用于恶性肿瘤诊断的引物、试剂盒和系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于恶性肿瘤诊断的引物、试剂盒和系统。所述用于恶性肿瘤诊断的引物为PTPRO甲基化特异性引物，所述PTPRO甲基化特异性引物包括：第一甲基化特异性引物序列5’-GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特异性引物序列5’-ACGACTACGCTAACGAACTCC-3’。实施本发明的用于恶性肿瘤诊断的引物、试剂盒和系统，通过检测外周血PTPRO基因甲基化水平，可以简单、方便且准确地诊断恶性肿瘤。
【专利说明】用于恶性肿瘤诊断的引物、试剂盒和系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及恶性肿瘤领域，更具体地说，涉及一种用于恶性肿瘤诊断的引物、试剂盒和系统。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。乳腺癌的病因尚未完全清楚，研究发现乳腺癌的发病存在一定的规律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。所谓高危因素是指与乳腺癌发病有关的各种危险因素，而大多数乳腺癌患者都具有的危险因素就称为乳腺癌的高危因素。
[0003]目前乳腺癌的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括乳腺X线摄影(乳腺钥靶照相)、彩超、乳腺磁共振检查等等。但是其通常效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检。因此需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中的恶性肿瘤诊断要么准确度不高，要么需要对患者造成人体伤害才能获得肿瘤组织的检材的缺陷，提供一种能够方便、准确地的进行恶性肿瘤诊断的引物、试剂盒和系统。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:构造一种用于恶性肿瘤诊断的引物，所述用于恶性肿瘤诊断的引物为PTPRO甲基化特异性引物，所述PTPRO甲基化特异性引物包括:第一甲基化特异性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特异性引物序列 5’ -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3’。
[0006]在本发明所述的用于恶性肿瘤诊断的引物中，所述恶性肿瘤包括乳腺肿瘤和食管鳞肿瘤。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是:构造一种用于恶性肿瘤诊断的试剂盒，包括上述所述的PTPRO甲基化特异性引物和PTPRO非甲基化特异性引物，所述PTPRO非甲基化特异性引物包括:第一非甲基化特异性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特异性引物序列5’ -ACACCATATATCCCCATAAACAA-3’。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的再一技术方案是:构造一种用于恶性肿瘤诊断的系统，包括:CT转化试剂溶液、M-消化缓冲液、蛋白酶K溶液、重亚硫酸盐转化试剂盒、PTPRO甲基化特异性引物和PTPRO ^^甲基化特异性引物，其中所述PTPRO甲基化特异性引物包括:第一甲基化特异性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特异性引物序列5’ -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3’ ；所述PTPRO非甲基化特异性引物包括:第一非甲基化特异性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特异性引物序列5’ -ACACCATATATCCCCATAAACAA-3’。
[0009]在本发明所述的用于恶性肿瘤诊断的系统中，所述恶性肿瘤包括乳腺肿瘤和食管鳞肿瘤。
[0010]在本发明所述的用于恶性肿瘤诊断的系统中，所述CT转化试剂溶液包括:亚硫酸氢钠、M-溶解缓冲液、M-稀释缓冲液和M-反应缓冲液，其中所述M-溶解缓冲液为3摩尔/L氢氧化钠，所述M-稀释缓冲液为高压过的超纯水，所述M-反应缓冲液为10毫摩尔/L对
苯二酚。
[0011]在本发明所述的用于恶性肿瘤诊断的系统中，所述M-消化缓冲液通过将20毫克RNA酶A溶解于2毫升0.01摩尔/L醋酸钠溶液，煮沸20分钟，室温冷却，加入I摩尔/LTris盐酸调整pH值到7.5制备。
[0012]在本发明所述的用于恶性肿瘤诊断的系统中，所述蛋白酶K溶液的浓度为20毫克
/毫升°
[0013]实施本发明的用于恶性肿瘤诊断的引物、试剂盒和系统，通过检测外周血PTPRO基因甲基化水平，可以简单、方便且准确地诊断恶性肿瘤。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中:
[0015]图1示出了不同乳腺组织和外周血中PTPR0，所有患者癌组织和配套外周血中PTPRO甲基化变化；
[0016]图2示出了检测乳腺癌组织、癌旁组织以及外周血中PTPRO启动子区甲基化水平的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0017]我们的研究证明PTPRO基因表达会逐渐被甲基化过程“沉默”。甲基化作用能够将甲基加到一个基因上，这个甲基化基因的活性就降低并且使其编码的蛋白水平也下降。因此，PTPRO基因被沉默时，PTPRO酶的水平就会相应下降，从而影响到PTPRO调控的蛋白质，进而导致癌症的发生。
[0018]我们的研究发现75%原发性肿瘤标本都可以检测得到PTPRO基因过甲基化，并且与肿瘤侵犯深度有关。而且乳腺癌患者的外周血样本PTPRO基因过甲基化仅存在肿瘤组织同样过甲基化的病例。这表明PTPRO基因可以作为一种无创性的针对乳腺癌及实体肿瘤的分子标记物。检测外周血中PTPRO蛋白的表达情况可应用于乳腺癌及实体肿瘤早期筛查诊断、治疗疗效观察、预后和复发监测等方面，作为一种重要指标和参考依据。同时我们也发现在其他癌症患者的外周血中PTPRO表达量普遍比正常人外周血中PTPRO表达量要高。
[0019]因此，本发明提出通过检测外周血中PTPRO蛋白的表达情况，对于乳腺癌、食管鳞癌患者等各类恶性肿瘤进行初期诊断。
[0020]下面通过实施例对本发明进行进一步地说明。在本发明中，除特别定义外，浓度单位均为每升溶液的摩尔浓度。本领域技术人员进一步知悉，本发明下述实施例中的各个浓度，摩尔分数，质量分数均可以根据实际进行进行调整。本领域技术人员可以实现上述调整。在本发明中，所有试剂均可以从SIGMA购得。
[0021]实验一、通过检测外周血中PTPRO蛋白的甲基化情况，对于乳腺癌患者进行诊断
[0022]实施步骤I临床标本收集
[0023]采集对象:156例乳腺癌患者手术切除肿瘤组织标本及手术前外周血均来自2009至2010年间广州军区总医院的临床病例资料完整的患者，均为女性，平均年龄(47±9)岁。所有患者术前均未接受放疗或化疗。同期采集39例乳腺良性病变的患者肿瘤组织、正常组织和血浆作为对照组。
[0024]具体方法如下:分别抽取乳腺癌患者及乳腺良性病变患者抗凝外周血2毫升，使用eppendorf Centrifuge5417R低温台式离心机,2500转/分钟,离心15分钟，收集上层血浆，-80°C保存，做好登记。
[0025]实施步骤2试剂制备
[0026]在使用前添加260微升的蛋白酶K储存缓冲液到蛋白酶K管中。使得蛋白酶K的终浓度为20毫克/毫升，完全溶解后储存在_20°C。在本发明的一个优选实施例中，可以采用灭菌的50mmol/Tris (PH8.0), 1.5mmol/L乙酸钙溶解,配置成20mg/mL的溶液。
[0027]转化试剂的制备:可采用固体化合物亚硫酸氢钠配置CT转化试剂。添加790微升M-溶解缓冲液和300微升的M-稀释缓冲液到1.78克亚硫酸氢钠粉末中，再添加160微升的M-反应缓冲液混合。在室温下溶解并且震荡10分钟或在摇床上摇动10分钟。应当在制备后立即使用，制备好的CT转化试剂对光很敏感，所以尽量减少在光下的暴露，应当在制备后立刻使用，其保存条件为隔夜使用室温保存，一周内使用4°C保存，一个月内使用-20°C保存。
[0028]其中M-溶解缓冲液为3摩尔/L氢氧化钠。M-稀释缓冲液为高压过的超纯水。M-洗涤缓冲液为用高压过的超纯水稀释的70%乙醇。M-反应缓冲液为10毫摩尔/L对苯二酚。
[0029]M-洗涤缓冲液的制备:添加24毫升无水乙醇到M-洗涤缓冲液试剂中。
[0030]实施步骤3DNA提取
[0031]血衆分离DNA利用重亚硫酸盐转化试剂盒(EZ DNA Methylation-Direct Kit?试剂盒)中试剂，按下表配方加入反应液，蛋白酶消化反应30分钟。
[0032]
【权利要求】
1.一种用于恶性肿瘤诊断的引物，其特征在于，所述用于恶性肿瘤诊断的引物为PTPRO甲基化特异性引物，所述PTPRO甲基化特异性引物包括:第一甲基化特异性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特异性引物序列5， -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3，。
2.根据权利要求1所述的用于恶性肿瘤诊断的引物，其特征在于，所述恶性肿瘤包括乳腺肿瘤和食管鳞肿瘤。
3.一种用于恶性肿瘤诊断的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1或2所述的PTPRO甲基化特异性引物和PTPRO非甲基化特异性引物，所述PTPRO非甲基化特异性引物包括:第一非甲基化特异性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特异性引物序列 5，-ACACCATATATCCCCATAAACAA-3，。
4.一种用于恶性肿瘤诊断的系统，其特征在于，包括:CT转化试剂溶液、M-消化缓冲液、蛋白酶K溶液、重亚硫酸盐转化试剂盒、PTPRO甲基化特异性引物和PTPRO非甲基化特异性引物，其中所述PTPRO甲基化特异性引物包括:第一甲基化特异性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特异性引物序列5 ’ -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3 ’；所述PTPRO非甲基化特异性引物包括:第一非甲基化特异性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特异性引物序列5’ -ACACCATATATCCCCATAAACAA-3’。
5.根据权利要求4所述的用于恶性肿瘤诊断的系统，其特征在于，所述恶性肿瘤包括乳腺肿瘤和食管鳞肿瘤。
6.根据权利要求4所述的用于恶性肿瘤诊断的系统，其特征在于，所述CT转化试剂溶液包括:亚硫酸氢钠、M- 溶解缓冲液、M-稀释缓冲液和M-反应缓冲液，其中所述M-溶解缓冲液为3摩尔/L氢氧化钠，所述M-稀释缓冲液为高压过的超纯水，所述M-反应缓冲液为10毫摩尔/L对苯二酚。
7.根据权利要求4所述的用于恶性肿瘤诊断的系统，其特征在于，所述M-消化缓冲液通过将20毫克RNA酶A溶解于2毫升0.01摩尔/L醋酸钠溶液，煮沸20分钟，室温冷却，加入I摩尔/L Tris盐酸调整pH值到7.5制备。
8.根据权利要求4所述的用于恶性肿瘤诊断的系统，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的浓度为20晕克/毫升。
【文档编号】C12Q1/68GK104004832SQ201410191177
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】张灏 申请人:张灏