神经丝蛋白的优选区段及其使用方法

专利名称：神经丝蛋白的优选区段及其使用方法
发明领域
本发明涉及可用于例如结合测定、蛋白质和抗体纯化、治疗学和诊断学的神经丝蛋白(neural thread protein)的优选区段。
背景技术：
早老性痴呆(AD)是一种目前不能治愈的神经变性性疾病，在全球影响至少1200万人。AD主要是一种老年病，其中在65岁老年人中发病率约1％，而至85岁时发病率上升至大约40％。因为医学进步、生命期望增加和出生高峰一代(the baby boomer generation)衰老，使人口整体老化，预期AD的总体发病率将上升，从而给健康保健系统以及患者和他们的护理人员和家庭增加更多的负担。
迄今为止仍不能有效地治疗AD。目前可利用的治疗诸如Aricept(盐酸多奈哌齐；Pfizer Corp.)、Exelon(酒石酸利伐斯的明；NovartisPharmaceuticals Corp.)和Cognez(他克林；Warner Lambert Corp.)，用来提供一种轻微至中度AD患者症状缓解的措施，因而并不能克服所述疾病的病因。
AD的临床诊断也不完善；准确度从普通执业医师的大致50-60％至转诊病人(referral)中心的早老性痴呆专家的80-90％之间变动(Molsa等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，48(11)1085-90(1985)；Rocca等，Ann.Neurol.，19415-424(1986)；Bums等，BMJ，301(6759)1026(1990)；Risse等，Am.J.Psychiatry，147(2)168-72(1990)；Gilleard等，ActaPsychiatr.Scand.，85(4)264-9(1992)；Mendez等，Alzheimer Dis.Assoc.Disord，635-43(1992)；Fleming等，Mayo Clin.Proc.71093-1107(1995)；Corey-Bloom等，Neurology，45211-218(1995)和Bowler等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，64(1)18-24(1998)。从初期症状至作出AD诊断时平均延迟约三年(Jorst等，J.Am.Geriatr.Soc.，43(11)1248-55(1995))。
人们已经认识到，可靠的生物标记在AD的准确诊断和早期诊断方面具有较大的帮助(Growdon等，Neurobiol.Aging，19109-116(1998))。虽然几种生化标记和遗传标记是目前可利的，但是总的来讲认为其临床病理相关性对于常规临床应用而言太低。例如载脂蛋白Eε4等位基因是一种只在AD病例的50％中发现的遗传危险因子(Myers等，Neurology，46(3)673-7(1996))，而在脑脊液(CSF)中的τ和β淀粉状蛋白测定以及血清Aβ在AD水平和非AD水平间有较大的重叠，从而限制其实用性(Pirttila等，J.Neurol.Sci.，127(1)90-5(1994)；Arai等，Ann.Neurol.，38649-652(1995)；Jensen等，Neurosci.Lett.，186(2-3)189-91(1995)；Motter等，Ann.Neurol.，38(4)643-8(1995)；Munroe等，Ann.Clin.Lab.Sci.，25(3)207-17(1995)；Tata等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatr.，59280-283(1995)；Vigo-Pelfrey等，Neurology，45(4)788-93(1995)；Iwatsubo T.，Neurobiol.Aging，19161-163(1998)；Nitsch等，Ann.Neurol.，37(4)512-8(1995)；van Gool等，Ann.Neurol.，37(2)277-9(1995)；Tamaoka等，J.Neurol.Sci.，151(1-2)65-8(1996)和Pirtilla等，Arch.Neurol.，53(2)189-93(1996))。其它已提出的标记例如对托吡卡胺的瞳孔反应(Scinto等，Science，2661051-1054(1994)和Growdon等，Arch.Neurol.，54(7)841-4(1997))和血清因子例如p-97(Kennard等，Nat.Med.2(11)1230-5(1996))，尚未在重复受控临床研究中得到证实。大多数已提出的AD标记的主要缺点是所述标记通常不是与AD病理相关的脑特异性分子，并且它们在外周体液中不能可靠地测量。
神经丝蛋白(NTP)是最近表征的脑蛋白的一个新家族。NTP是一种～41kD膜相关磷蛋白，其功能与神经炎性出芽和细胞死亡有关(de laMonte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。有使人信服的NTP与AD相关的证据。NTPmRNA在AD脑中与对照相比被正调节；AD大脑和CSF中的NTP蛋白水平高于对照；NTP免疫反应性在老年斑、神经纤维缠结(NFT)、变性中的神经元、神经纤维丝以及在AD和唐氏综合征(Down syndrome)脑中的营养不良性神经炎性出芽中清晰可见(Ozturk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86419-423(1989)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，86(3)1004-13(1990)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，113(2)152-64(1992)；de la Monte等，Ann.Neurol.，32(6)733-42(1992)；de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，133(1-2)26-35(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。在AD神经变性早期(在NFT形成之前)在神经元中发生NTP累积。在唐氏综合征(Down′s Syndrome)脑组织中也鉴定出NTP(Wands等，国际专利公布号WO 90/06993；de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。大多数唐氏综合征患者在中年后表现出与AD相似的神经病理，并且在生命后期发生与AD相似的多种认知缺陷。
已经显示AD患者和对照的脑脊液(CSF)中NTP水平在AD中持续升高(Chong等，J.Clin.Lab Anal.，6(6)379-83(1992)；de la Monte等，Ann.Neurol.，32733-742(1992)；de la Monte等，J.Clin.Ivest.，1003093-3104(1997)；Ghanbari等，J.Clin.Lab.Anal.，12(4)223-6(1998)；Ghanbari等，J.Contemp.Neurol.，19982-8(1998)；Kahle等，Neurology，54(7)1498-504(2000))。显示与非AD神经病对照相比，在AD中NTP升高有特异性，并且NTP升高与痴呆程度正相关(de laMonte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999)和Kahle等，Neurology，54(7)1498-504(2000))。在一项重要的研究中，89％早期AD患者CSF的NTP水平高于2ng/mL，而89％非AD对照CSF的NTP水平低于2ng/mL(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997))。
接下来，通过高效液相色谱、毛细管电泳和ELISA在尿中鉴定出NTP蛋白(Ghanbari等，J.Clin.Lab.Anal.，12(4)285-288(1998)和de laMonte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。发现在AD患者和对照中尿NTP水平与CSF水平相关，并且与非AD患者相比，尿NTP水平在AD患者中显著升高(Ghanbari等，J.Clin.Lab.Anal.，12(4)285-288(1998))。开发了一种在液相中使用金微粒与结合的单克隆抗NTP对尿样的测定，证明对AD而言所述测定既是高度灵敏的又是特异性的(Fitzpatrick等，Alzheimer′s Reprorts，3(3)155-159(2000))。
需要改进对于NTP的现有测定，包括需要开发可以在普通医学实验室或医生办公室进行的针对NTP的point-of-care测定。诸如以经济有效的方式从尿中常规纯化天然NTP方法的技术进步或者NTP的容易生产的类似物的研制也将改进任何这样的测定。
有证据表明，NTP可能在AD发病机理中起主导作用，从而使其成为药物开发的靶，以治疗AD。NTP与神经炎性出芽相关；异常神经炎性出芽与AD相关。NTP的过量表达可以引起磷酸-τ的细胞累积，而磷酸-τ又在NFT-一种在AD中痴呆的重要神经解剖学相关因子的生成之前(de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。另外，NTP的过量表达可以引起与氧化应激相关的凋亡性质的细胞死亡增加(de laMonte等，1999)。抑制NTP的表达或生化作用提供一种有效治疗AD、有前景的途径。
已经鉴定并描述了NTP的基因和预测的蛋白质序列(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997))。神经丝蛋白在美国专利第5,948,634号、第5,948,888号和第5,830,670号中首先描述并且要求保护，所有这些专利都关于“Neural Thread Protein Gene Expression andDetection of Alzheimer’s Disease(神经丝蛋白基因表达和早老性痴呆的检测)”。
已经鉴定出神经丝蛋白的其它种类(～26kD、～21kD、～17kD和～15kD)，并且其与神经外胚层肿瘤、星形细胞瘤和成胶质细胞瘤以及由于低氧、局部缺血或脑梗塞引起的损伤相关(de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，100393-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。
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本领域需要可用于与AD和唐氏综合征相关治疗和诊断的改进的NTP组合物以及用于与可用于以下疾病治疗和诊断的其它种类的神经丝蛋白有关的组合物神经外胚层肿瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它神经变性性疾病以及由于低氧、局部缺血和脑梗塞引起的损伤。本发明满足了这些要求。
发明概述
本发明涉及一个具有共有序列“HARLIL”及其同系物的NTP的新重复序列的家族。本发明所包括的Harlil肽包括但不限于“HARLIL”、“HARLCL”、“HHARLCL”、“HARL”、“MFARLIL”、“ARLIL”、“HARLIF”、“HHARLIF”及其同系物和结合配偶体。该组NTP肽和同源肽统称为“Harlil肽”。
本发明基于这样的意外发现所述Harlil肽具有以下独特的结合特性
□它们具有与NTP结合的亲和性，从而使其可用来作为捕获NTP的结合配偶体从体液例如尿液、CSF或血液中纯化NTP，检测和测量体液例如尿液、CSF或血液中的NTP，用于AD和唐氏综合征的药物开发以及下文公开的其它主题；
□它们具有与多种免疫球蛋白结合的亲和性，从而使其可用来纯化免疫球蛋白、检测和测量这样的免疫球蛋白；
□它们具有与自身结合的亲和性，从而使其可用来分离、分析测定和/或纯化与其缀合的蛋白质，在测定中用作NTP类似物以及下文公开的其它主题；且
□它们似乎在自动装配和/或与NTP和其它蛋白质相互作用中起作用，从而使其可用作治疗靶。
本发明也包括针对所述Harlil肽序列的抗体以及这类抗体的功能性片段。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的再一方面涉及NTP蛋白上所述Harlil序列的结合配偶体。这样的结合配偶体包括但不限于同源肽、有机肽模拟物、抗体或抗体部分以及共生同源物。
本发明包括对应于所述Harlil肽的核酸、含有至少一种编码至少一种Harlil肽的核酸的载体以及用于繁殖这类载体的宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)或其它有用的细菌或酵母菌种。所述载体可用于例如治疗性治疗或制备Harlil肽的方法中。
本发明还公开了采用本领域已知的常规技术制备本发明Harlil肽、抗体和核酸的方法。
本发明的另一方面涉及包含一种或多种Harlil肽、Harlil肽模拟物和/或其结合配偶体的药用组合物以及包含一种或多种编码一种或多种Harlil肽的核酸的药用组合物。所述药用组合物可用于例如治疗性治疗AD、神经外胚层肿瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它神经变性性疾病。
本发明包括Harlil肽、相应的核酸或Harlil模似物在AD、神经外胚层肿瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它神经变性性疾病诊断中的应用。使用一种或多种Harlil肽的诊断试验可以用来检验抗NTP或Harlil肽序列的抗体的存在，所述抗体可指示NTP的存在。虽然在所有人中都发现NTP，但在医学诊断为患有AD的患者(即DSM4患者)中发现的NTP量升高。另一方面，诊断试验可以使用可用来检测NTP存在的、抗一种或多种Harlil肽序列的一种或多种抗体。NTP的数量与以下疾病的存在相关AD、神经外胚层肿瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、其它神经变性性疾病。最后，诊断试验可以使用编码一种或多种Harlil肽的一种或多种核酸。在这类核酸和生物样品中的核酸之间的杂交指示NTP的存在。再者，NTP的数量与以下疾病的存在相关AD、神经外胚层肿瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它神经变性性疾病。在这类诊断试验中可以将本发明的Harlil肽、Harlil模拟物、抗体和核酸进行标记。
本发明的再一方面涉及用于实施本发明诊断方法的诊断试验试剂盒。这样的试验试剂盒包含一种或多种Harlil肽、Harlil模拟物、抗体、Harlil结合配偶体和/或核酸以及合适的试剂。
本发明也包括采用Harlil肽或Harlil模拟物从溶液中纯化NTP的方法。本发明包括应用这类方法的试剂盒。这样的试剂盒包含至少一种Harlil肽、Harlil模拟物或它们的混合物以及合适的试剂。
本发明也包括采用本发明的Harlil肽纯化抗体的方法和试剂盒。这样的试剂盒包含本发明的Harlil肽以及合适的试剂。
本发明还涉及治疗AD、神经外胚层肿瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤或其它神经变性性疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的本发明的一种或多种Harlil肽、Harlil模拟物(不限于Harlil肽模拟物)、抗体和/或核酸。
上文的概述和下文详细描述都是示例性的和说明性的，并且用来提供对要求保护的本发明的进一步解释。根据下文的详细描述，本发明的其它目的、优势和新的特征对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图简述


图1显示完整的NTP序列和完整的NTP序列中Harlil序列的位置(de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，551038-1050(1996))；
图2显示兔抗小鼠免疫球蛋白缀合物与Harlil肽(NTP-3)包被的微量滴定板结合的抑制随竞争性NTP-3/RGG的浓度(x轴)而变(在实施例5中描述的数据)；
图3显示采用基于Harlil肽的膜测定对107个生物样品测定的结果(在实施例4中显示的数据)；
图4显示测定与NTP结合的抗体部分的测定结果(在实施例6中显示的数据)；
图5比较对照尿样和重组NTP在ELISA形式竞争性NTP测定中的线性关系(在实施例8中显示的数据)；
图6显示在ELISA形式中使用Harlil肽将AD诊断的样品与年龄匹配的正常样品区分开来的竞争性亲和测定结果，证明在AD阳性患者中存在的阈值量(在实施例8中描述的数据)。
发明详述
本发明涉及一种包含NTP的一个、被称为“Harlil序列”的新重复序列的组合物。所述序列在NTP的氨基酸序列中出现四次
(a)45-51 THARLIL
(b)90-96 HHARLCL
(c)263-269 MFARLIL
(d)292-296 HHARLIF
参见图1。
本发明包括具有(a)、(b)、(c)、(d)区中任一个的序列或这些序列的同系物(包括但不限于“HARLML”)的肽。所述Harlil肽也可以在接头肽上的Harlil序列之前或之后具有额外的氨基酸残基。所述额外的氨基酸残基或接头肽可以是在NTP序列中在所述Harlil序列之前和之后发现的那些序列。例如氨基酸残基GITGMCT出现在残基46之前，而氨基酸残基YFFLV出现在NTP序列中的氨基酸50之后。因此，本发明所包括的Harlil肽包括NTP肽GITGMCTHARLILYFFLV。对于在(b)、(c)和(d)中叙述的Harlil肽而言，所述额外的氨基酸残基是邻接NTP序列中的Harlil序列的那些氨基酸残基。然而，没有证据表明所述侧翼序列不是作为接头起作用。具有额外的氨基酸残基的Harlil肽的总长度最好不超过25个氨基酸残基。
本发明范围也包括所述Harlil肽的同系物和变异体。通常通过用一种氨基酸取代另一种氨基酸来改变肽序列。根据改变氨基酸的目的，所述氨基酸可以用相似氨基酸或同源氨基酸或不相似氨基酸取代。有多种将氨基酸分类为相似或同源的标准。(Gunnar von Heijne，Sequence Analysis in Molecular Biology.第123-39页(Academic Press，New York，NY 1987)。
所述Harlil重复序列具有以下的独特特征(1)它可以与NTP结合；(2)它可以与多种免疫球蛋白结合；和(3)它可以与自身结合。这些独特的特征使得能够进行和提出如下所述的各种诊断应用和治疗应用。
A.组合物
本发明涉及NTP的Harlil肽，应用这类肽、肽模拟物、结合配偶体和/或同系物作为NTP的亲和结合配偶体以测定或纯化NTP，应用Harlil肽、肽模拟物及其同系物封闭NTP上的Harlil肽位点或者通过所述Harlil序列与NTP相互作用的物质的应用。本发明也包括针对这类Harlil肽序列的抗体以及对应于所述Harlil肽及其同系物的核酸。
Harlil肽及其同系物可以采用常规肽合成技术来制备。Harlil肽的模拟物可以采用联合化学技术来产生。
抗Harlil肽序列的单克隆抗体可以例如通过Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)首先描述的杂交瘤方法或者通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)来制备。多克隆抗体(即抗血清)可以例如通过用Harlil肽作为免疫原来免疫宿主动物例如兔或绵羊而制备。所述免疫通常包括用所述免疫原重复接种，通常以大约一周的间隔，至少接种两次。这样的接种产生针对所述免疫原的免疫应答并且使接种宿主的免疫系统产生针对所述免疫原的抗体。通常大约在最后一次加强接种后3-10天收集来自所述免疫宿主的血清。可以通过硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱或其它方便的分离和纯化技术，从所述血清中分离出免疫球蛋白。
对应于Harlil肽的核酸可以例如采用(a)标准重组方法、(b)合成技术或(c)它们的组合来制备。
B.Harlil肽的特性
1.与NTP结合
Harlil序列显示与NTP的结合特异性。当将Harlil肽或其类似物固定化时，它可以用来从溶液中纯化NTP。当用它来作为亲和测定的部分捕获NTP时，与NTP结合的特异性非常高并且在pH3.5至pH8时不受影响。该亲和测定的灵敏度至少与免疫测定一样高。例如通过ELISA测定含有约0.5ng/mL NTP的阳性尿混合液可以几乎稀释4倍，而仍可通过该亲和测定与阴性混合液区分开来(这在下文实施例6中有更加详述的描述)。此外，测定灵敏度可以通过应用一种更加灵敏的检测手段例如通过应用荧光或化学发光底物或放射性标记分析加以改进。
因为本发明的Harlil肽与NTP特异性地结合，所以它们可以用于检测生物样品中NTP或抗NTP的抗体存在的诊断分析中。已经显示体液中NTP高于正常水平指示AD、唐氏综合征或其它变性性脑部疾病的存在。
2.与免疫球蛋白结合
Harlil肽可与多种免疫球蛋白结合。所述肽结合似乎是通过所述抗体的Fc部分，而不是通过Fab部分。在生理pH下发生与免疫球蛋白的结合，尽管某些免疫球蛋白也在较低pH下结合。在较低pH下结合指示Harlil肽和某些抗体间的强亲和性，并且消除所述结合是由于电荷/电荷相互作用而不是亲和性所致的可能性。
因为Harlil肽与免疫球蛋白结合，所以它们可用于纯化免疫球蛋白分子。Harlil单体对免疫球蛋白的亲和性相当低，因此可以通过控制肽密度来控制Harlil缀合物的亲和力。随着Harlil肽密度的增加，对免疫球蛋白的亲和性也增加。最好是使用低至中等亲和柱，因为高亲和柱需要苛刻的洗脱条件，该洗脱条件可以使蛋白质和抗体变性，并且在宽稀释峰下洗脱，因为洗脱产物被稀释，所以这是不想要的(Wikstrm等，J.of Chromatography，59783-92(1999))。这样的稀释需要进一步浓缩被洗脱蛋白质或抗体，从而导致蛋白质或抗体产物的损失和/或损伤。
相比之下，低亲和色谱例如可以与Harlil肽一起使用的低亲和色谱具有使洗脱峰变窄的优点，从而避免了苛刻的条件(出处同上)。这样的纯化方法由于提供可用于制药和诊断应用的纯化蛋白，对于纯化治疗性和诊断性抗体是有价值的。
可用于免疫球蛋白纯化的现有已知肽类似物的序列比Harlil肽的序列长得多，并且所述类似物似乎需要模拟它们与免疫球蛋白相互作用所用的二级结构(Fassina等，J.of Mol.Recognition，9564-569(1996)；Guerrier等，J.of Mol.Recognition，11107-109(1998)；Palombo等，J.ofMol.Recognition，11247-249(1998)；Braisted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，935688-5692(1996)；Fassina等，J.of Mol.Recognition，11128-133(1998)；Palombo等，J.of Mol.Recognition，11243-246(1998)；Li等，Nat.Biotechnol.，16190-195(1998)和美国专利第5,084,559号；第5,100,788号；第6,013,763号。本发明相对短的Harlil肽对于生产和贮存而言容易得多且有经济效益。
本发明Harlil肽的再一应用涉及其在诸如ELISA和免疫色谱纸条的形式的诊断试验中的应用。因为本发明的Harlil肽与免疫球蛋白结合，所以所述肽提供在免疫测定系统中用于捕获、分离或锚定的抗抗体和A蛋白和G蛋白的有经济效益的捕获(trap)材料代用品。目前在ELISA和免疫色谱纸条中使用的捕获材料即抗抗体和A蛋白和G蛋白对于制备和保持而言是昂贵的。这正好与相对简单地制备和有经济效益地贮存本发明的Harlil肽相反。
3.与自身结合
本发明的Harlil肽和类似物能够与自身结合，因此当与蛋白质缀合时，所述蛋白质如果不在非常低pH或非常低稀释度下保持的话将会自我聚集。所述载体蛋白在中性pH下可以自我聚集并且从溶液中沉淀出来。
另外，因为其独特的自身结合特性，所以Harlil肽可以在测定中用作NTP类似物。这是因为所述Harlil肽复制了NTP的自身结合特性。在序贯测定或竞争性测定中，NTP将会与Harlil肽缀合物固相结合，并且在洗涤期间仍保持结合，在此期间它阻断免疫球蛋白(例如兔IgG)的结合。所述Harlil肽也可以在夹心测定中用作捕获抗体替代物。本发明的Harlil肽是比NTP蛋白便宜并且更有经济效益的测定材料。
Harlil肽的自我聚集特性可以具有治疗应用。因为Harlil序列使与其缀合的蛋白质相互结合，这表明通过这些序列NTP自我缔合和/或与其它蛋白质缔合。这种缔合可以是分子内或分子间的。亲和柱和微量滴定板结合游离NTP(如下文实施例中所述的)的能力表明，在天然NTP中所述Harlil序列可能是表面可及的。
有可能NTP的毒性全部或部分是由于高度相互作用性Harlil序列所致。因此，NTP的毒性可能是由于自我聚集所致，或它可能是由于高反应性Harlil序列与其它脑组分的相互作用所致。通过阻断NTP的该序列，人们可以阻断其可相互作用的能力。
显然NTP参与神经变性级联。通过靶向NTP而中断或改变级联方向的能力提供了一个治疗机会。例如，通过应用Harlil肽与NTP结合部位相互作用的能力，从而封闭NTP上潜在的反应部位进行治疗性干涉是可行的。另一方面，本发明的Harlil肽和模拟物可用于使药物靶向表达Harlil序列的细胞。
自身缔合的肽已经在生物材料中作为生物胶粘剂使用。因此，人们可以利用所述肽自身缔合或自我识别的性质，来诱导非缔合的蛋白或肽缔合，使多种部分锚定于表面，或者指导分子至靶部位。人们认识到，这样的细胞粘附诱导肽可以用来设计合成组织和器官(Mayo，K.H.，TIBTECH，18-212-217(2000年5月)。也已经显示这样的材料本身可用来构建作为pH和结合敏感性的凝胶系统(出处同上)。另外，Harlil肽序列的聚合作用和/或多次重复可以提供具有结构特征和较高亲和力的组合物。
NTP序列中Harlil序列的重复表明，Harlil序列可能在NTP的装配或聚合方面起作用。例如，在胶原蛋白中，在各条链上随后形成吡啶啉键合的位点自我缔合的区域也表现出高度同源性，表明这些自我鉴定同源区充当关键结构并且有功能作用。可能所述“HARLIL”位点独立地或在聚合物阵列中与其它脑蛋白相互作用并且对于NTP的功能性是关键性的。
如果NTP的过量产生引起AD和相关疾病-神经变性性疾病病理，则可以用基于所述HARLIL模型的治疗药，抑制NTP蛋白的产生或折叠，和/或阻止NTP与其它组分的聚合或相互作用。例如，如果通过给予一种或多种Harlil肽或Harlil模拟物，NTP聚集、或折叠或装配可以被抑制，则人们可以预期NTP的蛋白酶降解得到增强。因此人们可以通过给予一种或多种Harlil肽或Harlil模拟物达到除去过量的NTP。另一方面，Harlil肽或Harlil模似物治疗药可用来控制NTP单体或聚集物与神经变性级联其它组分的相互作用。
许多自我装配或聚合的蛋白质具有重复结构。最了解的是带有在每条链中重复多达6次的短重复序列gly X Y的胶原蛋白。(Lacy等，“Identification of FLRT1，FLRT2 and FLRT3a novel family oftransmembrane leucine rich repeat proteins(一个跨膜富亮氨酸重复蛋白的新家族—FLRT1、FLRT2和FLRT3的鉴定)，”Genomics，62(3)417-26(1999))。其它研究表明，特定的重复序列涉及结合的成核现象。(Snellman等，“A short Sequence in the N-terminal region is required for thetrimerization of type XIII collagen and is conserved in other collagenoustransmembrane proteins(XIII型胶原蛋白的三聚化需要N末端区的一个短序列并且所述短序列在其它胶原跨膜蛋白中是保守的)，”EABO J.，19(19)5051-59(2000))。还有研究表明，对于自我装配关键性的胶原蛋白肽Pro Pro Gly，在原胶原蛋白与侣伴蛋白HSP7的相互作用中也是关键性的。(Koide等，“Conformational requirements of collagenouspeptides for recognition by the chaperone protein HSP47(侣伴蛋白HSP7识别对胶原蛋白肽的构象需求)，”Biol.Chem.，275(36)27957-27963(2000))。对层粘连蛋白中自我识别的特异性进行了研究。(Schittny，J.C.，“Affinity Retardation ChromatographyCharaterization of the Method andIts Application(亲和滞留色谱方法的表征及其应用)，”Anal.Biochem.，222140-148(1994))。
因此，有证据表明，聚合或形成原纤维结构的蛋白质一般通过蛋白质上识别自身的特定结构域(自我识别)的特定结构域自我装配而做到这一点。再者，这些蛋白可以利用这些相同的识别位点与其它蛋白相互作用。如同A蛋白与Fc相互作用一样(Deisenhofer，J.，“Crystallographic Refmement and Atomic Models of a Human Fc Fragmentand Its complex with Fragment B of Protein A from Staphylococcus aureusat2.9-and 2.8-A Resolution(人Fc片段及其与来自金黄色葡萄球菌的A蛋白B片段的复合物在2.9-A和2.8-A分辨率下的晶体学精修和原子模型)，”Biochem.，20(9)2361-2370(1981))，这些相互作用同Harlil序列的相互作用一样，似乎是通过疏水作用和离子相互作用。
就NTP而论，似乎表明，在自我装配中最有可能起作用的Harlil结构域是高度同源的，并且事实上，几乎是完全保守的。“亮氨酸拉链”利用自我识别，其中富亮氨酸序列段结合在一起。然而，亮氨酸拉链不如Harlil序列独特。设想Harlil序列在自我装配以及NTP与其它脑组分的相互作用中起关键作用。
朊病毒和用朊病毒组分在酵母中的实验提供这样的证据，蛋白质可以呈现自我聚集构象。(Serio等，“Nucleated ConformationalConversion and the Replication of Conformational Information by a PrionDeterminant(由朊病毒决定簇引起的构象信息的成核构象转换和复制)，”Science，2891317-21(2000)；和Sparrer H.E.，“Evidence for thePrion HypothesisInduction of the Yeast(PSI+)Factor by in vitro-Converted Sup35 protein(朊病毒假说的证据体外转换的Sup35蛋白可诱导酵母(PSI+)因子)，”Science，289(5479)595-599(2000))。
Li和Lindquist已经说明，他们可以通过含有肽序列22-69的SUP蛋白的遗传融合部分给无关蛋白赋予SUP朊病毒活性。因此，他们证明，赋予SUP35蛋白特征的朊病毒位于SUP 22-69肽中。同样，本发明涉及引起聚集的自我鉴定的肽。通过在蛋白上移植所述序列(通过缀合)，可以给该蛋白质赋予自我聚集结果，观察到高达95％的Harlil蛋白缀合物在生理pH下立即沉淀。
****
给出以下实施例用以说明本发明。然而，应当理解，本发明并不限于这些实施例中描述的具体条件或细节。在整个说明书中，包括美国专利在内的公众可得到的文献的任何和所有参考文献都通过引用结合到本文中。
实施例1
本实施例的目的是鉴定神经丝蛋白的若干Harlil序列并且测定其与NTP的反应性。
合成以下Harlil序列(Synpep，Dublin CA)，将其与马来酰亚胺活化兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove PA)缀合，评价它们的NTP免疫反应性。加入一个接头，该接头为在NTP的90-96HHARLCL序列之前和之后出现的蛋白质序列重复。
1.(NTP-1)LHARLCLANFCGRNRV
2.(NTP-2) LARLCLANFCGNNNV
3.(NTP-3) CARYRTGHHARLM
4.(NTP-4)HHARLPLANFCG
5.(NTP-5) RTGHHARLC*LANFC
6.(NTP-6)CESARYRTGHHARLC*
7.(NTP-7) DNTHHARLIL
8.(NTP-8)SHHARLIL
*用乙酰氨基甲基(Acetamido Methyl)(C3H6NO)封闭。
与载体蛋白缀合是通过一个半胱氨酸。因此，肽NTP-1和NTP-2产生混合缀合物的结果是因为存在不止一个半胱氨酸残基。因此，对于肽NTP-5和NTP-6而言，将第二个半胱氨酸用ACM封闭。
所述NTP序列中所鉴定的序列位置示于图1中。尽管所有的Harlil类似物都显示一定的反应性，但是选择NTP-3供大多数研究用，是因为它提供良好反应性，同时由于它具有一个半胱氨酸残基，而便于操作。
如上所述，本发明范围也包括Harlil肽的同系物和变异体。为了构建本实施例的同源肽，使用同源氨基酸。所用的取代标准是电荷和/或大小。因此，在NTP肽3中选择用甲硫氨酸取代半胱氨酸是基于在这两个氨基酸之间的总体相似性以及从该关键性氨基酸序列段中除去一个反应性半胱氨酸的需要。选择用脯氨酸取代半胱氨酸是试图观察当它在所述蛋白质中而所述半胱氨酸在二硫键中时这是否可以模拟所述肽的构象形式。
本领域技术人员已知影响或研究亲和性相互作用的其它变化包括但不限于例如用其它疏水性氨基酸例如异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸替换亮氨酸；替换酸性氨基酸或碱性氨基酸；用苯丙氨酸替换组氨酸以测定电荷与空间的效应；用天冬氨酸替换天冬酰胺或者用谷氨酸替换谷氨酰胺，以评估电荷与空间的效应；以及用苏氨酸替换丝氨酸、用半胱氨酸替换苏氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用赖氨酸或组氨酸替换精氨酸以及用色氨酸或苯丙氨酸替换酪氨酸。
似乎没有理由表明需要NTP的侧翼序列，除非作为间隔序列，因为只有Harlil肽序列有活性。给所述侧翼序列引入改变使所述肽的碱性或疏水性降低。
实施例2
本实施例的目的是证明可应用NTP-3作为亲和配体来亲和纯化NTP。在该方法中，在亲和柱上从得自AD患者的尿样中纯化NTP。供试验用的含NTP尿样的制备所用的NTP生物来源是诊断患有AD的患者(BOU1)的尿液。在加样至柱材料之前，按照以下尿液加工方案处理所述生物样品以供AD试验用
1.尿液用Ames MultistixTM(Bayer，Indiana)检验。如果样品有以下任一种情况则将其弃去(a)细菌污染阳性；(b)病理性高水平的蛋白例如与肾病相关的蛋白(该试验不排除对缺乏病理水平的蛋白的NTP阳性的样品)、酮、血液、尿胆素原、亚硝酸盐、白细胞阳性；(c)pH高于7.5或低于4.5；或(d)比重高于1.025。
2.将尿液以3000xg离心15分钟，以除去细胞碎片。
3.用注射器使尿液通过0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，使滤液含有0.05％叠氮化物。
4.将所得的等份样品置于Amicon CentriconYM-10 Millipore的顶部储存器中，以3000xg离心1小时。
5.从离心机中取出样品，此时该样品约为原始体积的25％用1.5mL Tris缓冲盐溶液(TBS)使其恢复至原始体积。
6.重复步骤4和5，将样品以3000xg再离心30分钟，然后从离心机中取出样品，向样品中加入1.5mL TBS。
7.然后将样品以3000xg离心30分钟，然后从离心机中取出样品，此时样品为原始体积的四分之一。
8.然后将样品转移至硼硅酸盐玻璃小瓶中并于-20℃冷藏。柱子的制备按照生产商的说明，将NTP-3与溴化氰活化的琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO)缀合。一旦制成，则将柱材料在含有0.01％叠氮化物的25mM TRIS缓冲盐溶液(TBS)pH7中贮存。色谱法将11mL亲和柱材料与25mL尿样(如上所述处理以获得4倍浓缩样品的TBS(pH7)溶液)和25mL 0.025M甘氨酸缓冲液(PH3.5)一起温育1小时。收集未吸附的材料(流通液)。然后柱子用5倍体积的1x TBS(pH7)洗涤，在11mL 0.1M甘氨酸(pH2)中洗脱。洗脱后，立即将洗出液用NaOH调至pH7，然后如实施例1所述采用AmiconCentriconYM-10(Millipore，Beverly MA)浓缩至1mL。分析亲和柱洗出液中存在的NTP活性采用检验尿液中神经元丝蛋白的7C GoldTM Stirps，测定亲和测定活性(Nymox Pharmaceutical Corp.，Maywood NJ.参见例如Fitzpatrick等，Alzheimer′s Reports，3(3)155-159(2000))。用7C GoldTM纸条测定的所有活性位于pH2洗出液流分中。蛋白质浓度通过考马斯蓝染色(BioRad，Hercules，CA)测定，洗出液中的蛋白质浓度为108μg。这大约是起始蛋白质浓度的3％。用Bicinchoninic Acid kit(Cat.M 23223，BioRad)测定，蛋白质浓度为145μg。缓冲液校正的280nm的吸光度为390，表明有390μg蛋白质。用吸光度测量获得的较大蛋白质量可能是在NTP中存在大量的芳族氨基酸的结果，采用这种测量技术可以引起对蛋白质的过高估计。通过凝胶电液分析来自亲和柱洗出液的NTP蛋白将1μg洗出物(大约110-145ng)在12.5％十二烷基硫酸钠(SDS)微型凝胶(AmershamPharmacia Biotech，Sweden)上电泳，然后用银染色。大约在29kD、33kD、40-45kD和60kD处观测到条带。在20-35kD、35-45kD和45-65kD处将凝胶切成条状，置于100μlTBS中，让其针对TBS透析过夜。然后如实施例1所述采用Amicon CentriconYM-10浓缩条带洗出液，采用7C GoldTM Assay测定活性。
在35-45kD条带中，大约在41kD观测到NTP反应性。其它条带没有观测到活性。NTP的报道分子量为41kD。因此，数据表明，与亲和柱结合的NTP-3选择性地结合AD患者尿样中存在的NTP蛋白。
该实施例证明，Harlil肽NTP-3与NTP特异性结合，并且可应用Harlil肽例如NTP-3作为用于亲和纯化NTP的亲和配体。
实施例3
本实施例的目的是说明Harlil肽的自我聚集能力。Harlil肽NTP-3在中性pH下形成二硫键(因为半胱氨酸残基)且二聚化。由于二聚化肽可以结合二个免疫球蛋白，所以它可以引起沉淀。使用兔免疫球蛋白证实了Harlil肽的这一特性。
在pH7下加入1mg Harlil肽NTP-3的1ml二甲基亚砜(DMSO)溶液至3.4mg兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)。让混合物透析过夜，第二天早晨观察到明显的白色沉淀。通过离心除去沉淀，采用Perkin Elmerλ3B型分光光度计，根据280nm的吸光度测定上清液的蛋白质浓度。结果示于表1中。在低pH例如pH为3.5或3.5以下可防止免疫球蛋白的沉淀。
*兔IgG
该实施例证明所用的Harlil肽具有分离和/或纯化免疫球蛋白的能力。
实施例4
本实施例说明Harlil肽在检测和定量NTP存在中的实用性。基于膜的测定7C GoldTM测定由5mm×45mm纸条构成，有2个捕获带和1个的样品接受区位于所述纸条上。第1和第2捕获带分别与样品接受区相距16mm和24mm。每个捕获带约深4cm。
P22-1
7C金纸条
第2捕获带
第1捕获带
装有标记金微粒的容器
标记金微粒迁移至第1或第2捕获带。第1和第2捕获带中的标记金比率与样品中存在的NTP量相关。参见Fitzpatrick等的美国专利第6,121,008号。NTP-3缀合物的制备3.8mg/mL浓度的马来酰亚胺活化兔免疫球蛋白(RGG)(Pierce，Rockford，IL))用1 M柠檬酸使pH为3.5。然后向RGG中加入30倍摩尔浓度过量的Harlil肽NTP-3的DMSO溶液。监测NTP-3/RGG缀合物的pH，让其在缓慢搅拌下于室温反应过夜。然后将缀合物针对0.5mM柠檬酸磷酸缓冲液(pH3.5)充分透析。7C GoldTM纸条测定物的制备将经透析的、与RGG缀合的NTP-3在0.5mM柠檬酸磷酸缓冲液(pH3.5)中稀释至1mg/mL。静置过夜后，使用XY3000TM Biodot(IrVine.CA)，将6μl/cm缀合物包被在膜(Loprodyne 3，Pall，East Hills，NY)上第1捕获带中。接下来，将0.5mg/mL山羊抗小鼠免疫球蛋白(DAKO#20109，Denmark)包被在膜上NTP-3/RGG缀合物之上1cm的第2捕获带中(采用与NTP-3/RGG包被相同的参数)。将所述膜或7C GoldTM纸条加热风干30分钟，切成5mm的纸条，干燥下贮存。该捕获带在NTP不存在时将结合抗NTP抗体包被的金。7C GoldTM测定使用抗NTP抗体N314(de la Monte等，J.of Neuropath.Exp.Neurol.551038-1050(1996))。该测定的基础是NTP被金上的N314抗NTP抗体螯合并运输至NTP-3捕获带，在此NTP受到竞争而离开N314并且与第1捕获带结合，在这种情况下，NTP阻断金上的抗体与第1捕获带结合，结果，金迁移至第2捕获带。因此，在NTP存在时，更多的金迁移至第2捕获带。胶体金胶体金如Colloidal Gold，M.A.Hayat编著(Academic PressLimited，London(1991))中所述的方法制备，然后用20μg/mL浓度的纯化N314抗NTP抗体包被。然将抗体包被的胶体金在冷冻保护缓冲液(Serex Inc.，Maywood，NJ)中稀释并冻干。使用Virtus(Gardiner，NY)600SL & 12SL型冻干机，在2mL硼硅酸盐管形瓶(Wheaton #223683；Millville，NJ)中将足以用于一个纸条的量冻干。
患者样品如实施例2中所述，将107个患者样品加工并浓缩。7C GoldTM测定将50μl每种经加工和浓缩的患者样品加入至NTP-抗体包被的冻干金中。将混合物在室温下温育15分钟，然后将7CGoldTM纸条置于所述管形瓶中，直到纸条顶部出现绿色线指示测定完成。取出纸条，让其干燥。
结果总结在NTP不存在时，大多数NTP抗体包被的金与Harlil肽NTP-3捕获带结合。NTP Harlil肽固相微量滴定板以非常低的亲和力结合小鼠抗体，而当其在金上为聚集状态时，N314单克隆抗体与所述捕获带结合。然后，采用光密度计(Gretag D19C，Switzerland)读出条带1和2中的颜色强度。计算比值，该比值等于第1捕获带反射率除以第1捕获带反射率加上第2捕获带反射率之和，将样品比值除以指标或截止样品的比值。该数值被称为指标值。图3中图示的测定结果显示正常样品与AD样品非常好地分开。
实施例5
本实施例的目的是说明NTP与Harlil肽包被的微量滴定板的结合可以被未缀合的Harlil肽抑制。
微量滴定板的制备将如实施例4中制备的、30∶1比率的Harlil肽/免疫球蛋白复合物NTP-3-RGG以0.5μg/孔的浓度包被在Immulon4微量滴定板(Dynex，Chantilly，VA)上。
标准品重组NTP的TBS(在de la Monte等，J.of Neuropath.Exp.Neurol.，551038-1050(1996)中有描述)，0.01％叠氮化物(Nymox Pharm.Corp.，Lot4-7-98)在TBS中连续稀释。将100μl每种稀释液在pH3.5下温育1小时。然后将各个稀释液在TBS、0.1％白蛋白和0.05％Tween80中洗涤15分钟。接着在TBS和0.05％Tween80中洗涤3次。
微量滴定板测定然后加入100μl 1∶8000稀释度的过氧化物酶缀合的兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)，让其反应30分钟。微量滴定板用TBS和0.05％Tween 80洗涤2次，然后加入150μl四甲基苯(TMB)(Serex Inc.，Maywood，NJ)。然后将混合物温育10分钟，用50μl 2N HCl终止。在SLT340ATTC分光光度计上读出吸光度。
采用该系统，显示单体NTP-3抑制缀合物与板的结合。参见图2。
实施例6
本实施例的目的是证明抗体与Harlil肽包被的微量滴定板特异性地结合并且检验抗体的哪个部分(Fc或Fab)正与Harlil包被的板结合。被测抗体以下抗体得自Jackson Immunoresearch(West Grove，PA)(1)碱性磷酸酶(AP)标记的亲和纯化兔IgG抗小鼠抗体；(2)AP标记的亲和纯化兔IgG抗小鼠(Fab2)；和(3)AP标记的亲和纯化兔IgG抗鸡。
用兔IgG抗鸡(抗体(3))来消除兔抗小鼠(抗体(2))识别NTP-3/RGG缀合物中的RGG的可能性。抗体(2)与抗体(1)相同，只是抗体(2)缺少IgG的Fc部分。
测定方式如实施例5中所述。加入非免疫纯化兔、鸡和小鼠IgG至1mg/mL(参见图4)。对照为1mg/mL BSA(牛血清白蛋白)、α-糖蛋白、AD阳性和阴性对照尿液以及80、40、20、10和5单位的重组NTP。兔IgG和鸡IgG均以剂量依赖性方式竞争置换下AP缀合物。参见图4。Fab2不与该板结合。
结果总结两种全分子—兔抗小鼠和兔抗鸡均与用NTP-3/兔IgG包被的微量滴定板结合。Fab标记的抗体不表现出任何结合(结果未显示)。这些结果表明，Harlil肽抗体的结合通过抗体Fc区的识别来实现。
Harlil肽对不同种类的IgG的亲和力有所变化。例如，小鼠单克隆抗体表现出对NTP-3缀合物的亲和力比对兔IgG的亲和力低得多。参见Fig4。
实施例7
本实施例的目的是确定NTP是否识别G蛋白中识别抗体Fc部分的序列。
G蛋白通过Fc区结合抗体。由于该实施例的结果表明，Harlil肽也结合免疫球蛋白的Fc部分，而不结合Fab部分，因此测定NTP是否识别G蛋白中识别抗体Fc部分的序列。具体地说，由于Harlil肽识别Harlil肽、Harlil肽识别抗体的Fc区以及G蛋白识别抗体的Fc区，因此该实验确定G蛋白是否识别NTP。
NTP阳性样品和NTP阴性样品均可通过G蛋白柱。NTP并未显著减少。这些结果支持这样的结论G蛋白不与NTP结合。
通过Fc区的结合可能具有治疗应用，因为在免疫系统中Fc区用来识别受体。
实施例8
本实施例的目的是证明在微量滴定板测定形式中使用Harlil肽的竞争性亲和测定。
微量滴定板的制备将如实施例4中制备的、30∶1比率的Harlil肽/免疫球蛋白复合物NTP-3/RGG以20μg/孔的浓度包被在ImmulonII微量滴定板(Dynex，Chantilly， VA)上。
样品的制备如实施例2中所述制备30个尿样供试验用。由于抗体Fc在该测定中可能有干扰，因此将样品在100 K Amicon Centricon(Millipore Inc.，Beverly MA)中离心，以除去任一抗体，然后对滤液进行测试。(为了防止诊断试验中的假阳性，消除Harlil肽结合非NTP抗体的能力。例如，免疫球蛋白水平高于100μg/mL的样品在测定前必须使免疫球蛋白水平降至低于100μg/mL)。
对照使从未诊断出任何神经变性性疾病的个体的尿液制备的尿混合液通过如实施例2中所述制备的亲和柱。所得的尿混合液被称为“经吸附的(stripped)”尿。
然后用经吸附的尿通过适当稀释的高浓度混合液(high pool)制备中等范围对照。从在NTP测定中测试为阳性的、诊断患有AD的患者的一批样品中制备高浓度混合液(参见实施例4)。
标准品将重组NTP(Nymox Pharmaceutical Corp，Montreal Canada)在TBS中稀释，以形成标准品。标准品指定的单位值为40、20、10和0。因为有证据表明尿液中的NTP可被部分降解，所以NTP量以重组NTP单位表示，而不以重量表示。图5比较对照尿样和重组NTP在微量滴定形式竞争性NTP测定中的线性关系。
测定在所述测定中如下测试患者样品向板的各孔中加入50μl1∶5000稀释度的过氧化物酶缀合的兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)和50μl样品或标准品。将板在室温下温育1小时，然后在TBS、0.1％白蛋白和0.05％Tween80中洗涤3次。向各孔中加入100μl PNPP(磷酸对硝基苯酯)(Moss，Pasadena，MD)。先于30分钟时，此后以15分钟的间隔，在BioRad Reader上读出405nm的OD，直至TBS标准品的OD在2-2.5之间。图6所示的结果表明，虽然NTP存在于所有样品中，但在AD阳性患者中存在的量升高。可以采用年龄匹配的对照容易地测定出这一升高的量。因此，测定生物样品中NTP量的诊断试验可以用来以高准确度诊断AD或其它神经变性性疾病。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本发明包括本发明的所述修改和变化，条件是它们在所附权利要求书及其等同方案的范围内。
序列表
<110>尼莫克斯药品公司(NYMOX PHARMACEUTICALS CORPORATION)
<120>神经丝蛋白的优选区段及其使用方法
<130>018792/0195
<140>PCT/US01/42813
<141>2001-10-25
<150>09/697,590
<151>2000-10-27
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1442
<212>DNA
<213>未知生物体
<220>
<223>未知生物体的描述NTP DNA序列
<220>
<221>CDS
<222>(15)..(1139)
<400>1
tttttttttt tgag atg gag ttt tcg ctc ttg ttg ccc agg ctg gag tgc 50
Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys
1 5 10
aat ggc gca atc tca gct cac cgc aac ctc cgc ctc ccg ggt tca agc 98
Asn Gly Ala Ile Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser
15 20 25
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30 35 40
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45 50 55 60ctc cat gtt ggt cag gct ggt ctc gaa ctc ccg acc tca gat gat ccc 242Leu His Val Gly Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Asp Pro
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80 85 90cgg ctc tgc ctg gct aat ttt tgt ggt aga aac agg gtt tca ctg atg 338Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met
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110 115 120cca aag tgc tgg gat tac agg cgt gca gcc gtg cct ggc ctt ttt att 434Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile125 130 135 140tta ttt ttt tta aga cae agg tgt ccc act ctt acc cag gat gaa gtg 482Leu Phe Phe Leu Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val
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240 245 250
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Phe Val Phe Leu Val Glu Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile
255 260 265
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Leu Ile Ser Gly Pro Cys Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala
270 275 280
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Gly Ile Thr Gly Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys
285 290 295 300
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Leu Phe Glu Met Glu Ser His Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp
305 310 315
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Pro Asn Leu Gly Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe
320 325 330
tcc tgt ctc agc ctc cca agc agc tgg gat tac ggg cac ctg cca cca 1058
Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro
335 340 345
cac ccc gct aat ttt tgt att ttc att aga ggc ggg gtt tca cca tat 1106
His Pro Ala Asn Phe Cys Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr
350 355 360
ttg tca ggc tgg tct caa act cct gac ctc agg tgacccacct gcctcagcct 1159
Leu Ser Gly Trp Ser Gln Thr Pro Asp Leu Arg
365 370 375
tccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc acctcaccca gccggctaat ttagataaaa 1219
aaatatgtag caatgggggg tcttgctatg ttgcccaggc tggtctcaaa cttctggctt 1279
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tctttatttt agtatactag aaagtaatac aataaacatg tcaaacctgc aaattcagta 1399
gtaacagagt tcttttataa cttttaaaca aagctttaga gca 1442
<210>2
<211>375
<212>PRT
<213>未知生物体
<220>
<223>未知生物体的描述NTP氨基酸序列
<400>2
Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys Asn Gly Ala Ile
1 5 10 15
Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys Thr His Ala Arg
35 40 45
Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe Leu His Val Gly
50 55 60
Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu
85 90 95
Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met Cys Pro Ser Trp
100 105 110
Ser Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp
115 120 125
Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile Leu Phe Phe Leu
130 135 140
Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val Gln Trp Cys Asp
145 150 155 160
His Ser Ser Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Ile Lys His Pro Pro Ala
165 170 175
Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met His His Tyr Thr Trp
180 185 190
Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe Leu Arg Gln Ser Leu Asn Ser
195 200 205
Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Arg Asn Leu Gly Ser Leu Gln Pro
210 215 220
Leu Pro Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser
225 230 235 240
Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe Phe Val Phe Leu
245 250 255
Val Glu Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile Leu Ile Ser Gly
260 265 270
Pro Cys Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly
275 280 285
Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys Leu Phe Glu Met
290 295 300
Glu Ser His Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Pro Asn Leu Gly
305 310 315 320
Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser
325 330 335
Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro His Pro Ala Asn
340 345 350
Phe Cys Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr Leu Ser Gly Trp
355 360 365
Ser Gln Thr Pro Asp Leu Arg
370 375
<210>3
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>3
His Ala Arg Leu Met Leu
1 5
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-1肽
<400>4
Leu His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val
1 5 10 15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-2肽
<400>5
Leu Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Asn Asn Asn Val
1 5 10 15
<210>6
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-3肽
<400>6
Cys Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Met
1 5 10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-4肽
<400>7
His His Ala Arg Leu Pro Leu Ala Asn Phe Cys Gly
1 5 10
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-5肽
<400>8
Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys
1 5 10
<210>9
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-6肽
<400>9
Cys Glu Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys
1 5 10 15
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-7肽
<400>10
Asp Asn Thr His His Ala Arg Leu Ile Leu
1 5 10
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-8肽
<400>11
Ser His His Ala Arg Leu Ile Leu
1 5
<210>12
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>12
Ala Arg Cys Leu
权利要求
1.一种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和它们的同系物。
2.一种组合物，所述组合物包含一种或多种权利要求1的肽及其载体。
3.一种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物。
4.一种组合物，所述组合物包含一种或多种权利要求3的肽及其载体。
5.一种肽，所述肽具有氨基酸序列ARLI，并且包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
6.一种肽，所述肽具有氨基酸序列HARL，并且包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
7.一种肽，所述肽具有氨基酸序列FARL，并且包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
8.一种肽，所述肽具有氨基酸序列ARL，并且包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
9.一种肽，所述肽具有氨基酸序列ARLC，并且包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
10.一种Harlil肽序列的聚合物，所述聚合物包含所述肽的至少两个重复。
11.一种编码选自以下的一种氨基酸序列的核酸
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物。
12.一种组合物，所述组合物包含一种或多种权利要求11的核酸及其药学上可接受的载体。
13.一种编码选自以下的一种氨基酸序列的核酸
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物。
14.一种组合物，所述组合物包含一种或多种权利要求13的核酸及其载体。
15.一种核酸，所述核酸编码氨基酸序列ARLI，并且包含编码邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸的残基。
16.一种核酸，所述核酸编码氨基酸序列HARL，并且包含编码邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸的残基。
17.一种核酸，所述核酸编码氨基酸序列FARL，并且包含编码邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸的残基。
18.一种核酸，所述核酸编码氨基酸序列ARL，并且包含编码邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸的残基。
19.一种核酸，所述核酸编码氨基酸序列ARLC，并且包含编码邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸的残基。
20.一种抗体，所述抗体特异性地识别具有选自以下的一种氨基酸序列的肽序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和它们的同系物。
21.一种抗体，所述抗体特异性地识别具有选自以下的一种氨基酸序列的肽序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物。
22.一种抗体，所述抗体特异性地识别具有选自以下的一种氨基酸序列的肽序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL；和
(e)ARLC，
其中所述肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
23.一种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽的模拟物
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物。
24.一种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽的模拟物
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物。
25.一种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽的模拟物
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL；和
(e)ARLC；
其中所述NTP肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
26.一种从生物样品中纯化NTP的方法，所述方法包括
(1)使生物样品与一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽接触
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物；
(2)分离所得的Harlil肽/NTP缀合物；且
(3)从所述一种或多种Harlil肽中分离NTP，以获得纯化NTP。
27.一种从生物样品中纯化NTP的方法，所述方法包括
(1)使生物样品与一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽接触
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARL1L；和它们的同系物；
(2)分离所得的Harlil肽/NTP缀合物；且
(3)从所述一种或多种Harlil肽中分离NTP，以获得纯化NTP。
28.一种从生物样品中纯化NTP的方法，所述方法包括
(a)使生物样品与一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽接触
(i)ARLI；
(ii)HARL；
(iii)FARL；
(iv)ARL；和
(v)ARLC；
其中所述肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸；
(b)分离所得的Harlil肽/NTP缀合物；且
(c)从所述一种或多种Harlil肽中分离NTP，以获得纯化NTP。
29.一种用于确定早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的诊断试验，所述诊断试验包括
(1)使生物样品与一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽接触
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物；
(2)测定所述样品中存在的NTP量；且
(3)确定所述样品中存在的NTP量是否高于指示早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的阈值量。
30.一种用于确定早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的诊断试验，所述诊断试验包括
(1)使生物样品与一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽接触
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物；
(2)测定所述样品中存在的NTP量；且
(3)确定所述样品中存在的NTP量是否高于指示早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的阈值量。
31.一种用于确定早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的诊断试验，所述诊断试验包括
(a)使生物样品与一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽接触
(i)ARLI；
(ii)HARL；
(iii)FARL；
(iv)ARL；和
(v)ARLC；
其中所述肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸，
(b)测定所述样品中存在的NTP量；且
(c)确定所述样品中存在的NTP量是否高于指示早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的阈值量。
32.一种用于测定早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含
(1)一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽；
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物；和
(2)合适的试剂。
33.一种用于测定早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含
(1)一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物；和
(2)合适的试剂。
34.一种用于测定早老性痴呆或其它神经变性性疾病存在的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含
(a)一种或多种具有选自以下的一种氨基酸序列的肽
(i)ARLI；
(ii)HARL；
(iii)FARL；
(iv)HARLI；
(v)ARLC；
其中所述肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸；和
(b)合适的试剂。
35.一种在治疗或诊断分析中使用一种肽作为NTP类似物的方法，所述方法包括在这种测定中用所述肽替代NTP，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物。
36.一种在治疗或诊断分析中使用一种肽作为NTP类似物的方法，所述方法包括在这种测定中用所述肽替代NTP，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物。
37.一种在治疗或诊断分析中使用一种肽作为NTP类似物的方法，所述方法包括在这种测定中用所述肽替代NTP，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL ；
(d)ARL，和
(e)ARLC；
其中所述肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
38.一种在诊断或治疗分析中使用一种肽作为捕获材料的方法，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物。
39.一种在诊断或治疗分析中使用一种肽作为捕获材料的方法，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物。
40.一种在诊断或治疗分析中使用一种肽作为捕获材料的方法，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL，和
(e)ARLC；
其中所述肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
41.一种使用肽从样品中分离免疫球蛋白的方法，所述方法包括
(1)使包含免疫球蛋白的样品与至少两种肽接触，使得免疫球蛋白/肽可以相互作用，且
(2)分离所得的肽/免疫球蛋白缀合物，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和这些氨基酸序列的同系物。
42.权利要求41的方法，其中所述NTP肽/免疫球蛋白缀合物通过沉淀分离出来。
43.权利要求41的方法，其中所述NTP肽/免疫球蛋白缀合物在亲和柱上分离出来。
44.权利要求41的方法，其中随后纯化所述免疫球蛋白。
45.一种使用肽从样品中分离免疫球蛋白的方法，所述方法包括
(1)使包含免疫球蛋白的样品与至少两种肽接触，使得免疫球蛋白/肽可以相互作用，且
(2)分离所得的肽/免疫球蛋白缀合物，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它们的同系物。
46.权利要求45的方法，其中所述肽/免疫球蛋白缀合物通过沉淀分离出来。
47.权利要求45的方法，其中所述肽/免疫球蛋白缀合物在亲和柱上分离出来。
48.权利要求45的方法，其中随后纯化所述免疫球蛋白。
49.一种使用肽从样品中分离免疫球蛋白的方法，所述方法包括
(1)使包含免疫球蛋白的样品与至少两种肽接触，使得免疫球蛋白/肽可以相互作用，且
(2)分离所得的肽/免疫球蛋白缀合物，其中所述肽具有选自以下的一种氨基酸序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL；和
(e)ARLC；
其中所述肽包含邻接所述肽3’端或5’端的至少一个且至多25个额外的氨基酸。
50.权利要求49的方法，其中所述肽/免疫球蛋白缀合物通过沉淀分离出来。
51.权利要求49的方法，其中所述肽/免疫球蛋白缀合物在亲和柱上分离出来。
52.权利要求49的方法，其中随后纯化所述免疫球蛋白。
53.一种用于防止NTP通过所述Harlil结构域相互作用的方法，所述方法包括通过使用一种或多种Harlil肽、Harlil肽模拟物、抗这种结构域的抗体或它们的组合封闭一个或多个Harlil结构域。
全文摘要
本发明涉及神经丝蛋白(NTP)的优选重复序列，所述优选序列的肽、模拟物、抗体和核酸，以及使用这些优选NTP序列的诊断和治疗方法。
文档编号C07K16/00GK1492926SQ0182121
公开日2004年4月28日 申请日期2001年10月25日 优先权日2000年10月27日
发明者J·费茨帕特里克, P·阿弗巴克, M·S·S·福克特, R·比比尔诺, J 费茨帕特里克, S 福克特, ぐ涂 , 榷 申请人:尼莫克斯药品公司