专利名称：含有自由羟基(oh)或伯胺或仲胺官能团的化合物的磺化方法
技术领域：
本发明涉及一种在非降解的条件下可重现地制备磺化化合物的方法，所述方法适用于制备对分子构成有严格要求的化合物，例如在治疗药剂中。
本发明的方法可用于所有包含自由羟基(OH)或任选取代的伯胺或仲胺的单体、低聚和聚合化合物。本发明更具体地涉及一种用于对聚合物进行官能化的O和N磺化方法。
在现有技术中报道的磺化化合物的制备方法中，通常在O或N磺化期间会引起聚合物链的断裂，并由此形成潜在的有毒反应残基。本发明的方法的目的是通过在特定条件下控制磺酸根基团的加入来精确地避免这种缺点，从而不会改变最初聚合物(例如低聚糖)的结构完整性。
具有抗凝性能的官能化聚合物在现有技术中是已知，并且它们是通过在葡聚糖(D)链上取代有羧甲基(CM)、甲基-苄基酰胺(B)和磺化甲基-苄基酰胺(S)基团获得的一系列衍生物，缩写为CMDBS。这些聚合物的制备方法具体描述在法国专利公布2 461 724以及美国专利公布4,740,594中。这两个专利都未提供最终聚合物结构的精确分析，并且这两种方法都不能提供证据证明最终产物是均一的。这两个专利中所述的磺化反应的实验条件促使砜与糖苷残基的自由OH基结合，并且所给的分析不能清楚地证实磺化苄胺基团的存在。
CMDBS家族的其它成员(“肝素结合生长因子”，HBGF)，在美国专利公布5,693,625中被描述为结瘢剂。在其它的文献中还描述了HBFGPP的激发肌肉组织(法国专利2 718 024)、神经组织(法国专利2718 026)和消化道组织(法国专利2 718 023)中的损害的修复和再生的性能及其消炎性能(法国专利2 718 025)。这些专利建立了一系列筛选可生物相容的聚合物的功能标准，其中包括如下四种功能特性-保护肝素结合生长因子(HBGF)(如成纤维细胞生长因子，如FGF1&2)或者转化因子(如抗蛋白水解降解的TGF-β)，以及在细胞培养时在一系列试验中强化其生物活性。
-呈现低于10国际单位/mg的抗凝活性。
-在生理条件下抑制白细胞弹性蛋白酶的活性。
-在生理条件下抑制纤维蛋白溶酶的活性。
法国专利申请98 09309报道了一类呈现HBGFPP性能的聚合物(命名为“再生剂”，RGTA)的结构，并且描述了其制备方法和性能。这些RGTA呈现抗纤维变性效果，特别是能够改善皮肤伤痕愈合的质量；呈现抗氧化剂效果，特别是用于治疗自由基的有害影响(电离辐射之后或者在局部缺血引起的氧化应激期间)；以及呈现调节组织内环境稳定性特别是骨质内环境稳定性的性能。这些性能是对前述HBGFPP特性的补充。
法国专利98 09309中所述的聚合物如下式所示AaXxYy(I)其中A是单体；X代表RCOOR′基团；Y代表A上结合的O-或N-磺化基团并且并且对应于下式之一ROSO3R′或RNSO3R′；这些R基团是任选支化和/或不饱和并且可以含有一个或多个芳环的脂族烃链，所述芳环不包括不包括苄胺和磺化苄胺基团；R′代表氢原子或阳离子；a代表单体的数量；x代表A单体被X基团取代的水平或程度；y代表A单体被Y基团取代的水平或程度。
在法国专利98 09309中所述的聚合物中，我们可以引证葡聚糖衍生物如CMDS。CMDS型的聚合物也被描述为抗凝剂(Maiga等人，Carbohydrate Polymers，1997，32，89-93)。
在现有技术的所有这些实例中，所述的这些合成方法都不符合再现性标准，难以确保获得保持分子完整性和没有污染物的产物。事实上，尽管在现有技术中描述了很多羧基取代的方法，并且采用这些方法可以控制取代以确保足够的再现性，但是磺化方法的控制较为困难。
所述磺化方法是在非常低的pH值下进行的，它不能保持聚合物链的完整性，特别是当该链由天然糖构成时。而且，这些磺化条件导致脱羧作用，这是非常难控制的。
因此，现有技术中的许多研究描述了对Aa型多糖进行硫酸化的方法。因此，例如，葡聚糖硫酸酯(或O-磺酸酯)(DS)、羧甲基葡聚糖硫酸酯(CM-D-S)(或O-磺酸酯)和其它硫酸化(或O-磺化)低聚糖(如木聚糖或淀粉)是通过美国专利4,814,437中所述类型的方法硫酸化(或O-磺化)的。在这些方法中，许多专家提出了使用强酸作为磺化剂磺化多糖方法。例如，美国专利4,740,594和4,755,379、和法国专利2 772 382描述了用二氯甲烷(CH2Cl2)作为溶剂用氯磺酸处理来制备CM-D-S和DM-D-B-S型的分子。在较早的研究中对这种方法已经做了广泛的描述，这是由于氯磺酸被用于用吡啶作为碱性溶剂的DS合成方法(Ricketts，Biochem J，51，210-133，1952)。在有甲酰胺的情况下硫酸和磺酸也用于在低温下制备DS，如美国专利3,498,972和3,141,014所述。已知这些强酸反应条件会使得产物部分降解，即使在有碱性溶剂的情况下或者低温下。在为聚合物产物的情况下它们导致大分子链的明显断裂，并且使得待磺化的分子中所含的某些官能团部分水解。就这些强酸性条件而言已提出了许多改进，其中包括使用更好的缓冲介质或低酸性介质。因此，与使用已经提出的硫酸和磺酸相比，使用三氧化硫(SO3)络合物作为磺化剂降低了磺化反应的苛刻度(Archives of Biochemistry and Biophysics，95，36-41，1961；Tetrahedron Letters，29，7，803-806，1988；J.Chem.Soc.Perkin trans.1,157,1995)。SO3胺型的许多络合物已能商购获得，例如SO3-ME3N(三甲胺)、SO3-Et3N(三乙胺)、SO3-吡啶和SO3-哌啶。这些试剂用于例如DMF、甲酰胺和DMSO等溶剂的无水介质中。尽管这些方法已用于制备硫酸化多糖，特别是用于硫酸化带有酯、醚或酰胺官能团的葡聚糖衍生物，但是它们由于引起如下问题而存在严重缺陷-这些聚合物的大分子链随机断裂，尽管比磺酸磺化的断裂比例低；-上述聚合物上已有的官能团部分水解；和-通过形成胺产生污染制品的副产物，活体接种实验显示这些副产物有毒(Brain Res，16，208-2，473-478，1981)。
为了尽可能去除这些毒性剩余物，已对这些技术进行了更进一步的改进，并且针对吡啶提出了美国专利4,814,437中所述的方法。事实上，该方法中所用的SO3-胺与大多数多糖的还原端的醛基反应，尤其在葡聚糖中，并且由此形成的键是共价的，因此非常牢固。
通过使用例如SO3-DMF和SO3-FA的SO3-胺型络合物克服了使用SO3-胺络合物的缺陷。例如，通过使用甲酰胺作为溶剂，使用SO3与甲酰胺的络合物(SO3-FA)对葡聚糖进行O-磺化制得DS盐，更具体地说是钠盐，如美国专利4,855,416中所述用。该方法包括原位形成SO3-FA络合物，然后将其与葡聚糖反应。SO3-FA络合物的强反应性导致反应介质的强酸性，尽管使用惰性环境(N2)和无水溶剂。这也导致了大分子链的降解。
另一种广泛使用的非活化络合物是SO3-DMF。事实上在法国专利2 772 382中提出了CM-D-S和CM-D-B-S型的硫酸化多糖的合成。然而，SO3-DMF络合物，与SO3-FA络合物类似，使得反应介质为强酸性，这样也导致了大分子链的断裂和不稳定的水解基团水解，导致对合成和最终产物失去控制。因此在制备高分子量多阴离子聚合物(不希望以随机、非控制的方式断裂)的情况下，这种方法没有其它方法好。
因此希望改进法国专利97 15702中所述的制备CMDBS和CMDS的合成方法。根据法国专利97 15702，这种改进一方面能够制得分子量更均一的葡聚糖衍生物，另一方面能够控制取代比例，由此确保这些结构更均一和更加确定。然而，同现有技术类似，法国专利97 15702中所述的方法是基于使用SO3-胺(DMF、吡啶或三乙胺)来磺化多糖，并且在所给的实例中仅使用了SO3-吡啶。而且这种方法导致形成剩余痕量的对人有毒的吡啶，并且难以看出其能避免形成多糖链片段。
更具体地，本发明的目的是提供新的通用磺化方法，使用该方法能够高度精确地控制含有羟基官能团或者伯胺或仲胺官能团的化合物上的磺化基团取代条件。
该目的是通过一种对含有一个或多个自由羟基官能团和/或一个或多个取代或未取代的伯胺或仲胺官能团的化合物的磺化方法来实现的，其特征在于它包括在有捕酸剂的情况下用SO3-DMF络合物来处理所述化合物。
术语“捕酸剂”是指能够选择性地与溶液中的自由质子反应的物质或这些物质的混合物。向反应介质中加入这种捕酸剂之后，质子被这些捕酸剂捕获并且不再参与pH值的降低，因为它们不再具有反应性。
所述捕酸剂例如选自沸点低于100℃的链烯烃或链炔烃或这二者的混合物。
所述捕酸剂有益地是丁烯如2-甲基-2-丁烯(2M2B)、2-甲基-丙烯、2-甲基-戊烯、或其异构体或它们的混合物。
本发明的方法的特别之处在于其能够避免使用过低的pH值，并因此避免了处理过的化合物的断裂。而且本发明还具有不加入难以除去或者难以完全除去的有毒物质的益处。
更具体地，本发明的方法包括以下步骤a)在无水溶剂或共溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)或由甲酰胺和二甲基甲酰胺组成的共溶剂中将待磺化的化合物溶解或者制成一均匀溶液；b)室温(20-22℃)下加入摩尔过量的可混溶于共溶剂中的捕酸剂，例如2-甲基-2-丁烯；c)在搅拌下快速加入SO3-DMF络合物；d)在低于30℃的控制温度下将前面步骤中获得的混合物搅拌1-2小时；e)将所述混合物逐步加入到一碱性溶液，例如2％的碳酸氢钠(NaHCO3)或另一碱的溶液中使反应停止，同时监控pH值，使其从不低于4，以便获得磺化化合物的盐。
本发明的方法有益地包括将步骤(e)中所得的磺化化合物纯化，例如通过相对水经超滤膜以1000道尔顿的截止阈值切向超滤(所述水满足人体注射用水的质量要求)。
步骤(a)中所用的溶剂优选不是二甲亚砜(DMSO)，这是由于在本发明的框架内进行的研究证实非常难从所述磺化多糖制品中除去该溶剂，因此对其在药品中的使用构成障碍。
当待磺化的化合物不易溶于无水溶剂或共溶剂中时，本方法的一个特定实施方式包括将所述化合物质子化以便促进其溶解。本文中我们例如通过将待磺化的化合物通过阳离子交换柱来处理该化合物，所述化合物是取代有一个或多个羧酸根合基团的糖聚合物，例如葡聚糖，其质子化导致形成-COOH基团。
因此磺化条件得到很好的控制，避免了最初取代有羧基的聚合物的脱羧。因此，优选如下的磺化条件将待磺化的化合物溶解于无水溶剂中(参见实施例II.1)。加入摩尔过量的捕酸剂(例如链烯烃2M2B)。加入磺化剂(SO3)如络合物SO3-DMF，并且该反应在低于捕酸剂的蒸发温度的温度下进行。通过加入碱性溶液如NaHCO3使反应停止。
本发明的方法可用于单体、低聚物和聚合物。更具体地，它适合诸如前述的HBGFPP或RGTA等的聚合物，尤其是得自葡聚糖的化合物和苹果酸的共聚物。因此本发明特别适用于下式的聚合物AaXxYy(I)其中其中A是单体；X代表RCOOR′基团；Y代表相连于A上的O-或N-磺化基团并且对应于下式之一ROSO3R′或RNSO3R′；这些R基团是任选支化和/或不饱和并且可以含有一个或多个芳环的脂族烃链，所述芳环不包括苄胺和磺化苄胺基团；R′代表氢原子或阳离子；a代表单体的数量；x代表A单体被X基团取代的水平或程度；y代表A单体被Y基团取代的水平或程度。
本发明的方法可用于制备聚合物，尤其是式(I)所示的聚合物，其中在单体单元之间或者单体单元与其取代基之间(例如式(I)的聚合物中的A-A或A-X键)存在由在酸性介质中不稳定的官能团(尤其是酯、酰胺、醚、缩醛(糖苷)官能团或其它基团)形成的键。
本发明的方法因此尤其适用于制备硫酸化糖单体或低聚物，例如某些肝素片段，或者适用于制备RGTA类的聚合物，尤其是当A是糖苷单体时，例如在为葡聚糖-基聚合物或所有其它多糖化合物的情况下。
下面针对实施本发明方法，通过实施例并参照附图，对本发明的其它优点和特征作更详细的解释，其中
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图1显示了具有末端醛基的CMDS分子。就值x和y不是0的CMDS而言，有三种Z单元a)醛或半缩醛，b)羧甲基糖苷和c)磺酸酯基糖苷。
-图2代表取代的葡聚糖的末端单元的醛官能团和半缩醛之间的转化平衡。端基异构位置的取代单元不参与该平衡。
-图3代表具有表3中所述结构特征的CMDS型分子的色谱图。
-图4显示了相同产物PA 07在不同凝胶过滤柱上获得的色谱图。
-图5显示了CMDS的结构。
这些实施例还包括将本发明的方法与现有技术的方法进行比较，尤其是对于得自葡聚糖的聚合物(如CMDS或CMDBS)的磺化。通过比较发现法国专利FR 97 15702和FR 99 07636中提出的方案不能很好地保持葡聚糖聚合物分子的完整性，因为它们产生可以通过简单方法检测和定量的片段，并且会使接枝在大分子链上的基团发生水解。
I-磺化的评价I.1-羧基和磺化基团的测定方法为了能够对不同的磺化方法进行比较，我们测定了单位葡萄糖中羧基(x)和磺化基团(y)的取代度(ds)。葡聚糖是葡萄糖聚合物，它在每个葡萄单元上有3个反应性OH基团。因此理论最大值是3。通过滴定分析法和根据现有技术中描述的常规方法的元素分析进行定量测定。
滴定分析测定结合元素分析能够确定羧甲基醚(x)和磺酸根合(y)基团的总取代比例(x和y)。
I.2-取代基团的位置的测定为了确定接枝于糖苷单元上的基团的位置，我们在本领域专家已知的标准条件下使用NMR(质子核磁共振)分析法(J.Biol.Chem.275，38，29383-29390，2000)。我们使用Bruker 200-MHz核磁共振仪。
I.3-聚-糖苷链的片段的测定方法为了确定磺化基团加成反应之前和之后的聚合物链的完整性，测定溶液中的产物中的醛。
如图1所示，由于仅在聚合物的还原末端具有醛基，因此通过测定醛能够确定产物的还原末端。由此测得待磺化的产物上的醛基的数量。在此该数值等于每克产物1微摩尔醛。如果在反应期间不发生断裂的话，该值在所有情况下都保持低于或等于最初产物的值。
事实上，磺化反应之后测定的醛值低于加入磺化基团之前测定的值(对0.5mmol/g的CMDS而言为1.0μmol/g)。对x＝0.5且y＝1.25的CMDS产物通常发现的自由醛值接近0.4微摩尔醛/克产物。相反，如果该数值超过最初值(1.0)，那么必定形成了断裂。
由于每一链断裂产生一个新的可测定的反应醛，因此这种方法能够测定片段的形成。
I.4-分子量的测定方法和制品表观均匀性的研究方法分子量的测定是通过高效空间排阻色谱法于0.1M NaNO3中在KB-804和KB-805过滤凝胶(Shodex Japon)串联柱上以0.7ml/min进行的。在柱出口使用Dawn光散射微型检测器和RID 10型折射计测定产物(J.Biol.Chem.275，38，29383-29390，2000)。制品的均匀性是由分子量的分布曲线和峰宽度的量度(在半高)以及通过测定曲线的对称性来反映的。
二级HPLC-凝胶过滤工艺可以根据分子量分布得出分子均一性。图3中显示了所得的高斯分布。
色谱条件是柱TSKgelG4000PWX(TOSOHAAS)，30℃下，7.8mm ID×30cm；流动相NaCl0.3M；流速0.7ml/min；测定IR0.06。
对于采用所述工艺使用SO3-胺络合物合成的产物而言，发现制品的均匀性随所用的色谱系统而变化。
当通过Shodex柱分离产物时，峰不对称，但是当使用二级色谱分离系统时，相应于相同产物的峰显示是对称的，如图4所示。这说明这些制品以及现有技术的制品中分子量分散的均匀性与所用分离系统有关。
II-使用本发明方法的羧甲基葡聚糖的O-磺化的实例以及与现有技术的比较下面实施例中描述了通过使用诸如氯磺酸的试剂、或者使用SO3-胺络合物、使用SO3-DMF络合物、和在有捕酸剂2-甲基-2-丁烯的情况下使用SO3-DMF络合物(SO3-DMF/2M2B)(本发明方案)来进行不同的O-磺化反应。
为了进行对比，选用羧甲基葡聚糖作为最初聚合物。
II.1-在有捕酸剂的情况下与络合物SO3-DMF/2-甲基-2-丁烯的反应在500-ml烧瓶中，将5g酸式羧甲基葡聚糖(CMDH+)(24.27mmol)溶解在40ml的甲酰胺中，然后在搅拌下加入40ml的2-甲基-2-丁烯(25当量)。加入7.90g的SO3-DMF(5当量/单位葡聚糖)。在30℃、搅拌下将反应进行2小时。
通过将反应介质慢慢倒入200ml 2％的NaHCO3中使反应停止。其pH必需接近7。如果不是这种情况，加入苏打或HCl将该溶液中和。在任何情况下溶液的pH值必需不低于5，以避免产物降解。
在减压下通过旋转蒸发去除过量的水、DMF和2M2B之后，产物经过切向超滤来纯化，然后冷冻干燥。获得6g磺化产物白色粉末。
下表1显示了对CMDH+(x＝0.52)的O-磺化的再现性，其中每单位葡萄糖用5当量SO3-DMF和25当量2M2B。测定由相同CMD制得的产物的平均偏差(MD)百分比。
乙肝病毒核酸的log转换相对于基线的离散曲线见图3。每个剂量方案在第29天时的平均log转换值的配对比较结果见表9。配对比较的差异未经任何多重调整，显著差异水平为5％。
表9.第29天时乙肝病毒核酸值距基线的平均log转换值(置信区间95％)
注不包含0的置信区间(见括号内)表明两个处理在5％的水中所述的产物)MW＝67500+/-7500。
所得结果证实在有2M2B的情况下，所得磺化比例是反应的化学计量比的函数。而且，反应条件不影响前面接枝于CMD上的羧乙基醚基的水平。
II.2-通过质子的NMR分析确定分子使用包括滴定分析定量测定、元素分析、还原糖定量分析和HPLC/凝胶上过滤结合MALLS测定并补充1H NMR光谱的分析技术分析合成的产物。
1H NMR光谱法为我们提供了不同基团在最初葡聚糖的糖苷单元的C-2、C-3和C-4三个反应性羟基上的取代位置以及取代速率之比。下表3显示了在实例CM-D-S型葡聚糖中通过NMR分析得出的X和Y在A上的取代位置。
表3基团的位置和以ds计的取代度
d.s各基团在每个葡萄糖单元(A)上的取代度。X＝CM；CH2COONa；Y＝SO3Na。
OH表示没有与单体A反应的OH基数。
d.s.是由没有被取代的剩余羟基计算得到的(每个葡萄糖A单体中自由OH的最初值是3；(n＝3))。
C3+C4在位置C-3和C-4的总取代，以X、Y和自由OH基计算，为总d.s.与C-2位测定的d.s.之差。
III-与现有技术相比III.1-使用氯磺酸的O-磺化。与ClSO3H反应将5g羧甲基葡聚糖(24.27mmol，1当量/葡萄糖单元)加入到162ml二氯甲烷中。获得一不均匀混合物。将该混合物剧烈搅拌以获得产物在二氯甲烷中的均匀悬液。
将1.5mL氯磺酸(24.27mmol，1当量/葡萄糖单元)缓慢加入到该混合物中。将该反应介质持续搅拌2小时。反应期间形成棕色的产物聚集体。将该混合物过滤(在4号多孔玻璃漏斗上)并且回收的产物用100ml二氯甲烷洗涤2次，用100ml二氯甲烷/二噁烷(1∶1)混合物洗涤3次，并用100ml二噁烷洗涤最后一次。将所得产物溶解在200ml蒸馏水中并通过加入2M的苏打使溶液的pH上升至9.5，然后加入0.05mol/l的HCl使溶液的pH为7。
将溶液过滤，浓缩并经500ml甲醇沉淀。然后在烘箱中将最终沉淀物干燥，之后纯化。
按照本方案进行3个独立的操作一个是在室温下用1当量的氯磺酸。
一个是在室温下用2当量的氯磺酸。
一个是在4℃下用2当量的氯磺酸。
III.2-与SO3-胺和酰胺络合物的反应使用以SO3为基础的不同络合物SO3-吡啶、SO3-三甲胺、SO3-三乙胺和SO3-DMF(二甲基甲酰胺)实施上面概括的方案。
下表4显示了通过使用SO3的不同络合物进行CMD的O-磺化(d.s.C＝0.56)获得的产物的结构和生理特性。
在500ml烧瓶中，将5g的羧甲基葡聚糖(24.27mmol，1当量/葡萄糖单元)溶解在50ml的甲酰胺中。为了加速该羧甲基葡聚糖的溶解，将反应介质的温度升高至50℃。一旦产物溶解之后，使溶液回到室温。为了进行每一反应，在50ml的甲酰胺中单独地制备下表4所示的含有每一络合物的溶液，并在搅拌下加入羧甲基葡聚糖。反应在室温下进行2小时。
加入2升4℃下的蒸馏水使反应停止。进行混合并通过加入2M的NaOH溶液使介质的pH升至7.5-8。
在减压下旋转蒸发除去过量水之后，通过切向超滤将产物纯化，然后冷冻干燥。获得6g白色粉末形式的硫酸化产物。
按照该方案进行4个独立的操作一个是室温下用2当量的SO3-吡啶络合物；一个是在室温下用2当量的SO3-三甲胺络合物；一个是在室温下用2当量的SO3-三乙胺络合物；一个是在室温下用2当量的SO3-DMF络合物。
另外，严格按照法国专利FR 97 15702的实施例5中所述的方法进行反应(表4第8行)，其中通过形成三甲基铵盐来溶解CMD。将SO3-吡啶络合物以0.4倍的自由OH基的量(相当于2当量的络合物/葡萄糖单元)溶解在DMSO中并加入到聚合物溶液中。该反应在二甲基甲酰胺中于室温下进行。
表4显示了按照不同方法合成不同的CMDS型聚合物的结构特征。本发明的方法相应于表4的第10和11项，并且所用条件描述于表4
n.d.＝未检出*本试验的最初产物是在CM中以1残基/葡萄糖单元的量取代的。
DCS型的不同产物是由单批次的羧基化葡聚糖(表4，第1项)以x＝0.56的羧酸根合的取代度进行合成的。在纯化之后，产物通过不同结构分析技术表征。
滴定分析结果显示，使用氯磺酸和SO3-酰胺或胺络合物的O-磺化反应导致接枝羧基的醚键断开(dsC或x)和大分子链的降解(分子量和还原糖的定量测定)。该断开随着加入试剂的当量数的增加而更加显著。降低反应介质的温度可以抑制该降解。
应注意的是，使用络合物SO3-Et3N(表4，第6项)制得的产物是磺化最充分的产物，而且也是脱羧作用最严重的产物。这种趋势由其它产物得到证实。
该表的最后两项(第10和11项)使用起捕酸剂作用的2M2B以限制接枝的羧酸根合基团的醚键和大分子链的降解和主链的降解。
应注意的是，在有2M2B的情况下，磺化之后获得的产物的dsC与前体的dsC相同。这与试剂的加入量无关。事实上，用2.5倍以上的络合物SO3-DMF(第11项)，我们获得更高dsS，但是毕竟dsC没有改变。由此证实了使用2M2B的方案的效果。
然而就目前已知的O-磺化技术而言，存在脱羧作用和大分子链的降解，在有2M2B的情况下的O-磺化技术使其能够解决接枝在葡聚糖上的羧酸根合基团损失的问题。
体内活性以及体内毒性的测定是在成年大鼠的后爪趾长伸肌的肌肉再生模型上进行的，在破碎之后按照Gautron J.、Kedzia C.、Husmann I.和Barritault D的“葡聚糖衍生物对成年大鼠骨骼肌再生的促进作用”，C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de la Vie(1995)，318671-676中所述的试验条件来进行。该再生是通过在组织学部分通过测定再生肌肉纤维的量来定量的。通过纤维形成的减少(与注入生理血清的对照相比)以及通过分析再生的外观并揭示再生的异常区或者形成异常区或者形成炎症区显示肌肉组织退化来测定其毒性。
IV-本发明方法在其它类型的聚合物合成中的推广应用表5显示了使用本发明的方法对式AaXxYy所示的各种聚合物的合成以及所述聚合物的分析特性，其中A是糖，并且a大于1。
表权利要求
1.具有一个或多个自由羟基官能团和/或一个或多个取代或未取代的伯胺或仲胺官能团的化合物的磺化方法，其特征在于该方法包括在有捕酸剂的情况下用络合物SO3-DMF来处理所述化合物。
2.如权利要求1的方法，其特征在于所述捕酸剂选自沸点低于100℃的链烯烃、链炔烃以及它们的混合物。
3.如权利要求1或2的方法，其特征在于所述捕酸剂选自2-甲基-2-丁烯(2M2B)、2-甲基-丙烯、2-甲基-戊烯、以及它们的异构体和它们的混合物。
4.如权利要求1-3任一项的方法，其特征在于它包括以下步骤a)在无水溶剂或共溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)或由甲酰胺和二甲基甲酰胺组成的共溶剂中将待磺化的化合物溶解或者制成一均匀溶液；b)室温(20-22℃)下加入摩尔过量的可混溶于所述共溶剂中的捕酸剂，例如2-甲基-2-丁烯；c)在搅拌下快速加入SO3-DMF络合物；d)在低于30℃的控制温度下将前面步骤中获得的混合物搅拌1-2小时；e)将所述混合物逐步加入到一碱性溶液，例如2％的碳酸氢钠(NaHCO3)或另一碱的溶液中使反应停止，同时监控pH值，使其从不低于4，以便获得磺化化合物的盐。
5.如权利要求4的方法，其特征在于它包括将步骤(e)中所得的磺化化合物纯化。
6.如权利要求4或5的方法，其特征在于它包括在步骤(a)之前将所述化合物质子化以便促进其在步骤(a)中的溶解。
7.如前面权利要求中任一项的方法，其特征在于所述待磺化的化合物选自单体、低聚物和聚合物。
8.如权利要求7的方法，其特征在于所述待磺化的化合物是下式的聚合物AaXxYy (I)其中A是单体；X代表RCOOR′基团；Y代表相连于A上的O-或N-磺化基团并且对应于下式之一ROSO3R′或RNSO3R′；这些R基团是任选支化和/或不饱和并且可以含有一个或多个芳环的脂族烃链，所述芳环不包括苄胺和磺化苄胺基团；R′代表氢原子或阳离子；a代表单体的数量；x代表A单体被X基团取代的水平或程度；y代表A单体被Y基团取代的水平或程度。
9.如权利要求7或8的方法，其特征在于所述聚合物是葡聚糖的衍生物或者苹果酸的共聚物。
10.如权利要求7-9任一的方法，其特征在于所述聚合物的单体单元之间或者单体单元与其取代基之间存在由在酸性介质中不稳定的官能团形成的键，尤其是酯、酰胺、醚和缩醛官能团。
全文摘要
本发明涉及一种具有一个或多个自由羟基官能团和/或一个或多个取代或未取代的伯胺或仲胺官能团的化合物的磺化方法。本发明的特征在于它包括用SO
文档编号C07C303/00GK1617889SQ02827691
公开日2005年5月18日 申请日期2002年11月28日 优先权日2001年11月29日
发明者埃马纽埃尔·珀蒂, 达尔西·加西亚－帕皮, 韦罗妮克·巴尔比耶－沙斯费耶 申请人:器官组织再生修复替换－Otr3公司