Thr-Pro-Pro-Thr四肽的液相合成方法
【专利摘要】本发明涉及一种四肽的液相合成方法，具体的，本发明涉及四肽Thr-Pro-Pro-Thr的液相合成方法，该四肽C端苏氨酸的羧基具有酰胺结构，N端为自由氨基。
【专利说明】Thr-Pro-Pro-Thr四肽的液相合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种四肽的液相合成方法，该四肽具有Thr-Pro-Pro-Thr的氨基酸序 列，其C端苏氨酸的羧基具有酰胺结构。
【背景技术】
[0002] 抑郁症是最常见的神经精神类疾病，严重影响人的身心健康。在我国随着生活节 奏的加快，社会压力的增加，抑郁症发病率显著增高。
[0003] 药物治疗是抑郁症治疗的主要手段。主要治疗药物包括三环类抗抑郁药如丙咪 嗪，阿米替林等；选择性5-羟色胺重摄取抑制剂，如氟西汀，舍曲林等；5-羟色胺/去甲肾 上腺素重摄取双重抑制剂，如万拉法新，度洛西汀等。但是，常用药物起效慢，一般需要数周 到数月时间，且存在效率不高和毒副反应明显等缺点。
[0004] GLYX-13是一种新型抗抑郁药物，目前正在进行II期临床研究。它通过调节大脑 中的NMDA(N_甲基-D-天冬氨酸）受体而起作用，且没有像氯胺酮一样有严重的和限制级 的副作用，例如出现幻觉和精神分裂症类等。GLYX-13能够发挥强烈、快速、持续的抗抑郁作 用，起效时间小于24小时，并且可持续平均7天。作为肽类药物，GLYX-13耐受性好，使用 安全。
[0005] GLYX-13为一个四肽，具有Thr-Pro-Pro-Thr的序列结构，其N端为自由氨基，C端 为酰胺结构。GLYX-13的合成方法包括传统的固相肽合成及液相肽合成方法两种，由于其 序列短，固相合成氨基酸用量大，成本高，且不易实现大量制备。液相法氨基酸用量小，收率 高，可以大量制备。
【发明内容】
[0006] 本发明提供四肽Thr-Pro-Pro-Thr的液相合成方法，该方法由两个二肽片段缩合 而成，相比逐个延长肽链的方法可提高反应收率，使用水作为肽键缩合反应后处理溶剂，避 免大量使用有机溶剂，中间体不需柱层析纯化，具有低成本及环保的特点。
[0007] 本发明提供的四肽Thr-Pro-Pro-Thr的液相合成方法，包括以下步骤：
[0008] 1)苏氨酸羧基酰胺结构H-Pr〇-NH2的合成：氨基叔丁氧羰基〇oc)/侧链轻基叔 丁醚保护或氨基9-芴甲氧羰基（Fmoc)保护的苏氨酸在-15°C条件下，与氯甲酸异丁酯和 N-甲基吗啡啉作用，形成混合酸酐，再与氨水反应，生成羧基酰胺化的保护苏氨酸。然后用 盐酸/有机溶剂或三氟乙酸（TFA)脱除Boc保护基，或者用哌啶/N，N-二甲基甲酰胺（DMF) 溶液脱除Fmoc保护基。
[0009] 2)H-Pr〇-Thr-NH2二肽片段的合成：Boc或Fmoc保护的脯氨酸在-15°C条件下，与 氯甲酸异丁酯和N-甲基吗啡啉作用，形成混合酸酐，再与上步制备的羧基酰胺化的苏氨酸 缩合反应，生成保护的二肽。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸（TFA)脱除保护基，或者用 哌啶/N，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶液脱除Fmoc保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱或 弱酸来调节溶液的PH值，使脱除保护基后的二肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到 氨基自由的二肽片段H-Pr〇-Thr-NH2。
[0010] 3)Boc-Thr(tBu )-Pr〇-0H二肽片段的合成：氨基Boc或Fmoc保护，侧链轻基叔丁 醚保护或侧链无保护的脯氨酸在-15 °C条件下，与氯甲酸异丁酯和N-甲基吗啡啉作用， 形成混合酸酐，再与羧基甲酯保护的脯氨酸H-Pro-OMe反应，生成保护的二肽。然后用NaOH 皂化反应脱除甲酯保护基。将反应液倒入纯水中，加酸调节溶液的PH值，使羧基自由的二 肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到保护的二肽片段Boc-Thr (tBu) -Pro-OH。
[0011] 4)四肤 H-Thr-Pr〇-P;r〇-Th;r-NH2 的合成：保护的二肤片段 Boc-Thr (tBu)-Pr〇-〇H 在-15 °C条件下，与氯甲酸异丁酯和N-甲基吗啡啉作用，形成混合酸酐，再与氨基自由的 二肽片段H-Pr〇-Thr-NH 2缩合，生成保护的四肽。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸（TFA) 脱除保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱或弱酸来调节溶液的PH值，使脱除保护基后 的四肽从水中析出，过滤，洗漆，真空干燥，得到目标化合物四肽H-Thr-Pr〇-Pr〇-Thr-NH 2。
【具体实施方式】
[0012] 通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述。
[0013] 实施例 1 四肤 H-Thr-Pr〇-P;r〇-Th;r-NH2 制备
[0014] 1. 1苏氨酸羧基的酰胺化（H-Thr-NH2)
[0015] 500ml 三口瓶中加入 Boc-Thr (tBu)-0H20g(0.073mol)，无水四氢呋喃 (THF) 150ml，搅拌使固体溶解。冰盐浴降温到-10 °C?_15°C，加入N-甲基吗啡啉8ml， 然后滴加氯甲酸异丁酯l〇ml，保持温度不高于-10 °C，滴加完毕后保持低温反应10min， 然后加入氨水20ml，冰浴反应30min，然后室温反应8h。停止反应，加水300ml，加乙酸乙酯 200ml提取析出物，水洗3遍。无水硫酸钠干燥6h。过滤，然后减压蒸除溶剂，得白色固体 16. 6g，产率 83%。
[0016] 将上述产物溶于50ml三氟乙酸或2N盐酸/乙酸乙酯溶液，室温反应lh，蒸除溶剂 后得白色固体，即羧基酰胺化的苏氨酸三氟乙酸/盐酸盐H-Thr-NH 2. HC1。
[0017] 1. 2脯氨酸-苏氨酸二肽片段H-Pr〇-Thr-NH2的制备
[0018] 500ml 三口瓶中加入 Boc-Pr〇-0H20g(0. 093mol)，无水四氢呋喃（TH F) 200ml, 搅拌使固体溶解，冰盐浴降温到-l〇°C?-15 °C，加入N-甲基吗啡啉11ml，然后滴加氯 甲酸异丁酯13ml，保持温度不高于-10 °C，滴加完毕后保持低温反应10min。H-Thr-NH2. HC114. 5g溶于50ml四氢呋喃中，加入N-甲基吗啡啉11ml。将上述溶液加入到反应液中， 低温反应30min，然后室温反应8h。停止反应，加水300ml，加乙酸乙酯200ml提取析出物， 水洗3遍。无水硫酸钠干燥6h。过滤，然后减压蒸除溶剂，得白色固体25.7g，产率82%。
[0019] 将上述产物溶于100ml三氟乙酸或2N盐酸/乙酸乙酯溶液，室温反应lh，蒸除溶 剂后得白色固体，即脯氨酸-苏氨酸二肽盐酸盐H-Pr〇-Thr-NH 2. HC1。
[0020] 将上述产物溶于100ml纯水中，加入碳酸钠溶液调节PH值，析出白色固体，过滤， 真空干燥，得目标产物脯氨酸-苏氨酸二肽片段H-Pr 〇-Thr-NH223g。
[0021] 1. 3保护的苏氨酸-脯氨酸二肽片段Boc-Thr (tBu) -Pr〇-0H的制备
[0022] Boc-Thr (tBu) -0H20g (0· 073mol)溶于无水四氢呋喃（THF) 150ml，搅拌使固体 溶解。冰盐浴降温到-10 G?-15 °C，加入N-甲基吗啡啉8ml，然后滴加氯甲酸异丁 酯10ml，保持温度不高于-10 °C，滴加完毕后保持低温反应10min。脯氨酸甲酯盐酸盐
【权利要求】
1. 四肽H-Thr-Pr〇-Pr〇-Thr-NH2的液相合成方法，该方法由两个二 肽片段缩合而 成，使用水作为缩合反应后处理溶剂，中间体不需柱层析纯化。
2. 权利要求1所述的四肽H-Thr-Pr〇-Pr〇-Thr-NH2的液相合成方法，包括以下步骤： 1) 苏氨酸羧基酰胺结构H-Thr-NH2的合成：氨基叔丁氧羰基（Boc)或9-莉甲氧羰基 (Fmoc)保护的苏氨酸在-15°C条件下，与氯甲酸异丁酯及N-甲基吗啡啉作用，形成混合 酸酐，再与氨水反应，生成羧基酰胺化的保护苏氨酸。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸 (TFA)脱除Boc保护基，或者用哌啶/N，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶液脱除Fmoc保护基。 5)二肽片段H-Pr〇-Thr-NH2的合成：Boc或Fmoc保护的脯氨酸在-15°C条件下，与氯甲 酸异丁酯及N-甲基吗啡啉作用，形成混合酸酐，再与上步制备的羧基酰胺化的苏氨酸缩合 反应，生成氨基保护的二肽。将反应液倒入纯水中，滤出析出物，干燥。然后用盐酸/有机 溶剂或三氟乙酸（TFA)脱除Boc保护基，或者用哌啶/N，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶液脱除 Fmoc保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱或弱酸来调节溶液的PH值，使脱除保护基后 的二肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到氨基自由的二肽片段H-Pr〇-Thr-NH 2。 2. Boc-Thr (tBu) -Pro-OH二肽片段的合成：氨基Boc保护，侧链轻基叔丁醚保护或侧链 无保护的脯氨酸在-15°C条件下，与氯甲酸异丁酯及N-甲基吗啡啉作用，形成混合酸酐，再 与羧基甲酯保护的脯氨酸H-Pro-OMe反应，生成保护的二肽。然后用NaOH皂化反应脱除甲 酯保护基。将反应液倒入纯水中，加酸调节溶液的PH值，使羧基自由的二肽从水中析出，过 滤，洗涤，真空干燥，得到保护的二肽片段Boc-Thr (tBu) -Pro-OH。 3) 四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH 2的合成：保护的二肽片段 Boc-Thr(tBu)-Pr〇-0H在-15 °C条件下，与氯甲酸异丁酯及N-甲基吗啡啉作用，形成混 合酸酐，再与氨基自由的二肽片段H-Pr〇-Thr-NH2缩合，生成保护的四肽。然后用盐酸/有 机溶剂或三氟乙酸（TFA) -次性脱除保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱来调节溶液 的PH值，使脱除保护基后的四肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到目标化合物四肽 H-Thr-Pr〇-Pr〇-Thr_NH2 〇
【文档编号】C07K1/06GK104109189SQ201310134375
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月18日 优先权日:2013年4月18日
【发明者】史卫国, 仲伯华, 樊士勇, 姚宜山 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所