专利名称：一种胸腺五肽液相合成法的制作方法
技术领域：
本发明涉及胸腺五肽的合成方法，特别是液相法合成，并可适用于大规模生产胸腺五肽的方法。
背景技术：
胸腺五肽为胸腺激素—胸腺生成素II的生物活性中心，是由胸腺生成素II第32-36位氨基酸残基构成，在体内和体外均具有全部胸腺生成素II的生理和药理活性。而且胸腺五肽现已是临床药物。
现阶段胸腺肽的生产技术可分为两类。其中一类是采用生物技术生产，如中国发明专利申请02117757.0所公开的，用新鲜的胸腺浆液加入pH2.0-4.0的缓冲溶液，以抑制酶活性，在10℃以下用超声波匀质机或超细技术对新鲜的胸腺组织进行处理，破碎细胞，再经冷冻离心和超滤，再对所得粗制品用纳滤技术制取胸腺肽生产技术；或者是采用克隆技术以及采用复合的克隆技术进行生产，如中国发明专利96105293.7所公开的技术。另一类技术是采用合成方法生产胸腺肽，如美国专利US005218089所公开的液相合成技术，或者在有关资料中披露的多肽固相合成工艺。现有技术中以生物技术制造胸腺五肽一方面技术较为复杂，技术也不成熟，而且受到原料等因素的制约，另一方面由于原料的原因还可能会造成制品的污染；现有的液相合成生产技术需使用一些较为昂贵的试剂，而且工艺控制也较为困难；现有技术中更多采用的是固相合成技术，但固相合成技术的生产规模较小，合成工艺过程中所用的溶剂耗费量较大，在合成工艺中需要多肽自动合成仪、高效液相色谱仪等大型的仪器设备，除此以外，固相合成时还存在产率偏低和反应产物纯化周期过长的不足。
发明内容
本发明提供一种新的液相合成胸腺五肽的技术，这一技术可以克服现有技术存在的不足，在合成工艺中可使用价格较为低廉的试剂，合成产率较高，而且在整个工艺中不需要大量昂贵的仪器。特别是本发明的合成技术可以作为一种大规模生产所采用的技术。
本发明是先将酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐与N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸反应，然后将产物上的N-叔丁氧羰基脱去，得到Val-Tyr(OBzl)。再用N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反应液，再在反应液中加入Val-Tyr(OBzl)进行反应，反应完成后将反应产物上的N-叔丁氧羰基脱去，得到Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)。再将N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸活化酯反应液，在该反应液中加入Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)进行反应。反应完成后将反应产物上的N-叔丁氧羰基脱去，得到Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)。再将Z-硝基精氨酸与Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)以及2-羟基苯并二氮唑溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下再加入二环己基碳二亚胺进行反应，所得反应清液经洗涤后在甲醇中重结晶，分离出结晶体Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)。最后将Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的保护基脱去得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
在本发明中是采用将相应产物溶于适量三氟乙酸中反应脱去其上的N-叔丁氧羰基，再依次用碱溶液中和盐溶液洗涤后用无水硫酸钠干燥，然后再对产物进行减压浓缩。
本发明中酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐与N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸和反应是将酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐与N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸溶于二氯甲烷中，再在冰浴下加入二环己基碳二亚胺进行反应。
在本发明中N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反应液是先将N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸溶于适量(以溶质完全溶解为度，以下相同)的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下加入二环己基碳二亚胺反应得到的。
本发明中N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸活化酯反应液是将N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶于适量的二氯甲烷N-N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二环己基碳二亚胺和2-羟基苯并二氮唑反应得到。
采用本发明的方法得到Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)后可用以下述的任一种方法脱去其上的保护基将Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于甲醇中，加入钯碳进行催化氢化，再加入乙醚，析出晶体后用高效液相色谱纯化，获得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH；或者，将Z-Arr(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)适量的1∶1∶1的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚混合液中，再通入等容量的无水氟化氢反应，然后再用乙醚进行洗涤，再加入适量的乙酸水溶液，再加入乙醚，析出晶体后用高效液相色谱纯化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
本发明与现有技术相比有如下优点1、生产成本相对较低，以固相合成胸腺五肽为例，其实际产率仅为理论产率的50％，而本发明的产率大于理论产率的80％；2、在整个的生产工艺中所用的试剂价格相对较低；3、在整个的生产过程中所主要采用的是玻璃设备，而不象现有技术中需依赖大型设备，因此其生产费用较低；4、生产工艺较为简单，反应过程易于控制，生产工艺的可重复性强；5、综合生产周期较短，进一步减小生产成本，提高生产效率；6、合成规模可大幅度提高，容易实现工业化的大规模生产。
具体实施例方式
以下提供本发明的一个实施例先将L-酪氨酸(L-Tyr-OH，100克)与对甲苯磺酸(TOS，100克)溶于苯(600ml)中，再加入苯甲醇(300ml)，回流反应3～5小时，进行冷却，再加入石油醚或乙醚(1000ml)，搅拌析晶，再在回流下溶于乙醇(300ml)中，冷却结晶，滤出固体物得纯化的酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐Tyr(OBzl)·TOS(244克)，再将其与N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸反应，然后将产物上的N-叔丁氧羰基脱去，得到Val-Tyr(OBzl)。
将N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸(Boc-Val-OH，117克)与酪氨酸苄酯Val-Tyr(OBzl)溶于二氯甲烷(700ml)中，在冰浴下加入二环己基碳二亚胺(112克)，反应过夜。抽滤得到浅黄色清液，再依次用弱酸溶液，如柠檬酸等，弱碱溶液及盐溶液洗涤后，再用无水硫酸钠进行干燥处理后，减压浓缩反应液，得到白色固体。将这些白色固体物滤出后再放入石油醚-乙酸乙酯体系(900ml∶200ml)中进行重结晶，得到Boc-Val-Tyr(OBzl)(242克)。
将上述所得产物Boc-Val-Tyr(OBzl)(206克)溶于适量的三氟乙酸中(210ml)，反应3～5小时，然后再用碱溶液中和，用盐溶液洗涤后，用无水硫酸钠进行干燥处理，再进行减压浓缩，得到产物Val-Tyr(OBzl)(155克)。
将N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸(Boc-Asp(OBzl)-OH，135克)溶于适量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，冰浴下加入二环己基碳二亚胺(80克)和2-羟基苯并二氮唑(70克)，反应过夜，制得N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反应液。
将Val-Tyr(OBzl)(155克)加入N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反应液中，反应过夜。抽滤反应液得清液，依次用弱酸溶液，弱碱溶液及盐溶液洗涤后，再用无水硫酸钠进行干燥处理，减压浓缩反应液，得到白色固体。将这些白色固体物滤出后再放入石油醚-乙酸乙酯体系(550ml∶180ml)中进行重结晶，得到Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(226克)。
将由上所得反应产物Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)溶于适量的三氟乙酸中(95ml)，反应3～5小时，然后再用碱溶液中和，用盐溶液洗涤后，用无水硫酸钠进行干燥处理，再进行减压浓缩，得到产物Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(103克)。
将N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，75克)溶于适量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，冰浴下加入二环己基碳二亚胺(37克)和2-羟基苯并二氮唑(30克)，反应过夜，制得N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸活化酯反应液。
将Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(103克)加入N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸活化酯反应液，反应过夜，抽滤反应液得清液，依次用弱酸溶液，弱碱溶液及盐溶液洗涤后，再用无水硫酸钠进行干燥处理，将滤液低温静置，直至析出白色固体，将固体分离出后再置入乙酸乙酯体系中进行重结晶，得到产物Boc-Lys(2-Cl-Z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(161克)。
将以上所得产物Boc-Lys(2-Cl-Z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(161克)溶于适量的三氟乙酸中(70ml)，反应约3小时，然后再用碱溶液中和，用盐溶液洗涤后，用无水硫酸钠进行干燥处理，再进行减压浓缩，得到产物Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(80克)。
将Z-硝基精氨酸(Z-Arg(NO2)，29克)与Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(60克)以及2-羟基苯并二氮唑(14克)溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，在冰浴下再加入二环己基碳二亚胺(18克)，反应过夜，抽滤反应液得清液，依次用弱酸溶液，弱碱溶液及盐溶液洗涤后，再用无水硫酸钠进行干燥处理，将滤液室温静置，直至析出白色固体，将固体分离出后再置入甲醇体系中进行重结晶，得到产物Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(75克)。
将由上所得产物Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的各保护基，即(NO2)、(2-Cl-z)和(OBzl)脱去，就可得到胸腺五肽Z-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。本发明中提供两种最为有效的脱去保护基的方法第一种方法将Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(120克)溶于适量的甲醇中，加入钯碳，进行催化氢化，再加入乙醚，析出白色晶体后滤出，再用高效液相色谱进行纯化后得到纯度大于99％的胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(65克)。
第二种方法将Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(120克)溶于适量的的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚(100ml∶100ml∶100ml)混合液中，再通入等容量的无水氟化氢(300ml)，反应30分钟。抽干氟化氢，再用乙醚分3次进行洗涤(每次用200ml乙醚)后，再在体系中加入20ml的乙酸水溶液(浓度为10％)，再加入乙醚(600ml)，析出晶体后滤出，再用高效液相色谱纯化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(67克)。
需说明的是在实际的生产过程中也可直接用商品化的酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐制品。
权利要求
1.一种胸腺五肽液相合成法，其特征是(a) 将酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐，与N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸反应，然后将产物上的N-叔丁氧羰基脱去，得到Val-Tyr(OBzl)(b) 由N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反应液，再在反应液中加入由a所得产物反应，反应完成后将反应产物上的N-叔丁氧羰基脱去，得到Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)，(c) 将N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸活化酯反应液，再在反应液中加入由b所得产物Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)进行反应，反应完成后将反应产物上的N-叔丁氧羰基脱去，得到Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)，(d) 将Z-硝基精氨酸与由c所得产物Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)以及2-羟基苯并二氮唑溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下再加入二环己基碳二亚胺进行反应，所得反应清液经洗涤后在甲醇中重结晶，分离出结晶体Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)，(e) 将由d所得结晶体Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的保护基脱去得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
2.根据权利要求1所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是脱去N-叔丁氧羰基的反应是采用将相应产物溶于适量三氟乙酸中进行反应，然后再依次用碱溶液中和盐溶液洗涤后用无水硫酸钠干燥，并对产物进行减压浓缩。
3.根据权利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐与N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸的反应是将酪氨酸苄酯对甲苯磺酸盐与N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸溶于二氯甲烷中，再在冰浴下加入二环己基碳二亚胺进行反应。
4.根据权利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反应液是将N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸溶于适量的二氯甲烷-N和N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二环己基碳二亚胺反应得到。
5.根据权利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸活化酯反应液是将N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶于适量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二环己基碳二亚胺和2-羟基苯并二氮唑反应得到。
6.根据权利要求1至5所述的任一胸腺五肽液相合成法，其特征是将Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于甲醇中，加入钯碳进行催化氢化，再加入乙醚，等析成晶体后用高效液相色谱纯化，获得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
7.根据权利要求1至5所述的任一胸腺五肽液相合成法，其特征是将Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于适量的1∶1∶1的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚混合液中，再通入等容量的无水氟化氢反应，然后再用乙醚进行洗涤，再加入适量的乙酸水溶液和乙醚，析出晶体后用高效液相色谱纯化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
全文摘要
本发明涉及胸腺五肽的合成方法。本发明是在酪氨酸苄酯上依次接上缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸，最后将产物Z－Arg(NO
文档编号C07K1/02GK1513872SQ0313435
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月10日 优先权日2003年6月10日
发明者王锐, 魏洁, 赵倩予, 杨顶建, 张立臣, 许兆青, 王 锐 申请人:兰州大学