专利名称：感染和其它疾病的治疗的制作方法
背景技术：
相关技术的交叉引用本发明要求享有在2002年10月25日申请的美国临时专利申请(SerialNos.60/421038)和在2002年2月6日申请的美国临时专利申请(SerialNos.60/354250)的权益。
1、发明领域本发明涉及微生物感染和其它肠胃疾病治疗的领域。
2、背景技术描述通过传统方法治疗微生物感染、细菌、病毒和真菌感染是困难的。这些感染可能包括肠胃感染(大肠杆菌、幽门螺杆菌、耐万古霉素肠球菌等)，腹部感染(腹膜炎、胰腺炎、胆囊感染等)，外科感染和骨髓炎(骨感染)。
微生物感染的另外一个例子是炭疽热。炭疽热是由一种革兰氏阳性菌——炭疽杆菌引起的传染病。它起初是发生在食草动物身上的疾病。炭疽热会传染多种不同的脊椎动物，其中包括人类。炭疽热的症状根据传染的途径变化多端。这种疾病的发生形式一般包括皮肤形式、肠胃形式和肺部(呼吸)形式。这种疾病的肺部形式主要是由于吸入炭疽孢子引起的。通过使用引起炭疽热病变、病态、致病性的病毒因子(内毒素)，在许多动物模型身上再现了炭疽热综合症状。由炭疽杆菌产生的大量炭疽毒素一旦在体内产生，使用抗生素通常是没有效果的。炭疽热引发的病变出现败血症休克和猝死症，和其它革兰氏阳性和革兰阴性细菌感染一致，比如说多器官功能衰竭、水肿和急性呼吸困难综合症。在动物和人类身上，炭疽热引发的病变也包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1β(IL-1β)、血小板活化因子(PAF)和其它许多炎症细胞因子的明显增加。炭疽热引发的败血症休克是产生过多的反应性氧代谢中间产物(reativeoxygen intermediates)，并且花生四烯酸(aracidonic acid)的代谢物比如说前列腺素E(PGE)和血栓素β的增加2以及肌动蛋白细胞骨架的瓦解。
已报道了许多方法用来延迟、防止和/或者治疗炭疽热。在预防领域，通过疫苗的效用，人类疫苗是否具有可行性并不清楚。当今可行的最好的治疗是用特定的抗生素，比如说环丙沙星(ciprofloxaxin)、强力霉素(doxycyclin)。如果在感染的特别早期就给以抗生素，抗生素是有效的，一旦细菌有机会繁殖并且产生足以致死量的炭疽热毒素，抗生素就基本无效了。在炭疽热的三种形式中，最能致死的是肺部(呼吸)形式的炭疽热，它的致死率超过了75％(即使使用了正确的抗生素治疗)。炭疽热产生了一种多成分的毒素，这种毒素聚集在受感染的宿主细胞表面。在众多多亚单位的毒素中，炭疽热毒素是唯一能在人类中引起sever illness的毒素。当用抗生素治疗细菌感染时，一个主要的问题是更多数量的抗生素抗性株的出现。而且，一旦炭疽杆菌已经产生了大量的内毒素，抗生素基本是无效的。
数百万的美国人遭受着其它肠胃疾病的痛苦，比如说结肠炎、回肠炎、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、腹痛、齿龈炎、局限性肠炎、溃疡、贮存袋炎(pouchitis)、硬化、胆管炎、瘘管。在这些疾病中，许多疾病的起因并不清楚。然而，它们可能是由于遗传，或者是由于生活中特定的化学制品、病原体、免疫功能障碍、或生活中的食物引起的，或者是由于人体的正常老化引起的。肠胃疾病在男性和女性中都会发生，可能是急性或者是慢性的，使人虚弱和恐惧，可能发生在肠胃的任何部位，包括，并不限制，口腔、咽喉、食道，胃、大肠和小肠、结肠和肛门。遭受肠胃疾病的人们生活质量可能大大下降，并有可能过早死亡。
根据肠胃病变的位置和性质，已经报道了许多用于治疗肠胃疾病的治疗方法。这些治疗包括手术治疗、规定饮食和使用各种各样的药物和生物药品。这些药品包括抗生素、抗病毒的、抗炎症的药品、糖皮质激素、免疫抑制药物、单克隆抗体、抗酸剂、抗分泌药物、抗痉挛的药物，以及其它许多药物。
大量的药物、营养品或者疗效性护肤品(cosmeceutical)的制剂被建议用来治疗微生物感染和肠胃疾病所引起的损伤。
在这个领域，还需要改进用于治疗微生物感染和肠胃疾病引起的损伤的方法和药物。
发明概述按照本发明，感染和肠胃疾病的治疗方法包括给予一个需要该治疗的患者一个有效量的包含氨基酸序列LKKTET或者其保守变异体的组合物。
发明详述本发明是基于这样的发现，肌动蛋白螯合肽，比如说胸腺素β4和包含氨基酸序列LKKTET或者其保守变异体的其它肌动蛋白螯合肽或者肽片段，促进了微生物感染和肠胃疾病的治疗。没有局限于任何特殊的理论，这些多肽通过能够诱导末端脱氧核苷酸转移酶(一种非模板指导的DNA聚合酶)，降低一种或多种炎性细胞因子或化学因子的水平，并作为内皮细胞趋化因子和/或者血管形成因子，而具有促进修复，治愈和预防的能力，从而治疗微生物和肠胃感染引起的损伤。
胸腺素β4最初是作为一种在体内内皮细胞迁移和分化时上调的蛋白被鉴定的。胸腺素β4是最初从胸腺分离的，包含43个氨基酸，4900道尔顿，在各种组织中广泛存在的多肽。这个蛋白起着许多作用，其中包括在内皮细胞分化和迁移、T细胞分化、肌动蛋白螯合和血管形成中的作用。
按照一个实施方案，本发明是治疗与微生物感染相关的损伤的方法，包括给予一个需要该治疗的患者有效量的一组合物，该组合物含有一抑制微生物感染的多肽，该多肽包含LKKTET氨基酸序列或具有微生物感染抑制活性的其保守变异体，优选的是胸腺素β4，同工型胸腺素β4，氧化的胸腺素β4，胸腺素β4硫氧化物，或者是胸腺素β4的一种拮抗物。
按照本发明，可以使用的组合物包括胸腺素β4，胸腺素β4同工型，氧化的胸腺素β4，胸腺素β4硫氧化物，具有肌动蛋白结合区的多肽或任何其他肌动蛋白螯合或结合蛋白，或者是包含氨基酸序列LKKTET或其保守变体，或者是基本由此组成的具有微生物感染抑制活性的肽片段。国际申请(SerialNo.PCT/US99/17282)，其在此通过引用结合，公开了根据本发明可利用的Tβ4的同工型以及LKKTET氨基酸序列和具有微生物抑制活性的其保守变异体，它们可以用于本发明。国际申请(Serial No.PCT/GB99/OO833(WO 99/49883))，其在此通过引用结合，公开了按照本发明可用的氧化的胸腺素β4。尽管本发明在下文主要说明是关于胸腺素β4和胸腺素β4同工型，应当理解的是，下面的说明也适用于氨基酸序列LKKTET，包含LKKTET和具有微生物感染抑制活性的其保守变异体，或是主要由此构成的肽和片段，以及氧化的胸腺素β4。
在一个实施方案中，本发明提供了一种医治患者由微生物感染引起的损伤的方法，该方法是通过用有效量的抑制微生物感染的组合物接触需治疗的区域，该组合物含有胸腺素β4或胸腺素β4同工型。这种接触可以是局部给药，全身给药，或者是肠内给药。局部给药的实施例，比如说，用单独包含胸腺素β4或者加上至少一种加强胸腺素β4穿透性或者延缓或减慢胸腺素β4释放到需治疗的区域的药剂的洗液、药膏、凝胶、乳脂、软膏、喷雾、悬浮液、分散剂、水凝胶、油膏、油接触皮肤。全身给药包括，比如说，静脉的、腹膜内的、肌肉注射或者皮下注射，或者吸入，经皮的给药或者口服等一含胸腺素β4或胸腺素β4同工型的组合物。肠内给药可以包括口服和直肠给药。患者可以是哺乳动物，优选的是人类。
胸腺素β4，或其同功物、同工型或者衍生物可以以任何有效量给药。比如说，胸腺素β4可以以范围在0.1-50微克的剂量给药，优选的是大约1-25微克。按照本发明的组合物可以每天给药，每隔一天给药等，每天给药可以一次给药，或者多次给药，比如说每天给药2次、3次、4次或者更多的次数。
已经鉴定了胸腺素β4同工型，与已知的胸腺素β4氨基酸序列有大约70％、或大约75％，或大约80％或是更多的同源性。这些同工型包括，比如说，胸腺素β4ala，胸腺素β9，胸腺素β10，胸腺素β11，胸腺素β12，胸腺素β13，胸腺素β14和胸腺素β15。和胸腺素β4相似的是，已发现同工型胸腺素β10能够螯和肌动蛋白。胸腺素β4，胸腺素β10和胸腺素β15，和这些其它的同工型都包含氨基酸序列LKKTET，这个序列似乎参与介导肌动蛋白的螯合或结合。尽管没有局限于任何特殊的理论，胸腺素β4同工型的活性可能部分归功于其调节肌动蛋白聚合作用的能力。比如说，胸腺素β4能够调节皮肤中的肌动蛋白的聚合作用(比如说，β-胸腺素通过螯合游离的G-肌动蛋白解聚F-肌动蛋白)。胸腺素β4调节肌动蛋白聚合作用的能力可能因此全部或部分归功于其通过LKKTET序列结合或螯合肌动蛋白的能力。因而，和胸腺素β4一样，其它具有结合或螯合肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合作用的蛋白，包括包含氨基酸序列LKKTET的胸腺素β4同工型，单独或者和胸腺素β4联合作用，似乎都可减少微生物感染，如此所述。
因而，能够特别预料到，已知的胸腺素β4同工型，比如说，胸腺素β4ala，胸腺素β9，胸腺素β10，胸腺素β11，胸腺素β12，胸腺素β13，胸腺素β14和胸腺素β15，以及尚未被鉴定的胸腺素β4同工型都会在本发明的方法中有用。这类胸腺素β4同工型在本发明中的方法中应用到，包括在患者中使用的方法。本发明进一步提供了包含胸腺素β4、以及胸腺素β4同工型胸腺素β4ala，胸腺素β9，胸腺素β10，胸腺素β11，胸腺素β12，胸腺素β13，胸腺素β14和胸腺素β15、以及药学上可接受的载体的药物组合物。
而且，其它具有肌动蛋白螯合或结合能力的蛋白，或那些能够动员肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合作用的蛋白，就像在适当的螯合、结合、动员或者聚合实验中所证实的，或者通过诸如LKKTET的介导肌动蛋白结合的氨基酸序列的存在而被发现的蛋白，都可同样地用于本发明的方法。这些蛋白包括，比如说，(肌动蛋白)凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)，(肌动蛋白)抑制蛋白、cofilin、adsevertin、前肌球蛋白(propomyosin)、fincilin、蚕食蛋白、脱氧核糖核酸酶I，Vilin，(肌动蛋白)片段化蛋白，肌割蛋白(肌动蛋白)、(肌动蛋白)加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和acumentin。由于这类方法包括在那些患者中实施的方法，本发明进一步提供了含有上述(肌动蛋白)凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)，(肌动蛋白)抑制蛋白、cofilin、adsevertin、前肌球蛋白(propomyosin)、fincilin、蚕食蛋白、脱氧核糖核酸酶I，Vilin，(肌动蛋白)片段化蛋白，肌割蛋白(肌动蛋白)、(肌动蛋白)加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和acumentin的药物组合物。因此，本发明包括了微生物感染抑制活性的多肽的用途，该多肽包含氨基酸序列LKKTET(可以是在它的原始氨基酸序列范围内)和其保守变体。
这里所用的术语“保守变异体”或其语法上的变化指的是用另一个生物学上类似的残基替代一个氨基酸残基。保守变异体的例子包括疏水性残基比如说异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者蛋氨酸的替换，极性残基的替换，比如说用精氨酸替代赖氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，谷酰胺替代天冬酰胺等等。
已将胸腺素β4定位在许多的组织和细胞类型中，因而可将能够刺激胸腺素β4产生的药剂加入到组合物中，或者包含组合物，以实现胸腺素β4从组织和/或细胞的产生。这些药剂包括生长因子家族的成员，例如胰岛素样生长因子(IGF-1)，血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子β(TGF-β)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胸腺素α1(Tα1)和血管内皮生长因子(VEGF)。优选的是，该药剂是转化生长因子β(TGF-β)或者转化生长因子β超家族的其它成员。通过胞外基质沉积、细胞迁移、和皮肤血管形成，本发明的胸腺素β4组合物通过实现相连组织的增长从而降低微生物感染的效应。
另外，其它药剂可以和胸腺素β4或者胸腺素β4同工型一起加入到组合物中。这些药剂包括血管生成剂(angiogenic agents)、生长因子，指导细胞分化的药剂、促进细胞迁移的药剂和刺激皮肤中胞外基质物质供应的药剂。例如，并不限制，胸腺素β4或胸腺素β4同工型能够单独或联合与下列试剂中的一种或多种一起以有效量被添加血管内皮生长因子、角质形成细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、白细胞介素1，前胸腺素α(prothymosinα)和胸腺素α1。
医治与微生物感染相关的损伤的实际剂量或试剂，配方或组成物依赖于许多因素，包括患者的体型和健康状况。然而，本领域的普通技术人员能够使用在上述PCT/US99/17282以及其中引用的参考文献中描述的决定临床剂量的方法和技术的指导，以决定使用的适当剂量。
合适的配方包含重量浓度大约在0.001-10％，优选重量浓度在0.01-0.1％的范围，最优选重量浓度为0.05％的胸腺素β或者胸腺素β4同工型。
这里所述的治疗方法包括以各种途径给予或输送患者包含胸腺素β或本发明中的其它化合物的药剂或组合物，包括任何常规的对患者的给药技术(例如，并不限制，局部给药，定点注入，吸入，全身或肠内给药)。可以通过与药学上可接受的无毒性的赋形剂或载体混合，将使用或包含胸腺素β4或本发明中的其它化合物的组合物和方法，配制成药物组合物。
本发明包括与胸腺素β4肽或其功能片段互相作用的抗体的用途。提供了包括具有不同的表位特征的混合型单克隆抗体和明确的(distinct)单克隆抗体制剂的抗体。单克隆抗体来源于包含这些蛋白片段的抗原，通过为本领域的普通技术人员所熟知的在上述PCT/US99/17282中公开的方法。本发明用到的术语抗体意在包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗细菌感染的方法，包括给予一个需要该治疗的患者有效量的一组合物，该组合物含有抑制细菌感染的多肽，所述多肽包含氨基酸序列LKKTET或者具有细菌感染抑制活性的其保守变异体。
在又一个实施方案中，本发明提供了治疗肠胃感染的方法。通常的肠胃感染包括，并不限制，幽门螺杆菌(H.pylori)，大肠杆菌(E.coli.)，耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。组合物可以用过注射、口服、鼻吸入，通过栓剂或灌肠剂，皮肤给药或其它任何合适的方法输送。
在又一个实施方案中，本发明提供了治疗炭疽热的方法。由炭疽热感染引起的损伤包括败血症休克、猝死症、多器官功能衰竭、水肿、急性呼吸困难综合症和炎症，变性，免疫损伤。组合物能够单独或者和一种抗生素比如说环丙沙星(ciprofloxaxin)、强力霉素(doxycyclin)或者青霉素联合使用。在一个治疗的过程中，治疗有效量的组合物定期地被用到某个位置上或者全身给药，以减少或预防生物剂比如说炭疽热引起的病变和致病性。该组合物也可以全身递送，通过注射、口服、鼻吸入、或者任何其它方法，以减少肺部或肠胃炭疽热的毒性。
本发明的另一个方面是治疗其它肠胃疾病。按照一个实施方案，本发明是治疗与肠胃疾病有关的损伤的方法，包括给予一个需要该治疗的患者有效量的一组合物，该组合物含有抑制肠胃疾病的多肽，所述多肽包含LKKTET或具有肠胃疾病抑制活性的其保守变异体。本发明适用于炎症、溃疡、变性、免疫的和其它损伤和肠胃部位的疾病(从口腔到肛门)。这些疾病是由遗传异常、食物不耐性、化学制品、老化和微生物感染引起的。
本发明适用的肠胃疾病包括，并不限制，包括细菌、病毒和真菌感染的肠胃感染，和环境或者治疗损伤相关的疾病，发炎和其它炎症，免疫失调，包含食物过敏的过敏，节段性回肠炎，溃疡性结肠炎，复发性阿弗他溃疡(复发性口溃疡)，回肠炎，腹痛，齿龈炎，局限性肠炎，溃疡，贮存袋炎(pouchitis)，硬化，胆管炎，瘘管和遗传异常。它们可能是由于生活中特定的化学制品、病原体、免疫功能障碍引起的，或生活中的食物、或者是由于人体的正常老化引起的。
在一个实施方案中，本发明提供了通过用对肠胃疾病有效量的含有胸腺素β4或一种胸腺素β4同工型的组合物接触皮肤来医治患者由于肠胃疾病引起的损伤的方法。这种接触可以是局部给药，全身给药，或者是肠内给药的，局部给药的实施例，比如说，用单独含有胸腺素β4或者加上至少一种加强胸腺素β4穿透性或者延缓或减慢胸腺素β4释放到需治疗的区域的药剂的洗液、药膏、凝胶、乳脂、软膏、喷雾、悬浮液、分散剂、水凝胶、油膏、油接触皮肤。全身给药包括，比如说，通过静脉的、腹膜内的、肌肉注射或者皮下注射，或者吸入(口服或鼻吸入)，经皮给药，栓剂、灌肠剂或者口服一含有胸腺素β4或胸腺素β4同工型的组合物。被试者可以是哺乳动物，优选的是人类。
本发明也指的是一种含有氨基酸序列LKKTET或其保守变异体的物质，该物质用于制备治疗包括炭疽热和肠胃疾病的微生物感染的药物。
实施例胸腺素β4在浓度5-20n mol/ml时显示了抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，并在浓度50-200n mol/ml时具有逐渐增加的抑制这些微生物的剂量依赖活性。
序列表ROTHOO~1SEQUENCE LISTING<110>雷根内克斯生物制药有限公司<120>感染和其它疾病的治疗<130>ROTH005-04P4<150>US 60/421,038<151>2002-10-25<150>US 60/354,250<151>2002-02-06<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Leu Lys Lys Thr Glu Thr1 权利要求
1.治疗微生物感染的方法，包括给予需要这样的治疗的患者有效量的一组合物，该组合物含有抑制微生物感染的多肽，所述多肽包含氨基酸序列LKKTET或具有微生物感染抑制活性的其保守变异体。
2.权利要求1的方法，其中所述的多肽包括胸腺素β4、胸腺素β4的N末端变异体、胸腺素β4的C末端变异体、胸腺素β4同工型、氧化的胸腺素β4或胸腺素β4硫氧化物。
3.权利要求1的方法，其中所述的组合物是全身给药。
4.权利要求1的方法，其中所述的组合物是局部给药。
5.权利要求1的方法，其中所述的组合物是肠内给药。
6.权利要求1的方法，其中所述微生物感染是细菌感染。
7.权利要求1的方法，其中所述微生物感染是炭疽热感染。
8.权利要求1的方法，其中所述微生物感染是肠胃感染。
9.治疗肠胃感染的方法，包括给予需要这样的治疗的患者有效量的一组合物，该组合物含有抑制肠胃疾病的多肽，所述多肽包含氨基酸序列LKKTET或具有肠胃疾病抑制活性的其保守变异体。
10.权利要求9的方法，其中所述的肠胃疾病与感染、损伤、炎症、过敏、免疫失调或遗传异常相关。
11.权利要求9的方法，其中所述的肠胃疾病是节段性回肠炎。
12.权利要求9的方法，其中所述的肠胃疾病是溃疡性结肠炎。
13.权利要求9的方法，其中所述的肠胃疾病是复发性阿弗他溃疡。
14.一种用于制备治疗微生物感染的药物的物质，包含氨基酸序列LKKTET或具有微生物感染抑制活性的其保守变异体。
15.一种用于制备治疗肠胃疾病的药物的物质，包含氨基酸序列LKKTET或具有肠胃疾病抑制活性的其保守变异体。
全文摘要
通过给予包含氨基酸序列LKKTET的肌动蛋白螯合肽，例如胸腺素β4，胸腺素β4同工型，氧化的胸腺素β4或者胸腺素β4硫氧化物来治疗或预防包括炭疽热感染和肠胃疾病的微生物感染。
文档编号C07K14/00GK1692125SQ03803303
公开日2005年11月2日 申请日期2003年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者艾伦·L·戈尔德斯坦, 小杰克·芬科尔斯坦 申请人:雷根内克斯生物制药有限公司