专利名称：小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，本发明涉及小麦抗旱相关蛋白基因，即小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2；另外，本发明还涉及小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2的应用。
背景技术：
小麦是人类的主要粮食作物，但其生产发展严重地受到干旱缺水的制约。全世界发展中国家至少有6000万公顷小麦栽培在雨养耕地，产量水平只有灌溉条件下的10％-50％。我国平均每生产1吨小麦的需水量约为500-700m3。有证据表明，种植抗旱节水品种可明显提高干旱、半干旱地区的小麦生产，因此，培育抗旱节水品种是缓解水资源短缺矛盾的一种最经济有效的途径。
改良作物抗旱性对于提高农业生产力具有重大意义，受到世界各国的高度重视。其中，研究抗旱机理、克隆抗旱基因、通过植物基因工程改良作物抗旱性是一条有效途径。由于抗旱性遗传基础的复杂性，克隆转化抗旱基因的难度较大，但是，已经有一些成功的例子。在转基因方面，Cheng等(Molecular Breeding.2002，10(1-2)71-82)已经把小麦的LEA蛋白基因导入水稻，提高了转基因植株对旱、盐的耐性；WU等(Chinese ScienceBulletin.2003，48(23)2594-2600)将拟南芥的δ-OAT基因转入水稻使其过量表达，分析表明在叶和根中脯氨酸含量明显增加，增强了植株对旱和盐的抗性。Dubouzet等(Plant J.2003，33751-763)把水稻编码转录激活蛋白基因OsDRE1A导入拟南芥后，转化植株表现了强抗旱、抗盐和耐寒特性。
目前，已克隆的抗旱相关基因主要包含以下几种类型(1)转录因子主要包括在拟南芥中发现的DREB1 A-C、DREB2 A-B、CBF1-3、Hs和AtGluR2等(曾华宗等.植物遗传资源学报，2003，4(3)270-273)；(2)编码氨基酸合成基因以脯氨酸(Pro)合成酶基因为主，包括吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS及PVAB2，吡咯琳-5-羧酸还原酶基因P5CR及PproC1和榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白基因AhProT1等；(3)功能蛋白基因以晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)为主，包括棉花的D19、B19.1D11、D29，拟南芥的COR15a和PrabaT1，小麦的LEA蛋白基因。小GTP结合蛋白Rab2基因也已经在多种植物中得到克隆，包括在水稻中克隆的ScRab基因(ElaMizrahi-Aviv等.Taylor & Francis，2002，13295-300)及在Sporobolusstapfianus(南非的一种植物)中克隆的小GTP结合蛋白Rab2基因(PatrickJ.O‘Mahony等.Plant Molecular Biology，1999，39809-821)等。
上述小GTP结合蛋白是一类在细胞内的运输过程中起重要作用的蛋白。它们通过结合GTP而激活，当GTP被水解为GDP后处于非活性状态。Rab2属于小GTP结合蛋白(也称为GTP酶)Ras相关大家族中的Rab亚家族。Rab GTP酶是一类调节分子，在真核细胞中调节膜运输，在细胞内吞作用和生物合成的蛋白运输中起重要的作用。新合成的蛋白从内质网到高尔基复合体以及分泌小泡的运输中涉及到的小泡的运转，都受到小GTP结合蛋白Rab的影响。Rab在细胞损伤修复时起保护作用。干旱胁迫诱导小GTP结合蛋白Rab2的表达，而且它还受其他外界胁迫因子，如盐碱(ElaMizrahi-Aviv等.Taylor & Francis，2002，13295-300)等的诱导而表达。然而，迄今为止，还未有关于编码小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2的报道。
发明内容
针对上述研究背景，本发明人深入研究，通过文库筛选，获得特异的EST(表达序列标签)，利用电子延伸和RT-PCR(Reverse Transcription-PCR反转录聚合酶链式反应)技术成功地克隆了小麦小GTP结合蛋白Rab2基因的全长cDNA序列，命名为TaRab2(Triticum aestivum GTP-bindingprotein rab2)，将其编码的Rab2 GTP酶命名为TaRab2，从而完成了本发明。
应当指出，包括自然发生的多态变异，例如由获得蛋白质的生物的物种、个体等的差异导致；由通过定点诱变法、随机诱变法等人工诱变处理引入遗传突变而引起的小麦小GTP结合蛋白Rab2的氨基酸缺失、替换和插入后得到的氨基酸序列也属于本发明要求保护的范围内。
因此，本发明的一个目的是提供一种核苷酸序列，其编码具有小GTP结合蛋白功能的如下蛋白质(i)或(ii)(i)其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过替换、缺失或插入一个或多个氨基酸衍生的蛋白质。优选该核苷酸序列为具有SEQ ID NO1所示序列的小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2。
本发明还有一个目的是提供上述小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2在植物基因工程中的应用，其特征在于在植物中表达TaRab2。在一个优选实施方案中，将TaRab2用于植物抗旱基因工程；在另一个优选实施方案中，将TaRab2用于植物抗盐和抗病害等抗逆基因工程。
TaRab2基因为首次在小麦中克隆的直接通过水分胁迫方法而诱导表达的基因，由于小GTP结合蛋白Rab2与外界胁迫因子，如干旱、盐碱、病害等相关，并在植物蛋白运输过程中起重要作用。从小麦中克隆该基因对于利用转基因方法培育小麦抗旱、抗盐或抗病害新品种具有重要的现实意义。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。
图1.TaRab2基因的全长cDNA序列及其推测的氨基酸序列。该图为TaRab2基因的全长cDNA序列及其推测的氨基酸序列图。该基因全长824bp，ORF区633bp，编码210个氨基酸，包括68bp的5’UTR和124bp的3’UTR。基因全长cDNA的第68位是ORF的5’端第一个起始密码子ATG，第700位是3’端终止密码子TAA，如图中粗体所示。
图2EST1及其电子延伸后新的核苷酸序列EST2。其中P1为RT-PCR的5’引物，P2为其3’引物，如图中粗体所示。
具体实施例方式
为了实现上述目的，本发明的一种优选实施方式如下所示。
我们以小麦(Triticum aestivum)抗旱品种为实验材料，通过对已经构建的水分胁迫24h和48h诱导表达的SSH(suppression subtractivehybridization)cDNA文库的筛选，获得了一些重要的小麦抗旱相关基因的EST；利用电子延伸及RT-PCR基因克隆技术，在小麦中成功地克隆了小GTP结合蛋白Rab2基因的全长cDNA序列，命名为TaRab2(Triticumaestivum GTP-binding protein rab2)。
我们以小麦(Triticum aestivum)抗旱品种旱选10号(中国农业科学院作物品种资源研究所提供种子)为实验材料，构建水分胁迫24h和48h诱导表达的SSH(suppression subtractive hybridization)cDNA文库，通过对文库的筛选，获得了一些重要的小麦抗旱相关基因的EST，其中，48h SSHcDNA文库由本课题组于2002年构建[王转等，遗传学报，2004，31(8)842-849]，24h SSH cDNA文库由本课题组于2003年构建(未发表)。利用电子延伸(本实验室网站http//192.168.0.150/)和RT-PCR基因克隆技术，在小麦中成功地克隆了小GTP结合蛋白Rab2基因的全长cDNA序列，命名为TaRab2(Triticum aestivum GTP-binding protein rab2)(如附图1)。反转录采用Invitrogen公司的M-MLV反转录试剂盒、Biometra公司的Thermocycler PCR仪和Promega公司的DNA聚合酶，扩增Tm55℃，35个循环。
实施例我们以小麦(Triticum aestivum)抗旱品种旱选10号(中国农业科学院作物品种资源研究所提供种子)为实验材料，通过对本课题组已经构建的水分胁迫24h和48h诱导表达的SSH(suppression subtractive hybridization)cDNA文库的筛选{48h SSH cDNA文库由本课题组于2002年构建[王转等，遗传学报，2004，31(8)842-849]；24h SSH cDNA文库由本课题组于2003年构建(未发表)}，采用反向Northern(方法参照王转等，小麦幼苗水分胁迫所诱导基因表达谱的初步分析，遗传学报，2004，31(8)842-849)和Northern方法{杂交用缓冲液为church缓冲液[1％BSA，1mM EDTA(pH8.0)，0.5M NaHPO4缓冲液(pH7.2)，7％SDS]，标记探针用Promega公司的Prime-α-gene Labeling System，同位素α-32P-dCTP标记探针}成功地筛选了这两个cDNA表达文库，获得了一些重要的小麦抗旱相关基因的EST；通过将序列在GenBank中进行Blast比较发现，其中一条EST的功能(见附图1EST1)与小GTP结合蛋白Rab2基因相关[与玉米小GTP结合蛋白Rab2B基因Zm-Rab2-B(登记号gi722327)，同源性为354/411(86％)；与玉米小GTP结合蛋白Rab2A基因Zm-Rab2-A(登记号gi722325)，同源性为324/374(86％)；与Sporobolus stapfianus(南非的一种植物)小GTP结合蛋白Rab2基因(登记号gi4837726)，同源性293/337(86％)]。于是，我们以这个EST为初始模板，利用电子延伸的方法(本实验室网站http//192.168.0.150/)获得了一个新的EST序列(见附图2EST2)。利用DNAStar软件中的primer select程序在该序列编码区的两端设计RT-PCR引物(见附图2EST2中粗体所示)，进行RT-PCR(反转录采用Invitrogen公司的M-MLV反转录试剂盒、Biometra公司Thermocycler PCR仪及Promega公司的DNA聚合酶，PCR退火温度为55℃，35个循环)，得到了824bp的PCR产物，根据《Molecular Cloning》[Sambrook J，Frisch E F等(Eds.)，第二版，冷泉港出版社，1989]”所述常规分子生物学方法将产物经载体连接、转化、质粒的PCR和酶切鉴定、序列测定[克隆载体为Promega公司pGM-T Easy载体，采用T4DNA连接酶，转化大肠杆菌JM109菌株，用EcoRI(Promega公司)酶切鉴定，测序仪为ABI公司的3730测序仪]，从而克隆了小GTP结合蛋白Rab2基因，命名为TaRab2，如附图1。通过在GenBank中进行Blastn比较发现，TaRab2基因与玉米小GTP结合蛋白Rab2B基因Zm-Rab2-B同源性达到89％(572/638)，与Sporobolus stapfianus小GTP结合蛋白Rab2同源性达到90％(515/567)，与水稻小GTP结合蛋白Rab2(ORRab-2)同源性达到89％(511/570)。该基因全长824bp，ORF区633bp，编码210个氨基酸，其蛋白理论分子量为MW＝22.961kD，等电点PI＝7.27。
注全长RT-PCR引物P1 5’CTCGTCGCTGCTCCTCTCCAAATCC 3’P2 3’GAAACAATAAAGTGCGCGGATACCT 5’应当理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。
序列表<110>中国农业科学院作物品种资源研究所<120>小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2及其应用<130>I040684<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>633<212>DNA<213>小麦<220>
<221>CDS<222>(1)..(633)<223>
<400>1atg tcg tac gcc tac ctc ttc aag tac atc atc atc ggc gac aca ggt 48Met Ser Tyr Ala Tyr Leu Phe Lys Tyr Ile Ile Ile Gly Asp Thr Gly1 5 10 15gtc ggc aag tcg tgc ctg ctg ctg cag ttc acc gac aag cgc ttc cag 96Val Gly Lys Ser Cys Leu Leu Leu Gln Phe Thr Asp Lys Arg Phe Gln20 25 30ccc gtc cac gac ctc acc atc ggc gtc gag ttc ggc gcc cgg atg atc 144Pro Val His Asp Leu Thr Ile Gly Val Glu Phe Gly Ala Arg Met Ile35 40 45acc atc gac aac aag ccc atc aag ctc cag att tgg gac acg gca ggc 192Thr Ile Asp Asn Lys Pro Ile Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly50 55 60cag gag tca ttc aga tcg ata act aga tca tac tac agg gga gct gct 240Gln Glu Ser Phe Arg Ser Ile Thr Arg Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala Ala65 70 75 80ggt gct ctt ttg gtt tat gac atc acc agg agg gaa acc ttt aat cat 288
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权利要求
1.一种核苷酸序列，其编码具有小GTP结合蛋白功能的如下蛋白质(i)或(ii)(i)其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过替换、缺失或插入一个或多个氨基酸衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1的核苷酸序列，其为具有SEQ ID NO1所示序列的小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2。
3.小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2在植物基因工程中的应用，其特征在于在植物中表达TaRab2。
4.根据权利要求3的应用，其中将小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2用于植物抗旱基因工程。
5.根据权利要求3的应用，其中将小麦小GTP结合蛋白Rab2基因TaRab2用于植物抗逆基因工程。
全文摘要
本发明通过对小麦cDNA文库的筛选，获得抗旱相关候选EST，利用电子延伸和RT－PCR技术克隆了一个小麦抗旱相关基因TaRab2(Triticum aestivum GTP－binding protein rab2)。另外，本发明还涉及小麦抗旱相关基因TaRab2的应用。该基因在真核细胞内的蛋白运输过程中起重要作用，调节膜运输功能，影响着细胞内吞作用和合成蛋白的运输，可能在细胞损伤修复时起保护作用。当植物受外界胁迫因子，如干旱、盐碱、病害等诱导时表达增强。该基因的克隆对利用转基因方法培育小麦抗旱节水新品种及小麦抗旱分子生物学研究具有重要现实意义。
文档编号C07K14/415GK1632121SQ200410009930
公开日2005年6月29日 申请日期2004年12月2日 优先权日2004年12月2日
发明者景蕊莲, 郭志爱, 臧庆伟, 昌小平 申请人:中国农业科学院作物品种资源研究所