转录。其它扩增方法如“RACE”(Frohman，1990)和“单向PCR”(Ohara，1989)也为本领域技术人员所周知。
利用众所周知的技术，本发明的多核苷酸的扩增部分可用来从适当的文库(例如肿瘤cDNA文库)中分离全长基因。在这些技术中，用一种或多种多核苷酸探针或适于扩增的引物筛查文库(cDNA或基因组文库)。优选地，按大小选择文库，使之包含较大的分子。为了鉴定基因的5’和上游区，也优选随机引物文库。为了获得内含子和延伸的5’序列，优选基因组文库。
对于杂交技术，部分序列可以用众所周知的技术标记(例如通过切口平移或用32P末端标记)。通过用标记探针与含有变性菌落(或含有噬斑的菌苔)的滤纸杂交，筛查细菌或噬菌体文库(参见，Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，冷泉港实验室，冷泉港，NY，1989)。筛选并扩增杂交菌落或噬斑，分离DNA进一步分析。例如，可以使用来自部分序列的引物或来自载体的引物进行PCR，分析cDNA克隆，确定其它序列的含量。可产生限制酶切图谱和部分序列，鉴定一种或多种重叠克隆。然后可利用标准技术确定完整序列，这可能包括产生一系列缺失克隆。然后将产生的重叠序列装配为一个连续序列。利用众所周知的技术，通过连接合适的片段，产生全长cDNA分子。
或者，还能利用如上所述的扩增技术由部分cDNA序列获得全长编码序列。一种这样的扩增技术是反向PCR(参见，Triglia等人，Nucl.Acids Res.168186，1988)，它使用限制酶产生已知基因区中的一条片段。然后通过分子内连接环化该片段，在使用来源于已知区的趋异引物的PCR中用作模板。在一种备选方法中，通过利用接头序列的引物和对已知区域特异的引物扩增，可得到与部分序列相邻的序列。通常利用相同的接头引物和已知区域特异的第二条引物，对扩增的序列进行第二轮扩增。WO 96/38591描述了该方法的一种变型，它使用两条引物，起始从已知序列以相反方向延伸。另一种这样的技术被称为“快速cDNA末端扩增”或RACE。该技术包括利用可与polyA区或载体序列杂交的内部引物和外部引物鉴定位于已知序列5’和3’的序列。其它技术包括捕获PCR(Lagerstrom等人，PCR Methods Applic.1111-119，1991)和步移PCR(Parker等人，Nucl.Acids Res.193055-60，1991)。也可利用其它扩增方法获得全长cDNA序列。
在本发明的其它实施方案中，可以在重组DNA分子中使用编码本发明的多肽或融合蛋白或其功能相当物的多核苷酸序列或其片段，指导该多肽在适当宿主细胞中表达。由于遗传密码固有的简并性，可能产生编码基本上相同或功能相当的氨基酸序列的其它DNA序列，这些序列可用来克隆和表达特定多肽。
本领域技术人员应当理解，在某些情况下产生含有非自然存在的密码子的多肽编码核苷酸序列是有利的。例如，能选择特定原核或真核宿主优选的密码子，来提高蛋白质表达的速度，或产生具有希望的特性(如半衰期长于由自然存在的序列产生的转录物)的重组RNA转录物。
而且，也能利用本领域周知的方法改造本发明的多核苷酸序列，以期为了多种原因改变多肽编码序列，包括但不限于基因产物克隆、加工和/或表达的改变。例如，可以利用通过随机片段化及基因片段和合成寡核苷酸的PCR再装配的DNA改组改造核苷酸序列。另外，也可利用定点诱变插入新的限制位点，改变糖基化模式，改变密码子偏倚性，产生剪接变体或引入突变，等等。
在本发明的另一个实施方案中，天然、修饰或重组的核酸序列可以与异源序列连接，使之编码一种融合蛋白。例如，为了从肽库筛选多肽活性的抑制剂，可有利地编码能被购得的抗体识别的嵌合蛋白。也可改造融合蛋白，使之在多肽编码序列与异源蛋白质序列之间含有一个酶切位点，以便将该多肽从异源部分上切下并纯化。
可以利用本领域众所周知的化学方法整个或部分地合成编码希望的多肽的序列(参见，Caruthers，M.H.等人，(1980)Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.215-223，Horn，T.等人，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)。或者，利用化学方法合成多肽的氨基酸序列或其一部分也可产生蛋白质本身。例如，肽合成能用多种固相技术进行(Roberge，J.Y.等人(1995)Science 269202-204)，自动合成例如可用ABI 43A肽合成仪(Perkin Elmer，Palo Alto，CA)完成。
一种新合成的肽可以用制备型高效液相层析(例如Creighton，T.(1983)《蛋白质，结构和分子原理》WH Freeman and Co.，纽约，N.Y.)或本领域使用的其它类似技术充分纯化。合成肽的组成可通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解法)证实。此外，在直接合成过程中也可改变多肽的氨基酸序列或其任一部分，和/或利用化学方法与其它蛋白质的序列或其任一部分组合，产生一种变体多肽。
为了表达希望的多肽，编码多肽或功能相当物的核苷酸序列可以插入适当的表达载体中，即，含有插入的编码序列转录和翻译所需元件的载体。可以利用本领域技术人员周知的方法构建含有编码目的多肽的序列和适当转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。例如，Sambrook，J.等人，(1989)《分子克隆实验室指南》，冷泉港实验室，Plainview，NY，和Ausubel，F.M.等人(1989)《现代分子生物学方法》，John Wiley &Sons，纽约，N.Y.描述了这些技术。
可利用大量表达载体/宿主系统含有和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)转化的昆虫细胞；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区——增强子、启动子、5’和3’非翻译区——它们与宿主细胞蛋白质相互作用，实现转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能不同。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适当转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当克隆于细菌系统中时，可以使用诱导型启动子，如PBLUESCRIPT噬粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRI，Gaithersburg，MD)等的杂合lacZ启动子。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果必须产生含有多个拷贝的多肽编码序列的细胞系，可以方便地使用含有适当选择性标记、基于SV40或EBV的载体。
在细菌系统中，可以根据表达的多肽的目的用途选择许多表达载体。例如，当需要大量时，例如为了诱生抗体，可以使用指导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体。这些载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码目的多肽的序列可以与β-半乳糖苷酶的氨基端Met的序列和随后的7个残基连接于载体中，产生杂种蛋白；pIN载体(van Heeke，G和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)；等等。也可以利用pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)表达外源多肽，作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。这些融合蛋白通常是可溶的，通过吸附于谷胱甘肽-琼脂糖珠，随后在谷胱甘肽存在下洗脱，易于从裂解的细胞中纯化。这些系统产生的蛋白质可设计为包含肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切位点，以便能随意从GST部分释放克隆的目的多肽。
对于酵母，酿酒酵母，可以使用许多含有组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。综述见Ausubel等人(见上文)和Grant等人(1987)Methods Enzymol.153516-544。
在使用植物表达载体时，编码多肽的序列的表达可以由大量启动子中的任一种驱动。例如，可以单独使用病毒启动子，如CaMV的35S和19S启动子，或与TMV的ω前导序列组合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6307-311)。或者，也可使用植物启动子，如RUBISCO的小亚基或热休克启动子(Coruzzi，G.等人(1984)EMBO.J.31671-1680；Broglie，R.等人(1984)Science 224838-843；Winter，J.等人(1991)Results Probl.Cell Differ.1785-105)。这些构建体能通过直接DNA转化或病原体介导的转染导入植物细胞中。这些技术在大量综述中有描述(参见，例如，Hobbs，S.或Murry，L.E.《McGraw Hill科学技术年鉴》(1992)McGraw Hill，纽约，N.Y.；191-196页)。
也可以利用昆虫系统表达目的多肽。例如，在这样一种系统中，用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。编码该多肽的序列可以克隆到病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子控制下。多肽编码序列的成功插入将使多角体蛋白基因失活，产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后可用该重组蛋白感染如草地夜蛾细胞或夜蛾幼虫，其中可以表达目的多肽(Engelhard，E.K.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.913224-3227)。
在哺乳动物宿主细胞中，通常可以使用多种基于病毒的表达系统。例如，在使用腺病毒作为表达载体时，编码目的多肽的序列可以连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒/转录翻译复合物中。在非必需E1或E3区中插入病毒基因组可以用来获得能在感染的宿主细胞中表达该多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，T.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659)。另外，也可利用转录增强子如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子增强在哺乳动物宿主细胞中的表达。
也可用特异起始信号实现编码目的多肽的序列的更有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入适当表达载体中时，可不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在只插入编码序列或其部分时，应当使用外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应当在正确的阅读框内，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是不同来源的，包括自然的和合成的。含有适于所用特定细胞系统的增强子，如文献中所述的增强子(Scharf，D.等人(1994)ResultsProbl.Cell Differ.20125-162)，可提高表达效率。
另外，也可以根据调节插入序列表达或以希望的方式加工表达蛋白的能力，选择宿主细胞株。多肽的这类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。也可以利用切割蛋白质的“前原”形式的翻译后加工促进正确的插入、折叠和/或功能。可以选择不同的宿主细胞，如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，它们具有翻译后活性的特殊细胞机器和特有机制，来确保外源蛋白质的正确修饰和加工。
为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常优选稳定的表达。例如，可以用在相同或不同载体上含有病毒来源的复制起点和/或内源表达元件和选择性标记基因的表达载体转化稳定表达目的多核苷酸的细胞系。在载体导入后，细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转移到选择性培养基中。选择性标记的目的在于提供对选择的抗性，它的存在允许培养和回收成功表达导入序列的细胞。稳定转化的细胞的抗性克隆可以用适于该细胞类型的组织培养技术增殖。
许多筛选系统可用来回收转化的细胞系。包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Wowy，I.等人(1990)Cell 22817-23)基因，它们分别能在tk.sup-或aprt.sup.-细胞中使用。抗代谢物、抗生素或除草剂抗性也能用作选择根据；例如，赋予氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；赋予氨基糖苷类、新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F.等人(1981)J.Mol.Biol.1501-4)；和分别赋予chlorsulfuron和膦丝菌素乙酰转移酶抗性的als或pat(Murry，同上文)。也描述了其它选择性基因，例如trpB，它允许细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51)。应用可见标记受到欢迎，如花色素苷、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS、萤光素酶及其底物萤光素，它们不仅广泛用于鉴定转化子，而且用于定量由特定载体系统引起的瞬时或稳定蛋白质表达的量(Rhodes，C.A.等人(1995)Methods Mol.Biol.55121-131)。
尽管标记基因表达的存在/不存在提示也存在目的基因，但是它的存在和表达可能需要证实。例如，如果在标记基因序列中插入编码多肽的序列，能根据标记基因功能的缺乏鉴定含有这些序列的重组细胞。或者，标记基因也能与多肽编码序列串联置于一个启动子控制下。由诱导或选择引起的标记基因的表达通常也表明串联基因的表达。
或者，含有并表达希望的多核苷酸序列的宿主细胞可用本领域技术人员周知的多种方法鉴定。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，包括如基于膜、溶液或芯片的技术，用于核酸或蛋白质的检测和/或定量。
利用产物特异的多克隆或单克隆抗体检测和测定多核苷酸编码产物的多种方法在本领域周知。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。利用与特定多肽上两个不干扰表位有反应性的单克隆抗体、基于单克隆的双向免疫测定法对于某些用途可能是优选的，但是也可使用竞争结合测定。Hampton，R.等人(1990；《血清学方法，实验室手册》，APS出版社，St Paul.Minn.)和Maddox，D.E.等人(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)描述了这些及其它测定法。
许多标记和结合技术为本领域技术人员所知，可以在多种核酸和氨基酸测定中使用。为检测多核苷酸相关序列产生标记的杂交或PCR探针的方法包括寡聚物标记、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。或者，这些序列或其任一部分也可克隆到一个载体中，用于产生mRNA探针。这些载体在本领域周知，可商业获得，并且可以用来通过加入适当RNA聚合酶(如T7、T3或SP6)和标记的核苷酸在体外合成RNA探针。这些方法可以用多种商品试剂盒进行。可以应用的合适的报道分子或标记物包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或发色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
用目的多核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适于从细胞培养物中表达和回收蛋白质的条件下培养。根据序列和/或所用的载体，重组细胞产生的蛋白质可以分泌或包含于细胞内。本领域技术人员应当理解，含有本发明的多核苷酸的表达载体可以设计为含有信号序列，该信号序列引导编码的多肽通过原核或真核细胞膜分泌。其它重组构建可用来将编码目的多肽的序列与编码有助于可溶性蛋白质纯化的多肽域的核苷酸序列连接。这些便于纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽，如允许在固定金属上纯化的组氨酸-色氨酸分子，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白A域，在FLAGS延伸/亲和纯化系统(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)中使用的域。在纯化域与编码的多肽之间含有可切割的连接序列(如因子XA或肠激酶(Invitrogen.San Diego，Calif.)特异序列)有利于纯化。一种这样的表达载体用于表达含有目的多肽和在硫氧还蛋白或肠激酶酶切位点之前编码6组氨酸残基的核酸的融合蛋白。组氨酸残基有利于在如Porath，J.等人(1992，Prot.Exp.Purif.3263-281)所述的IMIAC(固定金属离子亲和层析)上纯化，而肠激酶酶切位点提供了从融合蛋白中纯化希望的多肽的方法。Kroll，D.J.等人(1993；DNA Cell Biol.12441-453)讨论了含有融合蛋白的载体。
除了重组生产方法外，还可以利用固相技术通过直接肽合成产生本发明的多肽及其片段(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。蛋白质合成可以利用手工技术或自动进行。自动合成可以用例如Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现。此外，也可以利用化学法分别化学合成不同片段，然后组合，产生全长的分子。
抗体组合物、其片段及其它结合剂根据另一方面，本发明还提供结合剂，如抗体及其抗原结合片段，它们显示与此处公开的肿瘤多肽或与其部分、变体或衍生物免疫学结合。如果一种抗体或其抗原结合片段与本发明的多肽以可检测的水平反应(例如在ELISA测定中)，而在类似条件下不与无关多肽可检测地反应，则称其可与该多肽“特异结合”、“免疫学结合”和/或是“免疫反应性的”。
在此使用时，免疫结合通常是指在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白特异的抗原之间发生的非共价作用。免疫结合作用的强度和亲和力能用相互作用的解离常数(Kd)表示，其中较小的Kd表示较大的亲和力。选择的多肽的免疫结合性质能用本领域周知的方法定量。一种这样的方法需要测定抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向同样影响该速率的几何参数(geometric parameters)。因此，通过计算浓度及结合和解离的实际速率能确定“形成速率常数(on rateconstant)”(Kon)“解离速率常数(off rate constant)”(Koff)。Koff/Kon之比能消除与亲和力无关的所有参数，因而等同于解离常数Kd。参见Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59439-473。
抗体的“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链( “H”)和轻链(“L”)N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链V区内的三个非常趋异的区段被称为“超变区”，它们分散于被称为“构架区”或“FR”的多个保守侧翼区段之间。因此术语“FR”是指在免疫球蛋白超变区之间和与之相邻处自然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个超变区和重链的三个超变区在三维空间上彼此相对排列，形成一个抗原结合表面。该抗原结合表面互补于结合抗原的三维表面，每个重链和轻链的三个超变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
利用此处所述的典型测定法，结合剂还能区分患有或未患癌症(如乳腺癌)的患者。例如，可与肿瘤蛋白结合的抗体或其它结合剂优选地在至少约20％的疾病患者中，更优选地在至少约30％的患者中产生表明存在癌症的信号。或者，或此外，该抗体将在至少约90％的无癌症个体中产生表明未患病的阴性信号。为了确定一种结合剂是否满足这一要求，可以如此处所述测定患有或未患癌症的患者(用标准临床试验确定)的生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检)中是否存在能与该结合剂结合的多肽。优选地，应当测定统计学显著数量的患有或未患疾病的样品。每种结合剂都应满足以上标准；然而，本领域技术人员应当认识到，为了提高灵敏度，可组合使用结合剂。
满足以上要求的任何试剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是含或不含肽成分的核糖体，RNA分子或多肽。在一个优选实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。抗体可用本领域技术人员所知的多种技术制备。参见，例如，Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，冷泉港实验室，1988。通常能用细胞培养技术产生抗体，包括此处所述的单克隆抗体的产生方法，或通过抗体基因转染合适的细菌和哺乳动物细胞宿主，产生重组抗体。在一种技术中，首先用含多肽的免疫原注射任一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)中。在该步骤中，本发明的多肽可不加修饰作为免疫原。或者，特别是对于相对较短的多肽，如果多肽与一种载体蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白)连接，可引发较强的免疫应答。优选地按照包括一次或多次加强免疫的预定方案，对动物宿主注射免疫原，并且定期对动物采血。然后利用与适当固体载体偶联的多肽，通过亲和层析法，从这些抗血清中纯化该多肽特异的多克隆抗体。
目的抗原性多肽特异的单克隆抗体可用Kohler和Milstein，Eur，J.Immunol.6511-519，1976的技术及其改进方法制备。简言之，这些方法包括制备能产生具有希望特异性(即与目的多肽的反应性)的抗体的无限增殖化细胞系。例如，可以用从如上所述免疫的动物中获得的脾细胞产生这些细胞系。然后通过例如与骨髓瘤细胞融合配偶体融合，优选地与免疫动物同源的骨髓瘤细胞融合配偶体融合，使脾细胞无限增殖化。可以使用多种融合技术。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可以与非离子型去污剂结合几分钟，然后以低密度接种于支持杂种细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基中。一种优选的筛选技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)筛选。经足够的时间后，通常1至2周，观察到杂种集落。选择单集落，检测其培养上清液对多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。另外，也可以利用多种技术提高产量，如向合适的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹膜腔中注射杂交瘤细胞系。然后从腹水或血液中收集单克隆抗体。可以利用常规技术，如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提，从抗体中除去杂质。本发明的多肽可在纯化方法(如亲和层析步骤)中使用。
许多治疗上有用的分子在本领域已知，它们含有能显示抗体分子的免疫结合性质的抗原结合位点。蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子，产生几个片段，其中两个(“F(ab)”片段)均含有一个含有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能切割IgG分子，产生几个片段，包括含有两个抗原结合位点的“F(ab’)2”片段。“Fv”片段能通过优先蛋白切割IgM、在极少数情况中切割IgG或IgA免疫球蛋白分子产生。然而，Fv片段更常见地是利用本领域周知的重组技术产生。Fv片段包含非共价VH:VL异二聚体，它含有一个抗原结合位点，后者保留原始抗体分子的许多抗原识别和结合能力。Inbar等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692659-2662；Hochman等人(1976)Biochem 152706-2710；Ehrlich等人(1980)Biochem194091-4096。
单链Fv(“sFv”)多肽是一种共价连接的VH∷VL异二聚体，它从包括通过编码肽的接头连接起来的VH编码基因和VL编码基因的基因融合物表达而来。Huster等Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16)5879-5883。已经描述了许多方法鉴别化学结构用于将天然聚集但化学上分离的轻和重多肽链从抗体V区转化成将折叠为基本上类似于抗原结合位点的三维结构的sFv分子。参见美国专利5,091,513和5,132,405，Huston等；和美国专利4,946,778，Ladner等。
上述每一种分子都含有重链和轻链CDR组，后者分别插入重链与轻链FR组之间，FR组提供对CDRS的支持，并确定CDR相对于彼此的空间联系。在此使用时，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个超变区。这些区域从重链或轻链的N端起，分别被称为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含6个CDR，含有来自每个重链和轻链V区的CDR组。含有一个CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在此被称为“分子识别单位”。对大量抗原-抗体复合物的结晶分析证明，CDR的氨基酸残基形成与结合抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单位主要负责抗原结合位点的特异性。
在此使用时，术语“FR组”是指4种侧翼氨基酸序列，它们构成重链或轻链V区的CDR组CDR的框架。某些FR残基可接触结合抗原；然而，FR主要负责将V区折叠为抗原结合位点，特别是直接与CDRS相邻的FR残基。在FR内，某些氨基酸残基和某些结构特征非常保守。在这点上，所有V区序列都含有一个约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠为结合位点时，CDR表现为凸出的环形基序，形成抗原结合表面。一般认为存在保守的FR结构区，它们影响CDR环折叠为某些“典型”结构，而无论精确的CDR氨基酸序列如何。另外，已知某些FR残基参与非共价域间接触，这稳定了抗体重链和轻链的相互作用。
已经描述了含有来自非人类免疫球蛋白的抗原结合位点的大量“人源化”抗体分子，包括嵌合抗体，其含有与人类恒定域融合的啮齿动物V区和相关CDR(Winter等人(1991)Nature 349293-299；Lobuglio等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220-4224；Shaw等人(1987)J Immunol.1384534-4538；Brown等人(1987)Cancer Res.473577-3583)，在与适当人类抗体恒定域融合之前嫁接到人支持FR中的啮齿动物CDR(Riechmann等人(1988)Nature332323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 2391534-1536；Jones等人(1986)Nature 321522-525)和重组镶饰啮齿动物FR支持的啮齿动物CDR(1992年12月23日公布的欧洲专利申请号519,596)。这些“人源化”分子设计为使对啮齿动物抗人抗体分子的不希望的免疫应答降至最低，这种应答限制这些部分在人类受体中的治疗用途的持续时间和有效性。
在此使用时，术语“镶饰FR(veneered FRs)”和“重组镶饰FR”是指将例如啮齿动物重链或轻链V区的FR残基选择性置换为人类FR，以期产生含有抗原结合位点、基本上保留全部天然FR多肽折叠结构的异种分子。镶饰(veneering)技术基于这一认识抗原结合位点的配体结合特征主要由抗原结合表面内重链和轻链CDR组的结构和相对位置决定。Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59439-473。因此，抗原结合特异性只能在如下情况下保持在人源化抗体中，其中谨慎保留CDR结构、它们彼此之间的相互作用和与其余V区结构域的相互作用。利用镶饰技术将免疫系统容易遇到的外部(例如溶剂可达的)FR残基选择性替换为人类残基，产生含有弱免疫原性或基本上无免疫原性的镶饰表面的杂种分子。
镶饰方法利用可获得的人类抗体可变域的序列数据库(Kabat等人汇编，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》第4版(美国卫生与人类部，美国政府印刷所，1987))，Kabat数据库的更新版和其它可获得的美国和国外数据库(核酸和蛋白质数据库)。V区氨基酸的溶剂可及性能由人和鼠抗体片段的已知三维结构推断。镶饰鼠抗原结合位点一般包括两个步骤。首先，将目的抗体分子可变域的FR与由上述来源获得的人可变域的相应FR序列相比较。然后将同源性最大的人类V区与相应的鼠氨基酸逐个残基地比较。利用本领域周知的重组技术将鼠FR中不同于人类相应残基的残基替换为人类部分中存在的残基。只对至少部分暴露(溶剂可及)的部分进行残基变换，在替换对V区结构域的三级结构可能有明显影响的氨基酸残基(如脯氨酸、甘氨酸和带电氨基酸)时加以注意。
这样，产生的“镶饰”鼠抗原结合位点保留鼠CDR残基，与CDR基本相邻的残基，确定为掩盖或大部分掩盖(溶剂不可及)的残基，认为参与重链与轻链域非共价(例如静电和疏水)接触的残基，被认为影响CDR环“典型”三级结构的FR保守结构区的残基。这些设计标准用来制备重组核苷酸序列，将鼠抗原结合位点的重链和轻链的CDR组合到类似人类的FR中，它能用来转染哺乳动物细胞，用于表达显示鼠抗体分子的抗原特异性的重组人类抗体。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体可与一种或多种治疗剂偶联。就此而言，合适的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素及其衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。优选的药物包括氨甲喋呤和嘧啶和嘌呤类似物。优选的分化诱导剂包括佛波醇酯和丁酸。优选的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单胞菌内毒素、志贺菌毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。
治疗剂可与合适的单克隆抗体直接或间接(例如通过连接基团)偶联(例如共价键合)。当治疗剂和抗体均含有能彼此反应的取代基时，它们的直接反应是可能的。例如，一个上的亲核基团，如氨基或巯基，能与另一个上的含羰基基团(如酐或酰基卤)，或含有容易离去的基团(如卤化物)的烷基反应。
或者，可能希望通过连接基团偶联治疗剂与抗体。连接基团能作为间隔区使抗体远离治疗剂，以避免对结合能力的干扰。连接基团也能用来提高治疗剂或抗体上取代基的化学反应性，从而提高偶联效率。化学反应性的提高也可促进治疗剂或治疗剂官能团的应用，这种应用本来是不可能的。
本领域技术人员应当明白，许多相同及不同功能的双功能或多功能试剂(如Pirece Chemical Co.，Rockford，IL目录所述)可用作连接基团。例如，通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基可实现偶联。有大量参考文献描述了这些方法，如授予Rodwell等人的美国专利号4,671,958。
当不含本发明的免疫偶联物的抗体部分时，治疗剂更加有效，此时可能希望使用一种在细胞内化期间或之后能被切割的连接基团。曾经描述了大量不同的可切割连接基团。从这些连接基团胞内释放治疗剂的机制包括通过二硫键还原(例如，授予Spitler的美国专利号4,489,710)、通过照射光不稳定键(例如，授予Senter等人的美国专利号4,625,014)、通过衍生的氨基酸侧链的水解(例如，授予Kohn等人的美国专利号4,638,045)、通过血清补体介导的水解(例如，授予Rodwell等人的美国专利号4,671,958)和酸催化的水解(参见，授予Blattler等人的美国专利号4,569,789)切割。
将一种以上的试剂与一种抗体偶联可能是希望的。在一个实施方案中，一种试剂的多个分子与一个抗体分子偶联。在另一个实施方案中，一种以上的试剂与一个抗体偶联。无论特定实施方案如何，可用多种方法制备含一个以上试剂的免疫偶联物。例如，一个以上的试剂可直接与抗体分子偶联，或者能使用提供多个连接位点的接头。或者，也能使用载体。
载体可能以多种方式携带试剂，包括直接或通过连接基团共价键合。合适的载体包括蛋白质如白蛋白(例如，授予Kato等人的美国专利号4,507,234)、肽和多糖如氨基葡聚糖(例如，授予Shih等人的美国专利号4,699,784)。载体也可通过非共价结合或通过包封于如脂质体囊中携带试剂(例如，美国专利号4,429,008和4,873,088)。放射性核素试剂特异的载体包括放射性卤化小分子和螯合化合物。例如，美国专利号4,735,792公开了代表性的放射性卤化小分子及其合成。放射性核素螯合物可由螯合化合物形成，包括含有氮及硫原子作为供体原子的螯合化合物，用于结合金属或金属氧化物、放射性核素。例如，授予Davison等人的美国专利号4,673,562公开了代表性螯合化合物及其合成。
T细胞组合物另一方面，本发明提供对于此处公开的Her-2/neu多肽或其变体或衍生物特异的T细胞。在一个优选实施方案中，该T细胞对SEQ IDNO3所示Her-2/neu肽具有特异性。这些细胞一般可用标准方法在体外或离体制备。例如，可用购得的细胞分离系统，如可购自NexellTherapeutics，Inc.的IsolexTM系统(Irvine，CA；参见美国专利号5,240,856；美国专利号5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO92/07243)，从患者的骨髓、外周血或骨髓或外周血级分中分离T细胞。或者，也可由有关和无关的人、非人类哺乳动物、细胞系或培养物产生T细胞。
可以用多肽、编码多肽的多核苷酸和/或表达这种多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。这种刺激在足以产生目的多肽特异的T细胞的条件下和时间内进行。优选地，本发明的肿瘤多肽或多核苷酸存在于输送载体(如小球体)中，以促进特异性T细胞的产生。
如果T细胞特异增殖、分泌细胞因子或杀伤由多肽包被的或表达编码该多肽的基因的靶细胞，则认为这种T细胞对于本发明的多肽是特异的。T细胞特异性可以用多种标准技术评价。例如，在铬释放测定或增殖测定中，裂解和/或增殖比阴性对照提高两倍以上的刺激指数表明T细胞特异性。这些测定可如Chen等人，Cancer Res.541065-1070，1994所述进行。或者，对T细胞增殖的检测也可利用多种已知技术进行。例如，通过测定DNA合成率的提高(例如，通过用氚化胸苷脉冲标记T细胞培养物，并测定掺入DNA中的氚化胸苷的量)，能检测T细胞的增殖。与肿瘤多肽(100ng/ml-100μg/ml，优选地200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天一般将导致T细胞增殖至少提高2倍。如上所述接触2-3小时将导致T细胞激活，如用标准细胞因子测定所测，其中细胞因子释放(例如TNF或IFN-γ)水平提高2倍表明T细胞激活(参见Coligan等人，《现代免疫学方法》，第一卷，Wiley Interscience(Greene 1998))。由肿瘤多肽、多核苷酸或表达多肽的APC激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。肿瘤多肽特异的T细胞可用标准技术扩增。在优选实施方案中，T细胞来自患者、有关或无关供体，在刺激和扩增后对患者施用。
为了治疗目的，响应肿瘤多肽、多核苷酸或APC增殖的CD4+或CD8+T细胞能在体外或体内大量扩增。这些T细胞的体外增殖可用多种方法实现。例如，可使T细胞重复暴露于肿瘤多肽，或对应于这种多肽免疫原性部分的短肽，可加入或不加T细胞生长因子，如白介素-2，和/或可合成肿瘤多肽的刺激细胞。或者，也能通过克隆大量扩增在肿瘤多肽存在下增殖的一种或多种T细胞。克隆细胞的方法在本领域众所周知，包括有限稀释法。
T细胞受体组合物T细胞受体(TCR)由2个不同的高变多肽链(称为T细胞受体α和β链)组成，这两条链通过二硫键连接(Janeway，Travers，Walport，Immunobiology，第4版，148-159，Elsevier Science Ltd/GarlandPublishing，1999)。此α/β异二聚体与细胞膜上的恒定CD3链复合。该复合物识别与MHC分子结合的特异抗原肽。TCR特异性的巨大多样性与免疫球蛋白的多样性极为相似，均是由体细胞基因重排造成的。β链基因含有50多个可变(V)区段、2个多样性(D)区段、10多个连接(J)区段和2个恒定区区段(C)。α链基因含有70多个V区段和60多个J区段以及一个C区段，但没有D区段。当T细胞在胸腺中发育时，β链的D和J基因发生重排，之后V基因区段和DJ之间发生重排。这种功能性的VDJβ外显子在转录后经剪切与Cβ连接。对于α链，Vα基因区段和Jα基因区段重排形成功能性外显子，然后该外显子转录并与Cα拼接。在重组过程中，P和N核苷酸在β链的V、D和J区段之间和α链的V和J区段之间的随机添加使得多样性进一步增加(Janeway，Travers，Walport，Immunobiology，第4版，98和150，ElsevierScience Ltd/Garland Publishing，1999)。
另一方面，本发明提供对此处公开的Her-2/Neu多肽、或其变体或衍生物具有特异性的TCR。具体地，本发明提供确定给定TCR的特异性的VJ或VDJ连接序列的核酸和氨基酸序列。例如，可以从对Her-2/Neu多肽具有特异性的T细胞中使用标准分子生物学和重组DNA技术分离对Her-2/Neu肽有特异性的TCR的编码cDNA。
本发明还提供适宜的哺乳动物宿主细胞，例如非特异性T细胞，该宿主细胞已用对此处描述的Her-2/Neu多肽具有特异性的TCR的编码多核苷酸转染，由此使该宿主细胞对Her-2/Neu多肽具有特异性。TCR的α和β链可以包含在不同的表达载体上，或者作为可选择方案包含在一个表达载体上，而该表达载体还含有内部核糖体进入位点(IRES)从而使得IRES下游的基因可以发生帽子不依赖性翻译。可以使用表达Her-2/Neu多肽特异性TCR的所述宿主细胞进行Her-2/Neu相关恶性肿瘤的过继免疫治疗，见以下详细讨论。
在本发明的其它方面，可以在诊断Her-2/Neu相关癌症的试剂盒中使用此处所述对Her-2/Neu多肽具有特异性的克隆化TCR。例如，可以将Her-2/Neu相关肿瘤特异性TCR的核酸序列或其部分用作探针或引物以检测生物样品中编码该特异TCR的重排基因的表达。因此，本发明还提供用于检测编码Her-2/Neu多肽特异性TCR的信使RNA或DNA的测试方法。
药物组合物在其它实施方案中，本发明涉及此处公开的一种或多种多核苷酸、多肽、T细胞和/或抗体组合物在药学可接受的载体中的制剂，用于单独或与一种或多种其它治疗形式组合对细胞或动物施用。
应当理解，希望时，此处公开的组合物也可以与其它试剂(如其它蛋白质或多肽或不同的药学活性剂)组合施用。实际上，假定其它试剂在接触靶细胞或宿主组织后不引起明显的负面影响，则对可能包含的其它成分没有限制。因此在特定情况需要时，这些组合物可与其它不同的试剂一起施用。这些组合物可从宿主细胞或其它生物来源纯化，或者也可如此处所述化学合成。这些组合物也可能进一步包括取代的或衍生的RNA或DNA组合物。
因此，本发明另一方面提供药物组合物，其含有一种或多种此处所述的多核苷酸、多肽、抗体和/或T细胞组合物，以及生理学可接受的载体。在某些优选实施方案中，本发明的药物组合物含有本发明的免疫原性多核苷酸和/或多肽组合物，用于预防和治疗疫苗用途。疫苗的制备如M.F.Powell和M.J.Newman编著的《疫苗设计(亚基和佐剂方法)》，Plenum出版社(NY，1995)所概述。这些组合物通常含有一种或多种本发明的免疫原性多核苷酸和/或多肽组合物以及一种或多种免疫刺激剂。
显然此处所述的任何药物组合物可含有本发明的多核苷酸和多肽的药学可接受的盐。这些盐能由药学可接受的无毒碱制备，包括有机碱(例如伯胺、肿胺和叔胺和碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)。
在另一个实施方案中，本发明的示例性免疫原性组合物(如疫苗组合物)含有编码一种或多种上述多肽的DNA，使得多肽原位产生。如上所述，该多核苷酸可以在本领域技术人员周知的任一种输送系统内施用。的确，大量基因输送技术在本领域众所周知，如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15143-198，1998和此处引用的参考文献所述。合适的多核苷酸表达系统当然含有在患者中表达所必需的DNA调节序列(如合适的启动子和终止信号)。或者，细菌输送系统还包括施用在细胞表面表达多肽免疫原性部分或分泌这种表位的细菌(如卡介苗)。
因此，在某些实施方案中，利用周知的多种基于病毒的系统之一，将编码此处所述免疫原性多肽的多核苷酸导入适当哺乳动物宿主细胞中表达。在一个说明性实施方案中，逆转录病毒提供了一种方便、有效的基因输送系统平台。能利用本领域周知的技术将选择的编码本发明的多肽的核苷酸序列插入载体并包装于逆转录病毒颗粒中。然后能分离重组病毒并对患者施用。曾经描述了大量说明性逆转录病毒系统(例如美国专利号5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy15-14；Scarpa等人(1991)Virology 180849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908033-8037；Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109)。
另外也描述了许多基于腺病毒的示例性系统。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒存在于染色体外，从而使得与插入诱变有关的危险最小(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等人(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等人(1994)Human Gene Therapy 5717-729；Seth等人(1993)J.Virol.68933-940；Barr等人(1994)Gene Therapy 151-58；Berkner，K.L.(1998)BioTechniques 6616-629；Rich等人(1993)Human GeneTherapy 4461-476)。
也发展了用于多核苷酸输送的多种腺伴随病毒(AAV)载体系统。AAV载体能用本领域众所周知的技术容易地构建。参见，例如，美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO 92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines 90(冷泉港实验室出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1165-169；Zhou等人(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
可用于通过基因转移输送编码本说明的多肽的多核苷酸的其它病毒载体包括来自痘病毒科的载体，如痘苗病毒和禽痘病毒。例如，表达新分子的痘苗病毒重组体能如下构建。首先将编码多肽的DNA插入适当载体中，使它与痘苗启动子和侧翼痘苗DNA序列(如编码胸苷激酶(TK)的序列)相邻。然后用该载体转染同时用痘苗病毒感染的细胞。利用同源重组向病毒基因组中插入痘苗启动子加编码目的多肽的基因。通过在5-溴脱氧尿苷存在下培养细胞并挑取对它有抗性的病毒噬斑，筛选产生的TK.sup.(-)重组体。
以痘苗病毒为基础的感染/转染系统能方便地用于引起此处所述的一种或多种多肽在生物宿主细胞中诱导型、瞬时表达或共表达。在这种特定系统中，首先用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重组体体外感染细胞。该聚合酶显示强烈的特异性，因为它只转录含有T7启动子的模板。在感染后，用T7启动子驱动的目的多核苷酸转染细胞。痘苗病毒重组体在细胞质中表达的聚合酶把转染的DNA转录为RNA，然后由宿主翻译机器翻译为多肽。该方法导致大量RNA及其翻译产物的高水平、瞬时、细胞质的产生。参见，例如，Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876743-6747；Fuerst等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)838122-8126。
或者，也能利用禽痘病毒(如鸡痘和金丝雀痘病毒)输送目的编码序列。已知表达哺乳动物病原体的免疫原的重组禽痘病毒在对非禽类物种施用时可引起保护性免疫。在人和其它哺乳动物种中使用禽痘病毒载体是特别希望的，因为禽痘病毒属的成员只能在易感禽类种中生产性复制，因此不感染哺乳动物细胞。产生重组禽痘病毒的方法在本领域周知，使用遗传重组，如上文对于痘苗病毒的产生所述。参见，例如，WO 91/12882；WO 89/03429；WO 92/03545。
许多甲病毒也能用于输送本发明的多核苷酸组合物，如美国专利号5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694所述的载体。也能使用某些基于委内瑞拉马脑炎(VEE)的载体，其示例性例子见美国专利号5,505,947和5,643,576。
此外，分子偶联载体，如Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)2686866-6869和Wanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)896099-6103所述的腺病毒嵌合载体也能用于本发明的基因输送。
关于这些和其它基于病毒的已知输送系统的其它说明性信息可见于，例如Fisher-Hoch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86317-321，1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等人，Vaccine 817-21，1990；美国专利号4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，Biotechniques6616-627，1988；Rosenfeld等人，Science 252431-434，1991；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219，1994；Kass-Eisler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011498-11502，1993；Guzman等人，Circulation 882838-2848，1993；Guzman等人，Cir.Res.731202-1207，1993。
在某些实施方案中，多核苷酸可以整合到靶细胞的基因组中。这种整合可以以特定位置和方向经同源重组(基因置换)，或者可以非特定位置地随机整合(基因扩增)。在其它实施方案中，多核苷酸在细胞中可稳定保持为分开的附加型DNA片段。这些多核苷酸片段或“附加体”编码足以不依赖于宿主细胞周期或与之同步保持和复制的序列。向细胞输送表达构建体的方式和细胞中该多核苷酸保持的位置取决于所使用的表达构建体的类型。
在本发明的另一个实施方案中，如Ulmer等人，Science2591745-1749，1993所述，和Cohen，Science 2591691-1692，1993所综述，多核苷酸也可以作为“裸露的”DNA施用/输送。将DNA包被于可生物降解的珠上可提高裸露DNA的摄取，这种珠能被有效地输送到细胞内。
在另一实施方案中，本发明的组合物能通过粒子轰击法输送，其中许多已经描述。在一个说明性实例中，能用如PowderjectPharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison，WI)制造的装置实现气体驱动的粒子加速，美国专利号5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；欧洲专利号0500799描述了其中一些实例。该方法提出一种无针输送法，其中用手持式装置产生的氦气气流将显微颗粒(如多核苷酸或多肽颗粒)的干粉制剂加速到高速，推动颗粒进入靶组织。
在有关实施方案中，可用于气体驱动无针注射本发明的组合物的其它装置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)所提供的，美国专利号4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中描述了其中一些实例。
根据另一个实施方案，此处所述的药物组合物除本发明的免疫原性多核苷酸、多肽、抗体、T细胞和/或APC组合物外还含有一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂是指增强或加强对外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的基本上所有的物质。一种优选的免疫刺激剂包含佐剂。许多佐剂含有用来保护抗原免于快速分解代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答的刺激物，如脂质A、Bortadellapertussis或结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的蛋白质。某些佐剂可以购得，如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Dtroit，MI)；Merck佐剂65(Merck Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；铝盐，如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不可溶悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的小球体；单磷酰脂类A和quil A。细胞因子如GM-CSF、白介素-2、-7或-12和其它类似生长因子也可用作佐剂。
在本发明的某些实施方案中，佐剂组合物优选地诱导以Th1型为主的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于利于诱导针对施用抗原的细胞介导的免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于诱导体液免疫应答。在施用此处所述的疫苗后，患者将支持包括Th1型和Th2型应答的免疫应答。在一个优选实施方案中，其中应答主要是Th1型，Th1型细胞因子的水平将增加到比Th2型细胞因子水平更高的程度。这些细胞因子的水平可用标准测定法评价。关于细胞因子家族的综述参见Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
用于引发以Th1型为主的应答的某些优选佐剂包括，例如，单磷酰脂类A(优选地3-脱-O-酰化单磷酰脂类A)与铝盐的组合。MPL佐剂可从Corixa公司(Seattle，WA)获得(参见，例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也诱导以Th1为主的应答。这些寡核苷酸众所周知，例如在WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中描述。例如，Sato等人，Science 273352，1996也描述了免疫刺激性DNA序列。另一种优选佐剂含有皂角苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila BiopharmaceuticalsInc.，Framingham，MA)、七叶皂苷、毛地黄皂苷或Gypsophila或Chenopodium quinoa皂角苷。其它优选的制剂包括在本发明的佐剂组合中的一种以上的皂角苷，例如QS21、QS7、Quil A、β-七叶皂苷或毛地黄皂苷中的至少两种的组合。
或者，皂角苷制剂也可与疫苗载体组合，这些载体包含壳聚糖或其它聚阳离子聚合物、聚交酯和聚交酯-共-乙交酯颗粒、基于聚-N-乙酰葡糖胺的聚合基质、由多糖或化学修饰的多糖组成的颗粒、基于脂质体和脂类的颗粒、由甘油单酯组成的颗粒等。皂角苷也可在胆固醇存在下配制，以形成颗粒结构如脂质体或ISCOM。此外，皂角苷也可与聚氧乙烯醚或酯在非颗粒溶液或悬液中配制，或为颗粒结构如少层(paucilamelar)脂质体或ISCOM。皂角苷也可与赋形剂(如CarbopolR)配制以提高粘度，或者可以以干粉形式与粉末赋形剂(如乳糖)配制。
在一个优选实施方案中，佐剂系统包括单磷酰脂类A和皂角苷衍生物的组合，如QS21和3D-MPL佐剂的组合，如WO 96/00153所述，或用胆固醇灭活QS21的低反应性组合物，如WO 96/33739所述。其它优选制剂含有水包油乳剂和生育酚。在WO 95/17210中描述了在水包油乳剂中应用QS21、3D-MPL佐剂和生育酚的一种特别优选的佐剂制剂。
另一种增强的佐剂系统包括含CpG寡核苷酸与皂角苷衍生物的组合，特别是WO 00/09159中公开的CpG与QS21的组合。优选地，该制剂还含有水包油乳剂和生育酚。
用于本发明的药物组合物的其它说明性佐剂包括Montanide ISA720(Seppic，法国)、SAF(Chiron，加利福尼亚，美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如SBAS-2或SBAS-4，可获自SmithKline Beecham，Rixensart，比利时)、Detox(Enhanzyn；Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)，如未决的美国专利申请系列号08/853,826和09/074,720所述，其公开内容在此引用作为参考，和如WO 99/52549A1所述的聚氧乙烯醚佐剂。
其它优选佐剂包括通式(I)HO(CH2CH2O)n-A-R的佐剂分子，其中n是1-50，A是一个键或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本发明的一个实施方案包括含有通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗制剂，其中n是1-50，优选地是4-24，最优选地是9；R成分是C1-50，优选地是C4-C20烷基，最优选地是C12烷基，A是一个键。聚氧乙烯醚的浓度应当为0.1-20％，优选地0.1-10％，最优选地0.1-1％。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。Merck目录(第12版条目7717)描述了聚氧乙烯醚，如聚氧乙烯月桂醚。WO 99/52549中描述了这些佐剂分子。
根据通式(I)的聚氧乙烯醚希望时可与另一种佐剂组合。例如，优选的佐剂组合是优选地与如未决的英国专利申请GB 9820956.2所述的CpG组合。
根据本发明的另一个实施方案，通过抗原呈递细胞(APC)向宿主输送此处所述的免疫原性组合物，APC如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和可改造为有效APC的其它细胞。这些细胞可以但不是必须遗传修饰来提高递呈抗原的能力，促进T细胞应答的激活和/或保持，本身具有抗肿瘤作用，和/或与受体免疫学相容(即匹配的HLA单体型)。APC一般可从多种生物液体和器官(包括肿瘤和肿瘤周围组织)中分离，可以是自体、异体、同源或异种的细胞。
本发明的某些优选实施方案使用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是十分有效的APC(Banchereau和Steinman，Nature 392245-251，1998)，作为生理佐剂可有效地引发预防或治疗性抗肿瘤免疫(参见Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。通常可根据典型形状(原位星形，在体外可见的明显的胞质突起(树突))、高效吸收、加工和递呈抗原的能力及其激活幼稚T细胞应答的能力鉴定树突细胞。当然可以改造树突细胞，使之表达在体内或离体的树突细胞上不常见到的特异性细胞表面受体或配体，本发明涉及这些修饰的树突细胞。作为树突细胞的一个备选方案，在疫苗中可使用分泌的载有囊泡抗原的树突细胞(称为外来体)(参见Zitvogel等人，Nature Med.4594-600，1998)。
树突细胞及其祖细胞可从外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周围组织浸润细胞、淋巴结、脾脏、皮肤、脐带血或其它任何合适的组织或液体中获得。例如，通过向从外周血中收集的单核细胞的培养物中加入细胞因子，如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的组合，树突细胞可以离体分化。或者，通过向培养基中加入GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或可诱导树突细胞分化、成熟和增殖的其它化合物的组合，从外周血、脐带血或骨髓中收集的CD34阳性细胞也可分化为树突细胞。
树突细胞常规分类为“未成熟”和“成熟”的细胞，这是区别两种明确表征的表型的一种简单方法。然而，这种命名法不应被视为排除分化中所有可能的中间阶段。未成熟树突细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的APC，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达有关。成熟表型的特征一般在于这些标记的表达较低，但负责T细胞激活的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表达。
通常可以用本发明的多核苷酸(或其部分或其它变体)转染APC，使得编码的多肽或其免疫原性部分在细胞表面表达。如此处所述，这种转染可以离体发生，含有这些转染细胞的药物组合物可用于治疗目的。或者，也可以向患者施用导向树突或其它抗原呈递细胞的基因输送载体，引发在体内发生的转染。例如，树突细胞的体内和离体转染通常可用本领域周知的任何方法进行，如WO 97/24447所述的方法，或Mahvi等人，Immunology and Cell Biology 75456-460，1997所述的基因枪法。树突细胞负载抗原可如下实现将树突细胞或祖细胞与肿瘤多肽、(裸露的或质粒载体内的)DNA或RNA或与表达抗原的重组细菌或病毒(例如，痘苗、禽痘、腺病毒或慢病毒载体)温育。在负载前，多肽可与提供T细胞帮助的免疫配偶体(例如载体分子)共价结合。或者，树突细胞也可以用未结合的免疫配偶体脉冲单独地或在多肽存在下脉冲。
尽管在本发明的药物组合物中可以使用本领域技术人员所知的任何适当载体，但载体的类型一般因施用方式而不同。可为了任何合适的施用方式配制本发明的组合物，包括，例如，局部、口服、鼻、粘膜、静脉内、颅内、腹膜内、皮下和肌内施用。
这些药物组合物中使用的载体是生物相容的，也可以是可生物降解的。在某些实施方案中，该制剂优选地引起相对恒定水平的活性成分释放。然而在其它实施方案中，施用后更快的释放速度可能是希望的。这些组合物的配制为本领域技术人员所熟知。在这方面有用的说明性载体包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、乳胶、淀粉、纤维素、葡聚糖等的微粒。其它说明性缓释载体包括超分子生物载体，它含有非脂亲水性核心(例如交联的多糖或寡糖)，和任选地一个含有两亲性化合物(如磷脂)的外层(参见，例如，美国专利号5,151,254和PCT申请WO 94/20078、WO 94/23701和WO 96/06638)。缓释制剂中所含的活性成分的量取决于植入部位、释放速度和预期的持续时间和将要治疗或预防的病情。
在另一个说明性实施方案中，用可生物降解的小球体(例如polylactate polyglycolate)作为本发明的组合物的载体。例如，美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609和5,942,252中公开了合适的可生物降解的小球体。修饰的乙型肝炎核心蛋白载体系统，如WO 99/40934和此处引用的参考文献所述，也可用于多种用途。另一种说明性载体/输送系统使用一种含有颗粒-蛋白质复合物的载体，如美国专利号5,928,647所述，它能在宿主中诱发I类限制的细胞毒性T淋巴细胞应答。
本发明的药物组合物通常还含有一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(如EDTA)或谷胱甘肽、佐剂(如氢氧化铝)、使制剂相对于受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。或者，本发明的组合物也可配制为冻干品。
此处所述的药物组合物可存在于单剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓿或小瓶中。这些容器一般密封，以在使用前保持制剂的无菌和稳定性。制剂通常可贮存为油状或水状载体中的悬液、溶液或乳液。此外，药物组合物也可在冻干条件下贮存，在临用前只需加入无菌液体载体。
为了在多种治疗方案中使用此处所述的特定组合物，发展适当给药和治疗方案，包括例如口服、肠胃外、静脉内、鼻内和肌内施用和配制，为本领域众所周知，为举例说明，其中一些在下面简要描述。
在某些用途中，可以通过口服向动物施用此处公开的药物组合物。这样，这些组合物可以用惰性稀释剂或可同化的食用载体配制，或者可以包封于硬壳或软壳的明胶胶囊中，或者可以压制成片剂，或者可以直接掺入食物中。
活性化合物中甚至可以掺入赋形剂，并以可摄入的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄膜等的形式使用(参见，例如，Mathiowitz等人，Nature 1997 Mar 27；386(6623)410-4；Hwang等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998；15(3)243-84；美国专利5,641,515；美国专利5,580,579；美国专利5,792,451)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有多种其它成分，例如，粘合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如可以加入蔗糖、乳糖或糖精，或增香剂，如薄荷、冬青油或樱桃香料。当单位剂型是胶囊时，除上述材料之外还可含有液体载体。其它不同材料可以是包被或以其它方式修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫胶、糖或其两者包被。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料都应当是药物纯的，并且所使用的量基本上无毒。另外，也可以向缓释制剂中掺入活性化合物。
这些制剂一般含有至少约0.1％的活性化合物或更多，尽管活性成分的百分数肯定会变化，通常为总制剂重量或体积的约1或2％到约60％或70％或更多。一般按照在给定单位剂量的化合物中获得适当剂量，准备每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量。制备这些药用制剂的技术人员应当考虑溶解度、生物利用率、生物半衰期、施用途径、产品保存期及其它药理学因素，因此，多种剂量和治疗方案可能是希望的。
对于经口施用，本发明的组合物还可以与一种或多种赋形剂结合，为漱口药、洁齿剂、颊含片、喷口剂或舌下经口施用制剂的形式。或者，活性成分也可以掺入口服溶液(如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液)中，或分散于洁齿剂中，或以治疗有效的量加入可含有水、粘合剂、研磨剂、增香剂、发泡剂和湿润剂的组合物中。此外，组合物也可制成可置于舌下或以其它方式溶解于口中的片剂或溶液形式。
在某些情况下，希望经肠胃外、静脉内、肌内乃至腹膜内施用此处公开的药物组合物。这些方法为本领域技术人员所周知，其中一些例如在美国专利5,543,158；美国专利5,641,515和美国专利5,399,363中进一步描述。在某些实施方案中，活性化合物作为游离碱或药理学可接受的盐的溶液可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制剂通常含有防腐剂防止微生物生长。
适于注射用的说明性药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末(例如，参见美国专利5,466,468)。在所有情况中，该形式必须是无菌的，必须是易注射的液体。在生产和贮存条件下必须稳定，必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散基质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的适当混合液和/或植物油。例如，利用包被，如卵磷脂，在分散的情况下保持需要的颗粒大小，和/或利用表面活性剂，可以保持适当的流动性。利用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如paraben、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，有利于防止微生物的作用。在许多情况中，优选地含有等渗剂，如糖或氯化钠。在组合物中使用延缓吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，能使注射组合物的吸收延长。
在一个实施方案中，对于水溶液的肠胃外施用，必要时溶液应当适当地缓冲，首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，本领域技术人员可了解能够使用的无菌水介质。例如，一剂量可溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并加入1000ml皮下灌注液中或在所述注射部位注射(参见，例如，《Remington药物学》第15版，1035-1038和1570-1580页)。根据治疗的患者病情，必须进行剂量上的某些改变。此外，对于人体施用，制品必须优选地满足FDA生物制剂标准所要求的无菌、致热性和一般安全性和纯度标准。
在本发明的另一个实施方案中，此处公开的组合物可配制为中性或盐形式。示例性药学可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其是与无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的。与游离羧基形成的盐也能来自于无机碱，如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等。在配制后，以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用该溶液。
载体还能含有任一种和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。这些介质和试剂用于药学活性物质的应用在本领域众所周知。除了任何常规介质和试剂与活性成分不相容的情况，考虑它在治疗组合物中的使用。补充的活性成分也能加入组合物中。术语“药学可接受的”是指在对人体施用时不引起过敏或类似的不利反应的分子体和组合物。
在某些实施方案中，可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶输送载体施用药物组合物。例如，美国专利5,756,353和美国专利5,804,212中描述了通过经鼻气溶胶喷雾直接向肺输送基因、核酸和肽组合物的方法。利用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，J ControlledRelease 1998 Mar 2；52(1-2)81-7)和溶血磷脂酰甘油(美国专利5,725,871)输送药物在制药领域也是众所周知的。美国专利5,780,045也描述了聚四氟乙烯支持基质形式的说明性穿粘膜药物输送。
在某些实施方案中，利用脂质体、纳米囊(nanocapsule)、微粒、脂质颗粒、囊泡等向合适的宿主细胞/生物导入本发明的组合物。特别是，为了输送可以配制包封于脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中的本发明的组合物。此外，本发明的组合物也能与这类载体表面共价或非共价结合。
脂质体和脂质体样制品的形成及作为可能的药物载体的应用为本领域技术人员所周知(参见，例如，Lasic，Trends Biotechnol 1998Jul；16(7)307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998Mar；56(3)691-5；Chandran等人，Indian J Exp Biol.1997Aug；35(8)801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)233-61；美国专利5,567,434；美国专利5,552,157；美国专利5,565,213；美国专利5,738,868和美国专利5,795,587，均在此引用作为参考)。
脂质体已经成功地用于通常难以用其它方法转染的大量细胞类型，包括T细胞悬液、原代肝细胞培养物和PC 12细胞(Renneisen等人，J Biol Chem.1990 Sep 25；265(27)16337-42；Muller等人，DNA Cell Biol.1990 Apr；9(3)221-9)。另外，脂质体没有基于病毒的输送系统所具有的DNA长度限制。脂质体已经有效地用于向多种培养细胞系和动物中导入基因、不同药物、放疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应物等。此外，脂质体的应用似乎与全身施用后的自身免疫反应或无法接受的毒性无关。
在某些实施方案中，由分散于水介质中的磷脂形成脂质体，并且自发形成多层同心双层小泡(也称为多层小泡(MLV))。
或者，在其它实施方案中，本发明提供本发明的组合物的药学可接受的纳米囊制剂。纳米囊通常能以稳定和可重复的方式包封化合物(参见，例如，Quintanar-Guerrero等人，Drug Dev Ind Pharm.1998Dec；24(12)1113-28)。为了避免胞内聚合物过载引起的副作用，可以利用能在体内降解的聚合物设计这些超细颗粒(大小约为0.1μm)。能如Couvreur等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1988；5(1)1-20；zur Muhlen等人，Eur J Pharm Biopharm.1998Mar；45(2)149-55；Zambaux等人，J Controlled Release 1998 Jan2；50(1-3)31-40；和美国专利5,145,684所述制备这种颗粒。
癌症治疗方法在本发明的其它方面，此处所述的药物组合物可用于癌症的治疗，特别是乳腺癌和其它Her-2/neu相关恶性肿瘤的免疫治疗。在这些方法中，对患者，一般是温血动物，优选地是人，施用此处所述的药物组合物。患者可患有或未患癌症。因此，上述药物组合物可用于防止癌症的发展或治疗癌症患者。药物组合物和疫苗可在手术切除原发肿瘤和/或治疗(如施以放疗或常规化疗药物)之前或之后施用。如上所述，药物组合物可以通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、真皮内、肛门、阴道、局部和口服途径施用。
在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗依赖于施用免疫应答调节剂(如此处所述的多肽和多核苷酸)体内刺激内源宿主免疫系统，使之对肿瘤反应。
在其它实施方案中，免疫治疗也可以是被动免疫治疗，其中治疗包括施用具有明确的肿瘤免疫反应性的试剂(如效应细胞或抗体)，它们能直接或间接地介导抗肿瘤作用，而不必依赖完整的宿主免疫系统。效应细胞的例子包括如上所述的T细胞、T淋巴细胞(例如CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+T辅助肿瘤浸润淋巴细胞)、杀伤细胞(如自然杀伤细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞)、B细胞或和表达此处所述的多肽的抗原呈递细胞(如树突细胞和巨噬细胞)。可以克隆、表达对于此处所述多肽特异的T细胞受体和抗体受体，并转移到其它载体或效应细胞中，进行过继免疫治疗。也可以利用此处所述的多肽产生抗体或抗独特型抗体(如上文及美国专利号4,918,164所述)进行被动免疫治疗。
如此处所述，通过在体外生长，一般能获得足以进行过继免疫治疗的效应细胞。使单个抗原特异性效应细胞扩充为几十亿个而保留体内抗原识别能力的培养条件在本领域中周知。这些体外培养条件一般在细胞因子(如IL-2)和不分裂的饲养细胞存在下用抗原断续刺激。如上所述，此处所述的免疫反应性多肽可用来快速扩充抗原特异性T细胞培养物，以产生足以进行免疫治疗的细胞。特别是，抗原呈递细胞，如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和/或B细胞，可以利用本领域周知的多种标准技术，用免疫反应性多肽脉冲，或用一种或多种多核苷酸转染。例如，抗原呈递细胞可用一种多核苷酸转染，该多核苷酸含有适于增强在重组病毒或其它表达系统中表达的启动子。在治疗中使用的培养的效应细胞必须能够生长且广泛分布，并能在体内长期存活。研究表明，通过用补充有IL-2的抗原重复刺激，能诱导培养的T细胞在体内生长，并且能大量地长期存活(参见，例如，Cheever，M.等人，Immunological Reviews 157177，1997)。
或者，也可将表达此处所述多肽的载体导入取自患者的抗原呈递细胞中，并离体无性繁殖，用于移植回相同患者。可以利用本领域周知的任何方法将转染细胞重新导入患者中，优选地以无菌形式通过静脉内、腔内、腹腔内或肿瘤内施用。
此处所述的治疗组合物的施用途径和频率以及剂量因个体而异，可用标准技术确定。药物组合物和疫苗通常通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如吸入)或经口施用。优选地，可在52周内施用1-10次。优选地，以1个月的间隔施用6次，之后可定期进行加强接种。备选方法可能适于个体患者。一种合适的剂量是，当如上所述施用时，能增强抗肿瘤免疫应答，并且比基础(即未处理)水平至少高10-50％的化合物的量。这种应答可如下监测测量患者中的抗肿瘤抗体，或能在体外杀伤患者肿瘤细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖的产生。这些疫苗应该也能引起免疫应答，致使接种患者的临床后果比未接种患者改善(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病存活)。通常，对于含有一种或多种多肽的药物组合物和疫苗，剂量中所含的每种多肽的量约为每kg宿主约25μg至5mg。合适的剂量大小因患者体重而异，但一般为约0.1mL至约5mL。
合适的剂量和治疗方案一般提供足以提供治疗和/或预防益处的量的活性化合物。通过确定治疗患者比未治疗患者改善的临床后果(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病存活)，能监测这种反应。预先存在的对肿瘤蛋白免疫应答的增强一般与改善的临床结果有关。这些免疫应答一般可用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定法评价，这些方法可用治疗前和治疗后从患者中获得的样品进行。
癌症检测和诊断组合物、方法和试剂盒另一实施方案中，可根据在患者的生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检)中存在一种或多种Her-2/neu蛋白和/或编码这些蛋白质的多核苷酸，检测患者的癌症。换言之，本发明的多肽和多核苷酸可用作标志，表明癌症的存在与否。此处所述的结合剂一般允许检测生物样品中可与该试剂结合的抗原的水平。可以利用多核苷酸引物和探针检测编码肿瘤蛋白的mRNA水平，这也表明癌症的存在与否。本领域技术人员已知多种测定法，利用结合剂检测样品中的多肽标志。参见，例如，Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，冷泉港实验室，1988。患者中癌症的存在与否通常如下确定(a)将从患者中获得的生物样品与结合剂接触；(b)检测样品中可与该结合剂结合的多肽的水平；(c)将多肽水平与预定的截断值相比较。
在一个优选实施方案中，该测定法包括用固定于固体载体上的结合剂结合并从剩余的样品中除去多肽。然后可用一种含有报道基团并可与结合剂/多肽复合物特异结合的检测试剂检测结合的多肽。这些检测试剂可包括，例如，可与该多肽特异结合的结合剂，或可与该结合剂特异结合的抗体或其它试剂，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。或者，也可使用竞争测定法，其中多肽用报道基团标记，并在结合剂与样品温育后使之与固定的结合剂结合。样品成分抑制标记多肽与结合剂结合的程度表明样品对固定的结合剂的反应性。固体载体可以是本领域技术人员所知的、肿瘤蛋白可以附着的任何材料。例如，固体载体可以是微量板中的检测孔，或硝酸纤维素或其它合适的膜。此外，载体也可以是珠或盘，如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。载体也可以是磁粉或光纤传感器，如美国专利号5,359,681所公开的。可以利用专利和科学文献中详述的、本领域技术人员周知的多种技术将结合剂固定于固体载体上。在本发明中，术语“固定”是指非共价结合如吸附和共价结合(可以是试剂与载体上功能基团之间的直接连接，或者可以是通过交联剂的连接)。通过吸附固定于微量板孔或膜上是优选的。在这些情况中，可通过使适当缓冲液中的结合剂与固体载体接触适当时间实现这种吸附。接触时间因温度而异，但一般为约1小时至约1天。塑料微量板孔(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)与约10ng至约10μg、优选地约100ng至约1μg的结合剂接触通常足以固定足量的结合剂。
结合剂与固体载体共价结合一般可如下实现首先使载体与可与载体和结合剂的功能基团(如羟基或氨基)反应的双功能试剂反应。例如，使用苯醌，或通过载体上的醛基与结合配偶体上的氨和活性氢缩合，结合剂可与带有适当聚合物包被的载体共价结合(参见，例如，Pierce免疫技术目录和手册，1991，A12-A13)。
在某些实施方案中，测定法是双抗体夹心测定。这种测定法可如下进行首先使固定于固体载体(通常是微量板孔)上的抗体与样品接触，使样品中的多肽与固定的抗体结合。然后从固定的多肽-抗体复合物中除去未结合的样品，加入含有报道基团的检测试剂(优选地是能与该多肽上不同部位结合的第二抗体)。然后利用适于特定报道基团的方法测定结合于固体载体上的检测试剂的量。
更具体而言，一旦抗体固定于如上所述的载体上，一般就封闭载体上其余的蛋白质结合位点。可使用本领域技术人员周知的任何合适的封闭剂，如牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后使固定的抗体与样品一起温育，使多肽与抗体结合。在温育前样品可用合适的稀释剂如磷酸缓冲液(PBS)稀释。适当的接触时间(即温育时间)一般为足以检测到取自乳腺癌患者的样品中存在多肽的时间。优选地，接触时间足以实现一定水平的结合，该水平至少为结合与未结合多肽之间平衡时所达到的95％。本领域技术人员应认识到，通过测定一段时间中发生的结合水平可轻易地确定达到平衡所需的时间。在室温下，约30分钟的温育时间一般足够。
然后可利用合适的缓冲液(如含有0.1％吐温20TM的PBS)洗涤固体载体，去除未结合的样品。然后向固体载体上加入含有报道基团的第二抗体。优选的报道基团包括以上所述的基团。
然后将检测试剂与固定的抗体-多肽复合物温育，持续足以检测到结合多肽的一段时间。适当的时间长度一般可通过测定一段时间中发生的结合水平确定。然后去除未结合的检测试剂，并用报道基团检测结合的检测试剂。用于检测报道基团的方法取决于报道基团的性质。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影法一般是合适的。分光法可用来检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以用与不同报道基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联的亲和素检测。酶报道基团一般可通过加入底物(一般经过特定的一段时间)，随后对反应产物进行分光或其它分析来检测。
为了确定癌症(如乳腺癌)的存在与否，通常将保持与固体载体结合的报道基团的检测信号与对应于预定的截断值的信号相比较。在一个优选实施方案中，检测癌症的截断值是当固定抗体与来自非癌症患者的样品温育后获得的平均信号。通常，产生的信号比预定截断值高三个标准差的样品被认为是癌症阳性。在另一个优选实施方案中，按照Sackett等人，《临床流行病学临床医学基础科学》，Little Brownand Co.，1985，106-107的方法，用接收工作曲线(Receiver OperaterCurve)确定截断值。简言之，在该实施方案中，根据对应于诊断检查结果的每一可能截断值的成对真阳性率(即敏感度)和假阳性率(100％特异性)的图，可确定截断值。图上最接近左上角的截断值(即，包围最大面积的值)是最精确的截断值，产生的信号高于用该方法所确定的截断值的样品被认为是阳性。此外，截断值也可沿曲线转移到左侧，使假阳性率最低，或移到右侧，使假阴性率最低。产生的信号高于用该方法确定的截断值的样品通常被认为是癌症阳性。
在一个相关实施方案中，以流过(flow-through)或条形试验形式进行测定，其中结合剂固定于膜(如硝酸纤维素)上。在流过试验中，当样品通过膜时，样品中的多肽与固定的结合剂结合。然后当含有第二结合剂的溶液流经该膜时，标记的第二结合剂与结合剂-多肽复合物结合。然后可如上所述对结合的第二结合剂进行检测。在条形试验中，与结合剂结合的膜的一端浸于含有样品的溶液中。样品沿膜迁移，通过含有第二结合剂的区域到达固定结合剂的区域。固定抗体区域中第二结合剂的浓度表明癌症的存在。一般而言，该部位中第二结合剂的浓度产生一种可目测的模式，如一条线。没有这种模式表明为阴性结果。一般选择固定于膜上的结合剂的量，使得当生物样品含有足以在上述形式的双抗体夹心测定中产生阳性信号的多肽水平时，能产生可目视辨别的模式。在这些测定中使用的优选结合剂是抗体及其抗原结合片段。优选地，固定于膜上的抗体的量约25ng至约1μg，更优选地约50ng至约500ng。这些试验一般可用极少量的生物样品进行。
当然，存在大量其它测定方法适用于本发明的肿瘤蛋白或结合剂。以上叙述只是旨在举例。例如，本领域技术人员应当明白，可容易地修改上述方法，利用肿瘤多肽检测生物样品中可与这些多肽结合的抗体。这些肿瘤蛋白特异性抗体的检测可能与癌症的存在有关。
也可或作为替代方案根据生物样品中存在与肿瘤蛋白特异反应的T细胞检测癌症。在某些方法中，从患者中分离的含有CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与肿瘤多肽、编码该多肽的多核苷酸和/或表达该多肽的至少免疫原性部分的APC温育，检测是否存在T细胞的特异激活。合适的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可用常规技术(如Ficoll/Hypaque密度梯度离心外周血淋巴细胞)从患者中分离T细胞。T细胞可在37℃下与多肽(例如5-25μg/ml)体外温育2-9天(典型4天)。在不含Her-2/neu多肽的情况下温育另一等份T细胞样品，作为对照。对于CD4+T细胞，优选地通过评价T细胞增殖检测其激活。对于CD8+T细胞，优选地通过评价溶细胞活性检测其激活。增殖水平比无病患者至少高2倍和/或溶细胞活性至少高20％表明患者患有癌症。
如上所述，也可或备选地根据生物样品中编码肿瘤蛋白的mRNA水平检测癌症。例如，在基于聚合酶链反应(PCR)的测定中可利用至少两条寡核苷酸引物扩增来源于生物样品的肿瘤cDNA的一部分，其中至少一条寡核酸引物对于编码肿瘤蛋白的多核苷酸特异(即，可与之杂交)。然后用本领域周知的技术(如凝胶电泳)分离并检测扩增的cDNA。类似地，在杂交测定中可以利用可与编码肿瘤蛋白的多核苷酸特异杂交的寡核苷酸探针检测生物样品中是否存在编码该肿瘤蛋白的多核苷酸。
为了可在测定条件下杂交，寡核苷酸引物和探针应当含有一种寡核苷酸序列，该序列与编码本发明的肿瘤蛋白的多核苷酸的一部分(长度至少为10个核苷酸，优选地至少20个核苷酸)有至少约60％、优选地至少约75％、更优选地至少约90％的一致性。优选地，在如上所述的中度严紧条件下，寡核苷酸引物和/或探针可与编码此处所述多肽的多核苷酸杂交。在此处所述的诊断方法中有用的寡核苷酸引物和/或探针长度优选地为至少10-40个核苷酸。在一个优选实施方案中，寡核苷酸引物含有具有此处公开序列的DNA分子的至少10个连续核苷酸，更优选地至少15个连续核苷酸。基于PCR的测定和杂交测定技术在本领域周知(参见，例如Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51263，1987；Erlich编写，《PCR技术》，Stockton出版社，NY，1989)。
一种优选的测定使用RT-PCR，其中PCR与反转录联合使用。一般从生物样品(如活检组织)中提取RNA，并反转录产生cDNA分子。应用至少一条特异引物的PCR扩增将产生cDNA分子，它可利用如凝胶电泳分离并显示。可以对来自受试患者和未患癌症的患者的生物样品进行扩增。可以对横跨两个数量级的几个稀释度的cDNA进行扩增反应。受试患者样品的几个稀释度中的表达比非癌样品相同稀释度中的表达高两倍或以上一般认为是阳性。
在另一个实施方案中，此处所述的组合物可用作癌症进展的标志。在该实施方案中，如上所述用于癌症诊断的测定可以在一段时间内进行，并评价反应性多肽或多核苷酸水平的改变。例如，可以在6个月到1年时间内，每24-72小时进行测定，之后在需要时进行。在检测到多肽或多核苷酸水平随时间推移而提高的患者中，癌症通常发展。相反，当反应性多肽或多核苷酸水平经一段时间仍恒定或降低时，癌症未发展。
可直接对肿瘤进行某些体内诊断测定。一种这样的测定包括使肿瘤细胞接触结合剂。然后可通过报道基团直接或间接检测结合的结合剂。这类结合剂也可用于组织学用途。或者，在这些用途中也可使用多核苷酸探针。
如上所述，为了提高灵敏度，可以测定一种给定样品中的多种肿瘤蛋白标志。显然，在一种测定中可以组合使用对于此处所述不同蛋白质特异的多种结合剂。而且，可以同时使用多种引物或探针。肿瘤蛋白标志的选择可基于确定产生最佳灵敏度的组合的常规实验。另外，或作为备选方案，测定此处所述的肿瘤蛋白可与测定其它已知肿瘤抗原相结合。
本发明还提供可在上述任何诊断方法中使用的试剂盒。这些试剂盒一般含有两种或多种进行诊断测定所必需的成分。这些成分可以是化合物、试剂、容器和/或装置。例如，试剂盒中的一个容器可含有一种可与肿瘤蛋白特异结合的单克隆抗体或其片段。这些抗体或片段可以如上所述与支持材料结合。另外一个或多个容器可包封将在测定中使用的成分，如试剂或缓冲液。这些试剂盒也可作为备选方案含有如上所述的检测试剂，该试剂含有适于直接或间接检测抗体结合的报道基团。
或者，可设计试剂盒用来检测生物样品中编码肿瘤蛋白的mRNA的水平。这些试剂盒一般含有至少一种如上所述的寡核苷酸探针或引物，它可与编码肿瘤蛋白的多核苷酸杂交。这种寡核苷酸例如可在PCR或杂交测定中使用。这些试剂盒内可能含有的其它成分包括第二种寡核苷酸和/或诊断试剂或容器，以利于检测编码肿瘤蛋白的多核苷酸。
下列实施例只是为了举例说明，绝非意在限制。
实施例实施例1使用重组腺病毒感染的树突细胞致敏Her-2/neu特异性CD8+T细胞构建缺失EIA并与Her-2/neu的细胞内域(ICD；SEQ ID NO1的大约第2026-3765位核苷酸)重组的腺病毒(AdV)载体，将其用于感染从健康供体获得的树突细胞(DC)。最初的致敏培养物含有AdV-ICD感染的DC作为刺激物及自体PBMC作为应答者。在第一次重复刺激之前，富集培养物中的CD8+细胞，然后用AdV-ICD感染的DC再刺激此CD8+富集群体。随后的再刺激在用ICD重组逆转录病毒转导的自体成纤维细胞上进行。第4次体外刺激后，通过标准的4小时51Cr释放试验检测所获T细胞系的ICD特异性CTL活性。如图1所示，粗T细胞系含有ICD特异性活性，因为该细胞系裂解痘苗-ICD感染的自体B-LCL但不裂解痘苗-EGFP感染的C-LCL或未感染的B-LCL靶标。图1中各数据点是3次测量的平均值。
再经过两次刺激之后，测试T细胞系响应表达ICD的自体成纤维细胞而分泌γ-IFN的能力。γ-IFN ELISPOT分析使用应答者ICD致敏的CD8+T细胞系针对ICD或EGFP转导的自体成纤维细胞进行。在该分析中，按一式三份，每孔接种2×103个成纤维细胞刺激物和2×104个应答T细胞。对于三份重复孔，ICD成纤维细胞的平均Elispot数目为344，而EGFP成纤维细胞的平均Elispot数目为22。由此，证实该T细胞系有ICD特异性-γ-IFN分泌。
为了研究该CD8+ICD特异性T细胞系的I类限制，使用特异针对各种I类分子的抗体进行抗体阻断实验。刺激物与单克隆抗体W6/32(HLA-A，-B和-C反应性的)、单克隆抗体BB123.2(HLA-B和-C反应性的)或单克隆抗体BB7.2(HLA-A2特异的)一起预孵育。使用标准过夜γ-IFN Elispot试验测定T细胞应答。应答细胞是体外培养7个刺激循环后的ICD特异性CTL细胞系，每孔使用15,000个细胞。刺激物是用ICD或EGFP通过逆转录病毒转导的自体成纤维细胞，每孔使用2,000个细胞。刺激物和所指明的mAb(50μg/ml)一起孵育20分钟，之后加入到试验中。一式三份地进行该试验。
如表2所示，刺激细胞和W6/32或BB123.2抗体一起孵育完全阻断了对ICD转导的成纤维细胞的识别，而与BB7.2一起孵育对γ-IFN的分泌没有影响。这些结果说明，ICD特异性活性受HLA-B或-C等位基因的限制。
表2I类HLA抗体对ICD特异性γ-IFN分泌的阻断

扩增从该粗细胞系分离的ICD特异性克隆，并进一步表征其识别全长Her-2/neu的能力。此外，使用I类HLA特异的单克隆抗体检测该克隆的HLA限制。该实验是标准过夜γ-IFN Elispot试验。应答细胞是ICD特异性T细胞克隆17D5。刺激物是未转导的或通过逆转录病毒转导了EGFP、ICD或全长Her-2/neu(H2N)的自体成纤维细胞。每孔使用10,000个17D5细胞和10,000个刺激细胞。在该实验中以25μg/ml使用抗体。试验按一式三份进行，标准差对于三次重复试验为0至±18。
如表3所示，该克隆特异地识别ICD或全长Her-2/neu转导的自体成纤维细胞，但不识别未转导的成纤维细胞和无关抗原EGFP转导的成纤维细胞。而且，该反应性被加入的泛I类HLA单克隆抗体w6/32和特异针对HLA-B和-C等位基因的单克隆抗体(BB123.2)完全阻断，但不被HLA-A2特异性抗体(BB7.2)阻断。这些结果说明，此Her-2/neu特异性克隆是HLA-B或-C等位基因限制性的，在该克隆来源的粗细胞系中也观察到同样的HLA限制方式。
进一步的分析说明，该应答是HLA-B4402限制性的。这些分析通过测试克隆17D5对一组同种异体成纤维细胞的识别能力来实施，该组细胞在不同的HLA-B和-C等位基因上匹配并感染了AdV-ICD或AdV-EGFP。使用转导了重组逆转录病毒或感染了重组AdV的自体成纤维细胞作为对照。
表3用γ-IFN Elispot试验测定ICD特异性克隆17DS的Her-2/neu反应性的HLA限制

我们测试了Her-2/neu特异性克隆对表达Her-2/neu的人肿瘤细胞的识别能力。乳腺癌细胞系MCF-7天然在细胞表面表达低水平的Her-2/neu，也表达HLA-b4402。用Her-2/neu的逆转录病毒重组体转导MCF-7时，在用Her-2/neu特异性单克隆抗体染色后使用流式细胞术分析进行测定，表面Her-2/neu水平增加大约5倍。用AdV-Her-2/neu感染MCF-7细胞导致肿瘤细胞表面的Her-2/neu增加20倍。这些结果显示在图2中。
该T细胞克隆响应感染了编码Her-2/neu的腺病毒的MCF-7细胞分泌γ-IFN。然而，该克隆看来不识别MCF-7细胞或转导了表达Her-2/neu的逆转录病毒的MCF-7细胞。由于该克隆确实能够识别ICD或Her-2/neu转导的人成纤维细胞，而且由于该转导的成纤维细胞与转导的MCF-7细胞表达相似水平的蛋白质，所以此结果不可能仅是由抗原表达水平造成。
实施例2鉴定Her-2/neu的HLA-B44限制性天然加工表位本实施例描述了可被上述一个T细胞克隆17D5识别的表位的表征。该克隆识别表达ICD或全长Her-2/neu蛋白质的APC。我们使用在各种HLA等位基因上和该T细胞克隆匹配的一组同种异体细胞作为APC在γ干扰素Elispot试验中确定了该克隆的HLA限制元件是HLA-B4402。这被采用B4402重组逆转录病毒转导HLA-B44阴性、Her-2/neu阳性APC可赋予识别所证实。使用表达一系列5个ICD片断的重组逆转录病毒转导B44+APC，缩小了该克隆识别的ICD区域。该克隆对其中两个片断的识别(通过γ干扰素释放所测定的)说明，该表位包含在Her-2/neu序列第975位开始的235个氨基酸的片断中。从此片断中选择预测与B44结合的9肽和11肽，并进行合成。合成的13个肽中，一个被该克隆识别，被确定为该表位。这已通过γ干扰素释放和TNF-α释放试验得到证实。此天然加工的Her-2/neu表位的序列是EEYLVPQQGF(SEQ ID NO3)，位于Her-2/neu蛋白质序列的第1021-1030位。
实施例3接种Her-2/neu DNA和多肽可抑制表达Her-2/neu的肿瘤的生长材料和方法动物8-12周龄雌性C57B1/6小鼠，获自Charles RiverLaboratories(Wilmington，MA)，饲喂在Corixa公司的动物房中。
抗体和试剂从ATCC获得大鼠抗鼠CD4(GK1.5)和大鼠抗鼠CD8(2.43)杂交瘤细胞系。从腹水中纯化出抗体。抗人Her-2/neu ECD特异性抗体Ab-5购自Oncogene Research Products(Cambrige，MA)。Montanide 720购自Seppic公司(Fairfield，NJ)。
肿瘤细胞系从ATCC获得最初来源于C57BL小鼠的小鼠胸腺瘤EL4。用全长人Her-2/neu，使用标准电穿孔操作转染EL4细胞。体外使用新霉素进行药物筛选后，获得稳定地表达Her-2/neu的EL4细胞。通过流式细胞术分析验证Her-2/neu的表达。
Her-2/neu疫苗Her-2/neu质粒DNA疫苗(pVR1012-Her-2/neu)由插入VR102(Vical，San Diego，CA)中的全长人Her-2/neu cDNA组成。ECD质粒DNA疫苗(pVR1012-ICD)由编码Her-2/neu氨基酸第1-695位的DNA组成，而ICD质粒DNA疫苗(pVR1012-ECD)由VR1012中的编码氨基酸第692-1256位的DNA组成。使用Qiagen公司(Valencia，CA)试剂盒的试剂和标准技术制备大量无内毒素的质粒DNA。通过肌内途径在第0天(d0)和第21天(d21)递送质粒DNA疫苗(100μg)。ICD(氨基酸第676-1256位)和ECD(氨基酸第22-653位)重组亚单位蛋白由Corxia公司生产。简而言之，通过稳定转染L细胞并联合使用DEAE、反向HPLC和Mono S柱色谱进行纯化，产生ECD蛋白质。ICD蛋白质在大肠杆菌中产生并通过High Q阴离子交换层析及随后的镍树脂亲和层析从溶解的包含体中纯化出来。将重组蛋白质疫苗和Montandie 720以7∶2(Montanide 720∶蛋白质)比例混合后进行皮下递送。
体内肿瘤模型为了确保用于肿瘤保护实验的EL4-Her-2/neu细胞的一致来源，通过体内传代(腹膜内)扩增细胞并等分冷冻以便在各个实验中使用。使用200,000个EL4-Her-2/neu细胞皮下注射在胁腹处，以建立肿瘤。典型地，在注射的第8-10天内形成可触知的肿瘤。肿瘤大小以千分尺测量的肿瘤面积(长度×宽度)表示为mm2。
体内耗竭效应T细胞用质粒DNA或蛋白质在第0和21天免疫小鼠以产生效应T细胞。通过在实验开始后第35、38和42天腹膜内施用100μg/天的纯化抗CD4或抗CD8抗体，耗竭CD4和CD8细胞。对耗竭的脾细胞的流式细胞术分析说明，耗竭了98％以上的靶群体。
过继转移免疫血清从Her-2/neu质粒DNA或ICD蛋白质免疫的小鼠采血，获得免疫血清。汇合每一组的12只不同小鼠的血清，将其转移(静脉内)给6只受体幼稚小鼠。血清转移前通过ELISA评价了免疫血清的抗Her-2/neu抗体效价。
体外细胞因子分析用100μg pVR1012或pVR1012-Her-2/neu(肌内，i.m.)或Montanide中的50μg ICD蛋白质(s.q.)或单纯的Montanide在d0和d21天免疫小鼠(4只/组)。第二次免疫后2周，收获2.5×105个脾细胞并体外用单纯的培养基、ICD或ECD蛋白质(10μg/ml)进行刺激。通过ELISA分析体外刺激后48小时分泌至上清液中的IFNγ。数值为4只小鼠三次重复实验孔的平均值。
结果Her-2/neu蛋白质亚单位和质粒DNA疫苗介导肿瘤保护评价由全长或截短形式的Her-2/neu构成的Her-2/neu疫苗引起抵抗表达Her-2/neu的同基因肿瘤细胞系的保护性免疫应答的能力。用编码全长人Her-2/neu、Her-2/neu的ICD或ECD部分的质粒DNA免疫C57B1/6小鼠。两次DNA免疫后，用转染了全长人Her-2/neu的EL4细胞(EL4-Her-2/neu)皮下攻击小鼠，并监测肿瘤的生长。在幼稚( )小鼠中，EL4-Her-2/neu细胞在皮下施用的14至20天内形成巨大的实体瘤。用Her-2/neu质粒DNA(全长、ICD或ECD亚单位)接种基本上抑制了肿瘤细胞的生长(图3)。大多数小鼠完全避免了肿瘤的产生，而小部分动物表现出肿瘤攻击后多达3周的肿瘤发生延迟。有趣的是我们注意到，用截短和全长Her-2/neu构建体得到相似水平的肿瘤保护。
为了确定蛋白质亚单位疫苗是否也可有效地引起肿瘤保护，用ICD或ECD蛋白质加上佐剂免疫小鼠，用EL4-Her-2/neu攻击，然后监测肿瘤生长。结果显示在图4中，这些结果说明用ICD蛋白质接种可引起部分保护性免疫应答，其中小鼠产生肿瘤的频率和携带肿瘤的小鼠的肿瘤平均大小均降低。在这个典型实验中，ICD接种导致一只动物得到完全的保护，而且出现肿瘤的小鼠的肿瘤平均大小降低(在d23天为162mm2)。这是与幼稚组的4/4小鼠(肿瘤平均大小527mm2)和接种ECD的组的4/4小鼠(肿瘤平均大小462mm2)的肿瘤生长比较而言的。
出乎意料的是，与接种Her-2/neu DNA相比，接种蛋白质明显没有接种DNA有效。
为了确定在此模型中观察到的保护作用是否是Her-2/neu特异的，用全长Her-2/neu或载体对照质粒DNA接种小鼠，随后用亲本EL4或EL4-Her-2/neu细胞进行攻击。在接下来的10至25天监测肿瘤的生长。这些结果表明，仅在用Her-2/neu质粒DNA免疫的小鼠中肿瘤生长被抑制，这提示，引起了针对Her-2/neu的免疫而且该免疫是保护作用所必需的。以下观察提供了有关肿瘤保护是Her-2/neu特异性的进一步的证据，即用Her-2/neu质粒DNA接种不能阻止亲代EL4细胞的生长。在使用ICD蛋白质作为疫苗时也观察到了类似的结果(数据未显示)。综合起来，这些结果说明，Her-2/neu疫苗介导的肿瘤保护是Her-2/neu特异的。
Her-2/neu蛋白亚单位或质粒DNA疫苗介导的肿瘤保护的机制为了确定接种Her-2/neu质粒DNA或蛋白质时负责介导肿瘤保护的免疫应答的性质，我们接下来进行了一系列体内耗竭和过继转移实验。最初的实验设计用于评价CD4和CD8效应T细胞的各自作用。用全长Her-2/neu或对照质粒DNA免疫小鼠两次。第二次免疫后2周，用抗CD4或抗CD8抗体体内处理小鼠以耗竭效应T细胞。经过7天内3次施用抗体后达到98％以上的CD4或CD8脾T细胞耗竭。3天后，用EL4-Her-2/neu攻击小鼠，并监测肿瘤的生长。与图1所示前面实验一致，在用Her-2/neu质粒DNA(未处理组)接种的小鼠中观察到完全的肿瘤保护。相反，体内耗竭CD4但不耗竭CD8效应T细胞的情况下，Her-2/neu DNA疫苗接种介导的肿瘤保护作用完全丧失。在过继转移实验中得到了相似的结果，该实验中观察到过继转移CD8而非CD4耗竭的效应T细胞赋予了对肿瘤攻击的保护作用(数据未显示)。总之，这些结果提示，该系统中接种质粒DNA所介导的保护作用依赖于CD4而非CD8效应T细胞的存在。
我们在使用ICD蛋白质接种后进行了相似的实验，以确定CD4和CD8 T细胞在该疫苗引起的免疫应答中的作用。再次，用佐剂中的ICD蛋白质免疫并加强免疫小鼠，通过体内抗体处理耗竭CD4和CD8效应T细胞，并随后用EL4-Her-2/neu进行攻击。结果揭示，CD4或CD8 T细胞的耗竭均会造成用ICD接种获得的保护作用部分丧失，这提示CD4和CD8效应T细胞均在ICD蛋白质介导的肿瘤保护作用中起作用。过继转移实验的结果也指出，CD4和CD8效应T细胞在ICD蛋白质接种引起的免疫应答中均是重要的(数据未显示)。
由于已知抗Her-2/neu抗体可以表现出对肿瘤细胞的抗增殖作用，我们研究了质粒DNA或蛋白质接种引起的抗体是否对所观察到的保护作用有贡献。为了回答此问题，用全长Her-2/neu DNA或ICD蛋白质免疫和加强免疫小鼠。收集Her-2/neu免疫小鼠的血清或未免疫小鼠的对照血清，然后将其转移至幼稚小鼠中，之后用EL4-Her-2/neu攻击幼稚小鼠。从Her-2/neu DNA免疫血清得到的结果指出，抗体的转移并没有赋予保护作用。在用质粒DNA接种获得的抗Her-2/neu抗体水平十分低的情况下(数据未显示)，这些结果在某种程度上是可预见的。类似地，尽管在含有抗ICD抗体的血清中存在相当大效价(10,000-100,000)的抗ICD抗体，转移该血清也不具有保护性。综合起来，这些结果提示，在使用EL4-Her-2/neu肿瘤细胞的此模型中所观察到的保护作用并非是由抗体介导的。
这些体内耗竭和过继转移实验的结果说明，在此模型中CD4+T细胞在引起保护性抗肿瘤免疫应答中起着主要作用。为了更全面的阐明CD4+T细胞介导保护作用的机制，我们检测了用Her-2/neu DNA或ICD蛋白接种后T细胞的细胞因子分泌谱。结果总结在下表中，这些结果表明了用重组ICD或ECD蛋白质体外重复刺激时，来自Her-2/neu质粒DNA接种的小鼠的脾细胞与未刺激细胞相比分泌相当高水平的IFNγ。来自接种ICD蛋白质的小鼠的脾细胞也响应体外ICD刺激但不响应ECD蛋白质刺激产生IFNγ。这些相同培养物中的IL-4和IL-5水平在检测水平之下，这与Th1型免疫应答相符。综合起来，这些结果提示，在该模型中IFNγ可能在Her-2/neu疫苗介导的保护作用中起作用。
表4接种Her-2/neu DNA或蛋白质后IFNγ的产生

a用Montanide中的100μg pVR1012或VR1012-Her-2/neu(肌内)或50μg ICD蛋白质(s.q.)或单纯的Montanide在d0和d21免疫小鼠(4只/组)。
b第二次免疫后两周，收获脾细胞并体外用单纯培养基、ICD或ECD蛋白质(10μg/ml)刺激。
c体外刺激后48小时通过ELISA测定IFNγ分泌。数值是4只小鼠的三次重复实验孔的平均值。
实施例4Her-2/neu特异性的T细胞克隆可识别人肿瘤细胞按实施例1所述，通过用感染了Her-2/neu ICD的腺病毒重组体的自体树突细胞体外致敏，得到对Her-2/neu具有特异性的T细胞克隆。为确定该T细胞克隆识别内源性表达Her-2/neu的人肿瘤的能力，进行了以下实验。
人肿瘤细胞系SKBR3(胸腺癌)和SKOV3(卵巢癌)均过量表达Her-2/neu。人肿瘤细胞系HCT-116(结肠癌)和MCF-7(胸腺癌)表达非常低的Her-2/neu蛋白质或不表达该蛋白质。HLA分型指出，这些肿瘤中仅MCF-7天然表达HLA-B4402(该克隆的限制性等位基因)。使用HLA-B4402的逆转录病毒重组体转导SKOV3、SKBR3和HCT-116肿瘤细胞系。用流式细胞术分析测定亲本和转导的肿瘤细胞系及对照成纤维细胞系上I类HLA、HLA-B44和Her-2/neu的表达。用如下FITC标记的单克隆抗体染色肿瘤细胞系或成纤维细胞系IgG(BectonDickinson，阴性对照)；抗I类HLA抗体(Sigma)；与HLA-B分子(包括HLA-B44)亚类结合的抗Bw4抗体(One Lambda)；抗Her-2/neu抗体CN2(来自Oncogene Sciences的Ab2)。固定样品并通过流式细胞术进行分析。
结果说明，如预期的，所有测试的细胞系均在细胞表面表达I类HLA。自体成纤维细胞和MCF-7肿瘤细胞表达HLA-B44，而亲代肿瘤细胞系SKBR3、SKOV3或HCT-116不表达HLA-B44。用HLA-B44逆转录病毒转导后，所有的肿瘤细胞系均表达HLA-B44。正如预期的，SKBR3和SKOV3肿瘤细胞系均在细胞表面上表达Her-2/neu，而且水平与通过逆转录病毒转导了Her-2/neu的自体成纤维细胞表达的Her-2/neu量相当。相反，MCF-7、HCT-116和未转导的成纤维细胞在细胞表面上表达非常少的Her-2/neu或不表达Her-2/neu。用Her-2/neu的逆转录病毒重组体转导的MCF-7细胞表达Her-2/neu，其水平与SKBR3和SKOV3表达的水平相当。
在IFNγ ELISA和TNFα生物测定试验中我们测试了Her-2/neu特异性CTL克隆(克隆17D5)识别上述细胞系的能力。表5显示了IFNγELISA的结果。克隆17D5特异地响应转导表达Her-2/neu的自体HLA-B4402阳性成纤维细胞而分泌IFNγ。重要的是，克隆17D5特异地响应转导了HLA-B4402的SKBR3和SKOV3肿瘤细胞，但不响应HLA-B4402阴性的亲代肿瘤细胞系或对照转导的肿瘤细胞系分泌IFNγ。克隆17d5不识别HLA-B4402转导的HCT-116肿瘤细胞系。此结果正如预期的一样，因为HCT-116肿瘤细胞系仅表达非常低水平的Her-2/neu。克隆17D5也不识别乳腺肿瘤细胞系MCF-7或Her-2/neu转导的MCF-7。对这些结果的最有可能的解释是MCF-7表达的HLA-B4402水平不够，因为Her-2/neu逆转录病毒转导的MCF-7上的Her-2/neu水平与相应转导的成纤维细胞上的Her-2/neu水平相似。(这可以通过使用Her-2/neu重组腺病毒感染MCF-7细胞使其表达非常高水平的Her-2/neu来克服)。
表5IFNγ ELISA证明ICD特异性T细胞克隆17D5对肿瘤的识别1

1使用从与所示刺激物或单纯培养基孵育的克隆17D5 T细胞获得的24小时上清液进行标准IFNγELISA。在该测定中17D5 T细胞和刺激物均以10,000个细胞/孔的量使用。在96孔板上一式三份地进行测定。从无T细胞孵育的刺激物获得的上清液作为对照，其值均不超过本底(数据未显示)。ELISA显色后，在450nm读取O.D.，使用570nm作为参照。
2显示的数据为三次重复实验孔的O.D.读数的平均值。
TNFα生物测定试验的结果与此IFN-γ结果相符。
ELISA克隆17D5特异地响应转导了表达HLA-B4402的逆转录病毒构建体的SKBR3和SKOV3而分泌TNFα(表6)。
表6TNFα生物测定试验证明T细胞克隆17D5对肿瘤的识别1

196孔板中一式三份地将克隆17D5 T细胞(10,000个细胞/孔)与所示APC(10,000个细胞/孔)一起或在单纯培养基中孵育。收获4小时上清液并将其加入TNFα敏感细胞系WEHI(以30,000个细胞/孔接种在96孔板中)。将WEHI细胞和上清液一起孵育过夜，并每孔加入1/10终体积的alomarblue。加入Alomar blue后7小时和24小时，读取O.D.570nm-630nm。所示结果为24小时时间点上的结果。
2O.D.数据为三次重复实验孔的平均值，指示了TNFα敏感WEHI细胞的相对存活力，较低的值指示细胞死亡增加，也即TNFα的分泌增加。
由于以上结果证明了使用ICD重组腺病毒体外致敏的CD8+T细胞能够识别过表达Her-2/neu的人肿瘤细胞，故该结果是有意义的。20％至40％的人乳腺癌以及一定比例的卵巢、肺和结肠癌过表达Her-2/neu。这些数据支持了ICD作为Her-2/neu阳性肿瘤疫苗的用途。
实施例5在大肠杆菌中表达人Her-2/neu HICD本实施例描述了构建用于表达重组人Her-2/neu ICD(HICD)蛋白质的构建体。
PCR扩增人ICD的开放阅读框，并将其亚克隆至修饰的pET28载体中用于在大肠杆菌中表达重组蛋白质。制备具有N端组氨酸标签的两个构建体，其中一个具有蛋白酶切割位点，而另一个没有此位点。制备一个带有C端组氨酸标签的构建体，和一个不带组氨酸标签的构建体。
HICD_plus_8_HIS(SEQ ID NOs5和11)的构建首先从pGS10 ATG质粒使用如下引物PCR扩增ICD编码区PDM-44(SEQ ID NO16)5′atctctggcgcgctggatgacgatgacaagaaacgacggcagcagaagPDM-45(SEQ ID NO17)5′cagggcgcgccactcgagtcattacactggcacgtccagacccagPCR条件如下10μl 10×Pfu缓冲液(Stratagene，La Jolla，CA)，1.25μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，3μl 10μM PDM-44寡聚物，3μl 10μM PDM-45寡聚物，80μl无菌水，2μl Pfu DNA聚合酶，约5ng pGS10Δ ATG DNA。热循环条件如下96℃ 2分钟的单个变性步骤；之后40个循环96℃ 30秒，68℃ 15秒和72℃ 6分钟45秒；最后72℃延伸10分钟。样品在进一步分析之前保存在4℃。将该PCR产物克隆在修饰的pT7blue质粒中，该质粒含有与在PDM-44引物中包括的BssHII位点符合阅读框的8His标签编码区。用BssHII和AscI消化载体和PCR产物。筛选方向正确的构建体，然后测序。之后将该构建体克隆至pET14b(Novagen，Madison，WI)的NcoI和AscI位点处。然后将该构建体克隆至pET28b(Novagen，Madison，WI)载体的NcoI和HindIII位点处。最终的构建体含有8组氨酸标签以及肠激酶切割位点。
构建HICD_in_pPDM_coding_sequence(SEQ ID NOs7和10)使用如下引物从cDNA模板PCR扩增ICD编码区PDM-591(SEQ ID NO18)5′cacaaacgacggcagcagaagatccggaag 3’PDM-592(SEQ ID NO19)5′gcgccactcgagtcattacactggcacgtc 3’PCR条件如下10μl 10×Pfu缓冲液(Stratagene，La Jolla，CA)，1μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，10μM PDM-591和-592寡聚物各2μl，83μl无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，1μl cDNA。热循环条件如下首先96℃变性2分钟；之后40个循环96℃ 30秒，66℃ 15秒和72℃ 5分钟；之后72℃最终延伸6分钟。用XhoI消化PCR产物，并将其克隆在经Eco 72I和XhoI消化的pPDM His(一种具有符合阅读框的His标签的修饰pET28构建体)中。通过序列分析验证正确的构建体，然后用其转化BLR pLys S细胞以便进行表达。
构建HICD_CT_His_coding_region(SEQ ID NOs4和8)使用如下引物从cDNA模板PCR扩增ICD编码区PDM-72(SEQ ID NO20)5′cgacttcatatgaaacgacggcagcagaagatc 3’PDM-61(SEQ ID NO21)5′ccacgtctagagaaggcgcgccatctggatcattaatgatgatgatgatgatgcactggcacgtccagacccaggta 3’PCR条件如下10μl 10×Pfu缓冲液(Stratagene，La Jolla，CA)，1μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，2μl 10μM PDM-72寡聚物，2μl 10μM PDM-61寡聚物，83μl无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，1μlcDNA。热循环条件如下首先96℃变性2分钟；之后40个循环96℃ 30秒，66℃ 15秒和72℃ 5分钟；之后72℃最后延伸6分钟。用NdeI和NotI消化PCR产物，并将其克隆在经NdeI和NotI消化的pPDMHis(一种具有符合阅读框的His标签的修饰pET28构建体)中。通过序列分析验证正确的构建体，然后用其转化BLR pLys S细胞以便进行表达。
构建HICD_native_coding_region(SEQ ID NOs6和9)用KpnI和AscI消化VR102人Her-2/neu，分离出人Her-2/neu的ICD区域的C端部分。将此704bp插入片断亚克隆至同样用KpnI和AscI消化(该消化从此构建体中除去了C端His标签，之后替换为所述704bp插入片断)的具有C端His标签的pET28HICD中。通过序列分析验证正确的构建体。
实施例6克隆并测序来源于her-2/neu特异性CD8 T细胞的TCRα和β链本实施例描述了实施例4所述Her-2/neu特异性CD8 T细胞克隆的T细胞受体(TCR)α和β链的克隆和测序。序列分析证明，该TCR的α链属于Vα16家族而β链属于Vβ14家族。此外，鉴定到独特的多样性和连接区段(负责应答的特异性)。
使用Trizol试剂从CTL克隆17D5的2×106个细胞中分离出总mRNA，并用Ready-to-go试剂盒(Pharmacia)合成cDNA。为了确定该克隆的Vα和Vβ序列，合成了一组Vα和Vβ亚型特异性引物(基于Clontech，Palo Alto，CA产生的引物序列)并将其和从各个克隆制备的cDNA用于RT-PCR反应。RT-PCR反应说明，所有的克隆均表达相应于Vβ14亚家族的共同Vβ序列。而且，使用从该克隆产生的cDNA，我们确定了表达的Vα序列是Vα16。为了从克隆17D5克隆全长TCRα和β链，设计了横跨TCR起始密码子和终止密码子的编码核苷酸的引物。引物如下TCRVα-16 5’(有义)(BamHI位点---Kozak--TCRα序列)(SEQ IDNO22)GGATCC---GCCGCCACC--ATGGCCTCTGCACCCATCTCGATCRα3’(反义)(SalI位点---TCRα恒定序列)(SEQ ID NO23)GTCGAC---TCAGCTGGACCACAGCCGCAGTCRVβ-14. 5’(有义)(BamHI位点---Kozak--TCRα序列)(SEQ IDNO24)GGATCC---GCCGCCACC--ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATCRβ3’(反义)(SalI位点---TCRβ恒定序列)(SEQ ID NO25)GTCGAC---TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC.
使用从CTL克隆合成的cDNA及上述引物，并使用校正热稳定聚合酶PWO(Roche，Basel，瑞士)进行标准的35循环RT-PCR反应。将所获特异条带(对于α链为约850bp而对于β链为约950bp)连接在PCR平端载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，转化大肠杆菌。鉴定含有全长α和β链的质粒转化的大肠杆菌，大规模制备相应质粒。对含有全长TCRα和β链的质粒进行测序。测序反应验证了全长TCRα和β链的克隆。α和β链的cDNA序列分别公开在SEQ ID NOs13和12中，而氨基酸序列分别公开在SEQ ID NOs15和14中。BLAST检索证实，该Vα属于Vα16家族而该Vβ属于Vβ14家族。负责该TCR特异性的多样性-连接(DJ)区是独特的。
从上文所述，应当理解，尽管为了举例说明的目的这里描述了本发明的具体实施方案，但可以进行多种修饰而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明仅受所附权利要求的限制。
序列表<110>Corixa CorporationHand-Zimmerman，SusanCheever，Martin A.
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Kalos，Michael D.
McNeill，Patricia D.
Vedvick，Thomas S.
<120>治疗和诊断Her-2/neu相关恶性肿瘤的组合物和方法<130>210121.544PC<140>PCT<141>2001-08-14<160>25<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>3768<212>DNA<213>人(Homo sapien)<220>
<221>CDS<222>(1)...(3765)<400>1atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg 48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa gtg tgc acc ggc aca gac atg aag 96Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag acc cac ctg gac atg ctc cgc cac 144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac ctg gaa ctc acc tac 192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc ttc ctg cag gat atc cag gag gtg 240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag gtc cca ctg 288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95cag agg ctg cgg att gtg cga ggc acc cag ctc ttt gag gac aac tat 336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
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Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu500 505 510Glu Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp515 520 525Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro530 535 540Gln Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro545 550 555 560Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly565 570 575Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu580 585 590Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val595 600<210>12<211>957<212>DNA<213>人<400>12atgggccccc agctccttgg ctatgtggtc ctttgccttc taggagcagg ccccctggaa 60gcccaagtga cccagaaccc aagatacctc atcacagtga ctggaaagaa gttaacagtg 120acttgttctc agaatatgaa ccatgagtat atgtcctggt atcgacaaga cccagggctg 180ggcttaaggc agatctacta ttcaatgaat gttgaggtga ctgataaggg agatgttcct 240gaagggtaca aagtctctcg aaaagagaag aggaatttcc ccctgatcct ggagtcgccc 300agccccaacc agacctctct gtacttctgt gccagcagtt tagattgggg cggactagcg 360ggagggttgg gcacagatac gcagtatttt ggcccaggca cccggctgac agtgctcgag 420gacctgaaaa acgtgttccc acccgaggtc gctgtgtttg agccatcaga agcagagatc 480tcccacaccc aaaaggccac actggtatgc ctggccacag gcttctaccc cgaccacgtg 540gagctgagct ggtgggtgaa tgggaaggag gtgcacaagt ggggtcagca cagacccgca 600gcccctcaag gagcaagccc gccctcaatg actccagata ctgctgagca gccgcctgag 660ggtctcggcc acttctggca gaacccccgc aaccacttcc gctgtcaagt ccagttctac 720gggctctcgg agaatgacga gtggacccag gatagggcca aacctgtcac ccagatcgtc 780agcgccgagg cctggggtag agcagactgt ggcttcacct ccgagtctta ccagcaaggg 840gtcctgtctg ccaccatcct ctatgagatc ttgctaggga aggccacctt gtatgccgtg 900ctggtcagtg ccctcgtgct gatggccatg gtcaagagaa aggattccag aggctag957<210>13<211>686<212>DNA<213>人<400>13atggcctctg cacccatctc gatgcttgcg atgctcttca cattgagtgg gctgagagct 60cagtcagtgg ctcagccgga agatcaggtc aacgttgctg aagggaatcc tctgactgtg 120aaatgcacct attcagtctc tggaaaccct tatctttttt ggtatgttca ataccccaac 180cgaggcctcc agttccttct gaaatacatc acaggggata acctggttaa aggcagctat 240ggctttgaag ctgaatttaa caagagccaa acctccttcc acctgaagaa accatctgcc 300cttgtgagcg actccgcttt gtacttctgt gctgtgagac cgaattcagg atacagcacc 360ctcacctttg ggaaggggac tatgcttcta gtctctccag atatccagaa ccctgaccct 420gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660ttccccagcc cagaaagttc ctgtga 686<210>14<211>318<212>PRT<213>人
<400>14Met Gly Pro Gln Leu Leu Gly Tyr Val Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala5 10 15Gly Pro Leu Glu Ala Gln Val Thr Gln Asn Pro Arg Tyr Leu Ile Thr20 25 30Val Thr Gly Lys Lys Leu Thr Val Thr Cys Ser Gln Asn Met Asn His35 40 45Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Gln50 55 60Ile Tyr Tyr Ser Met Asn Val Glu Val Thr Asp Lys Gly Asp Val Pro65 70 75 80Glu Gly Tyr Lys Val Ser Arg Lys Glu Lys Arg Asn Phe Pro Leu Ile85 90 95Leu Glu Ser Pro Ser Pro Asn Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser100 105 110Ser Leu Asp Trp Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Gly Thr Asp Thr Gln115 120 125Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn130 135 140Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile145 150 155 160Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr165 170 175Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His180 185 190Lys Trp Gly Gln His Arg Pro Ala Ala Pro Gln Gly Ala Ser Pro Pro195 200 205Ser Met Thr Pro Asp Thr Ala Glu Gln Pro Pro Glu Gly Leu Gly His210 215 220Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr225 230 235 240Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val245 250 255Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe260 265 270Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr275 280 285Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala290 295 300Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly305 310 315<210>15<211>228<212>PRT<213>人<400>15Met Ala Ser Ala Pro Ile Ser Met Leu Ala Met Leu Phe Thr Leu Ser5 10 15Gly Leu Arg Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val20 25 30Ala Glu Gly Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly35 40 45Asn Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln50 55 60Phe Leu Leu Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr65 70 75 80Gly Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys85 90 95
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<223>引物PDM-44<400>16atctctggcg cgctggatga cgatgacaag aaacgacggc agcagaag 48<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-45<400>17cagggcgcgc cactcgagtc attacactgg cacgtccaga cccag 45<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-591<400>18cacaaacgac ggcagcagaa gatccggaag 30<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-592<400>19
gcgccactcg agtcattaca ctggcacgtc 30<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-72<400>20cgacttcata tgaaacgacg gcagcagaag atc 33<210>21<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-61<400>21ccacgtctag agaaggcgcg ccatctggat cattaatgat gatgatgatg atgcactggc 60acgtccagac ccaggta77<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR Valpha-16 5′<400>22ggatccgccg ccaccatggc ctctgcaccc atctcga 37<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR alpha 3′<400>23gtcgactcag ctggaccaca gccgcag 27<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR Vbeta-14.5′<400>24ggatccgccg ccaccatggg cccccagctc cttggcta 38<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物TCR beta 3′<400>25gtcgactcag aaatcctttc tcttgac 2权利要求
1.有效地在患者体内引起免疫应答的分离的多核苷酸组合物，所述多核苷酸编码包含基本上由SEQ ID NO3组成的氨基酸序列的多肽。
2.有效引起免疫应答的分离的多肽组合物，所述多肽包含基本上由SEQ ID NO3组成的氨基酸序列。
3.包含权利要求1的多核苷酸或权利要求2的多肽以及药学可接受载体的药物组合物。
4.权利要求3的药物组合物，还包含免疫刺激剂。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述免疫刺激剂包含佐剂。
6.在患者体内引起免疫应答的方法，包括给患者施用有效量的权利要求1的多核苷酸。
7.权利要求6的方法，其中所述患者是HLA-B44阳性的。
8.权利要求6的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
9.在患者体内引起免疫应答的方法，包括给患者施用有效量的具有SEQ ID NO1大约第2026-3765位核苷酸的序列的多核苷酸。
10.权利要求9的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
11.分离的多核苷酸组合物，其包含SEQ ID NO13所示的TCR-α序列。
12.分离的多核苷酸组合物，其包含SEQ ID NO12所示的TCR-β序列。
全文摘要
本发明公开了用于治疗和诊断癌症，尤其是Her－2/neu相关癌症的组合物和方法。示例性组合物含有一种或多种Her－2/Neu多肽、其免疫原性片断，编码这些多肽的多核苷酸，表达这些多肽的抗原呈递细胞，和对表达这些多肽的细胞具有特异性的T细胞。这些公开的组合物可用于例如诊断、预防和/或治疗Her－2/neu相关恶性肿瘤。
文档编号C07K14/71GK1537164SQ01816447
公开日2004年10月13日 申请日期2001年8月14日 优先权日2000年8月14日
发明者S·汉德－齐姆默尔曼, M·A·齐弗, T·M·福伊, M·J·洛德斯, M·D·卡洛斯, P·D·麦克尼尔, T·S·维德威克, S 汉德-齐姆默尔曼, 卡洛斯, 洛德斯, 福伊, 维德威克, 麦克尼尔, 齐弗 申请人:科里克萨有限公司