专利名称：从海藻中提取岩藻甾醇的方法
技术领域：
本发明涉及生物化学或生物化工技术领域，具体地说是一种从海藻中提取岩藻甾醇的方法。
背景技术：
岩藻甾醇是一种植物甾醇，具有十分重要的生理功能，如保持生物内环境稳定、控制糖原和矿物质的代谢、调节应激反应等。在医学上，岩藻甾醇可抑制化学致癌剂所诱发的癌变，具有防治癌症的功能。也可作为甾体药物的重要来源，可作为合成雄性激素、雌性激素、肾上腺皮质激素等的原料。此外，岩藻甾醇(fucosterol)本身亦具有类雌激素的作用，用岩藻甾醇喂饲雏鸡，能明显降低血中胆固醇。而且岩藻甾醇能促进小肠和肾小管对钙的吸收，并对骨有直接作用，调节骨质中的无机盐的转运，是目前合成骨化三醇的几种稀有原料之一。因此岩藻甾醇有潜力成为广泛应用于医药、食品以及化妆品行业的一种必要物资，具有广阔的市场前景。
目前从海藻制备岩藻甾醇主要是用氧化铝层析制备为主，即使有用硅胶层析的方法制备，也需经过硅胶柱多次反复层析，致使其分离物质的量微少，只能用于结构鉴定、性质分析等实验水平，而且其结晶试剂含有甲醇等毒害物质，影响了使用的安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从海藻中提取岩藻甾醇的方法，它采用一次硅胶柱层析方法制备岩藻甾醇，而且结晶试剂采用乙醇溶液，达到了无毒害的目的。
岩藻甾醇是一种白色针晶，广泛存在于羊栖菜、海带、马尾藻等海藻中，以海藻为原料生产岩藻甾醇具有工艺简单、相对生产成本低廉、原料资源丰富等特点，所以研究开发从海藻中提取岩藻甾醇有着明显的经济价值和现实意义。
为了达到上述目的，本发明从海藻中提取岩藻甾醇的方法，包括以下步骤1)将干燥的海藻机械破碎，破碎后原料粒径在200目以下；2)原料粉末与提取溶剂质量比在1∶10～1∶20范围浸提，溶剂是乙醇、正丁醇，其浓度保证在＞75％以上，最佳浓度在95％；3)浸提中先用超声破碎设备超声破碎15min～30min，然后将破碎后悬浊液置于室温～60℃温度条件下浸泡12～24h；
4)初次浸提固液减压分离后的残渣，再加8～10倍乙醇或正丁醇提取溶剂，于室温～60℃温度再次浸泡12～24h，合并1、2次浸提所得滤液；5)不高于70℃条件下减压浓缩，其浓缩浸膏直接拌入层析用硅胶或经有机溶剂萃取后，将有机相拌入层析用硅胶，并于不超过80℃的条件干燥；6)将上述干燥的粉末加入到硅胶层析柱中，洗脱过程分别以1～3倍柱床体积体积比为15∶1～2∶1的乙酸乙酯一石油醚混合溶液进行梯度洗脱，分步收集洗脱溶液；7)以硫酸显色法检测甾醇组分，收集发生显色反应的部分，即为甾醇部分洗脱液，其第一甾醇峰即为岩藻甾醇部分；8)用稀碱溶液将岩藻甾醇溶液pH值调至9～11，于45℃～60℃皂化20min～30min。室温条件将以上溶液pH值调回至7，收集有机相；9)向有机相中加入活性炭，于45℃～60℃脱色，抽滤去除有色杂质，将抽滤所得溶液减压蒸干；10)将9)所获得固体溶解于浓度＞85％乙醇溶剂中，保证上述溶液在室温下接近饱和程度，将其置于＜4℃的环境中结晶，抽滤出针状结晶，于＜60℃条件下真空干燥或室温风干即为所得岩藻甾醇。
本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是1.本发明浸提液浓缩后可不经有机溶剂萃取直接拌入层析用硅胶，也可先用氯仿、乙醚等有机溶剂先萃取后，将有机相拌入层析用硅胶，将浸提溶液浓缩后直接拌入硅胶可以避免因萃取不完全导致的产量低的问题，产品纯度问题可以通过后续的结晶步骤得以解决，实现了一次硅胶柱层析制备岩藻甾醇；2.本发明结晶过程中乙醇溶液作为溶剂，使用该方法结晶所得的产品为白色的针状晶体，晶体形状规则，熔点在113℃～114℃之间，熔程范围小；由于使用的结晶溶剂是乙醇，所得产品质量可靠，无任何毒害有机溶剂残留；3.本发明皂化过程中一般选择乙醇溶液作为溶剂，避免皂化过程中产生两个极相，影响pH值的调节，而且使得生产试剂更易获得，生产成本更低。
综上所述，本发明所涉及工艺中采用了硅胶柱层析分离，产品以一元溶剂(乙醇)，一步结晶，无任何毒害，且其相对成本低廉，能够实现大规模工业化生产的要求。
具体实施例方式
以下通过实施例来进一步说明本发明，当本发明并不局限于此实施例。
实施例
1.将10kg干燥的海藻----褐藻羊栖菜或马尾藻或海带(未蒸煮，直接晒干)用铡刀将其切成小段，然后将切成的小段用粉碎机进行粉碎，其目数不小于200目，如果一次粉碎不够，可进行多次粉碎；2.向上述10kg羊栖菜粉末中加入200升浓度95％的乙醇，用木棒将其悬浊液搅匀，并以每次5升的量于3KW的超声波破碎仪中用最大功率破碎30min，显微镜下观察细胞的破碎程度，保证破碎充分；3.将破碎好的羊栖菜乙醇悬液倒回浸提罐中，45℃条件下过夜浸提(16小时)，并且浸提过程中将浸提罐中的旋转装置打开，实现动态恒温提取；4.将上述悬液置于抽滤器中抽滤，然后在抽滤所得残渣中加入100升浓度90％乙醇，继续在45℃条件下动态提取16小时，次日于抽滤器中抽滤，弃去残渣；5.收集两次抽滤后的滤液，加入到三效酒精回收塔中，减压回收乙醇，直到溶液为原体积的1/3为止，乙醇回收率一般在70％左右；6.将浓缩后的溶液于8000r/min条件下离心15min，弃去残渣，并将离心后的上清液100升分批加入到旋转蒸发仪中，于50℃条件下减压充分浓缩，将最后残留的浸膏200g直接拌入150g层析用硅胶中，并用乙醚清洗蒸发器皿，洗涤出的溶液再次拌入硅胶；7.将上述伴有硅胶的浸膏于60℃干燥箱中通风干燥，8小时后浸膏失水完全，颜色变为亮绿色，并将干燥的浸膏于碾钵中碾细；8.将200g干燥的硅胶粉末分别加入到用体积比为15∶1的乙酸乙酯--石油醚平衡好的两根硅胶层析柱中，分别以3倍柱床体积体积比为15∶1，10∶1，8∶1，5∶1，2∶1的乙酸乙酯-石油醚溶液进行洗脱；9.将上述洗脱部分分别取样，加入等量的乙酸酐溶液，并向其中加入一滴浓硫酸，反应5min，迅速置与紫外-可见分光光度计中，测定其光密度；此时洗脱液出现3个甾醇峰，收集第一个甾醇洗脱峰，即为岩藻甾醇洗脱部分；11.将收集到的9升岩藻甾醇溶液置于旋转蒸发仪中，50℃条件下蒸干，向球形烧瓶中加入无水乙醇溶液，振荡洗出固体，并将溶液体积调节至300ml；12.向上述300ml甾醇溶液中滴入2mol/L的NaOH溶液，将其pH值调至11左右，置于60℃水浴锅中，不停搅拌，并不时检测pH值，若其pH降低，迅速补加2mol/L的NaOH溶液，使其pH维持在11左右；13.30min后，从水浴锅中将上述溶液取出，室温冷却后，用2mol/L HCl溶液将其pH值调回至7，并向上述溶液中加入1/3体积的乙醚试剂，转入到分液漏斗中，上下振荡均匀，将分液漏斗置于铁架台中静置；14.待分液漏斗中两相界面分明后，打开阀门分去水相，将有机相转入到烧杯中，向有机相中加入2匙活性炭粉末，于60℃中水浴15min，并不时搅拌；注意乙醚溶剂极易挥发，所以加热过程中尽量将容器口封闭；水浴结束后，趁热迅速将上述溶液抽滤，并用等量乙醚重洗活性炭，过滤；15.将抽滤出的滤液200ml溶液加入到旋转蒸发仪中，60℃条件下减压蒸干；16.加入300ml分析纯乙醇溶液溶解，并将上述溶液在室温下调节到饱和状态，迅速将容器置于4℃冰箱中结晶；17.分批抽滤出所析白色针状晶体，置于冷冻干燥仪中，减压干燥，得到岩藻甾醇样品10g。
权利要求
1.从海藻中提取岩藻甾醇的方法，其特征在于包括以下步骤1)将干燥的海藻机械破碎，破碎后原料粒径在200目以下；2)原料粉末与提取溶剂质量比在1∶10～1∶20范围浸提，溶剂是乙醇、正丁醇，其乙醇浓度保证在＞75％以上，最佳浓度在95％；3)浸提中先用超声破碎设备超声破碎15min～30min，然后将破碎后悬浊液置于室温～60℃温度条件下浸泡12～24h；4)初次浸提固液减压分离后的残渣，再加8～10倍乙醇或正丁醇提取溶剂，于室温～60℃温度再次浸泡12～24h，合并1、2次浸提所得滤液；5)不高于70℃条件下减压浓缩，其浓缩浸膏直接拌入层析用硅胶或经有机溶剂萃取后，将有机相拌入层析用硅胶，并于不超过80℃的条件干燥；6)将上述干燥的粉末加入到硅胶层析柱中，洗脱过程分别以1～3倍柱床体积体积比为15∶1～2∶1的乙酸乙酯一石油醚混合溶液进行梯度洗脱，分步收集洗脱溶液；7)以硫酸显色法检测甾醇组分，收集发生显色反应的部分，即为甾醇部分洗脱液，其第一甾醇峰即为岩藻甾醇部分；8)用稀碱溶液将岩藻甾醇溶液pH值调至9～11，于45℃～60℃皂化20min～30min。室温条件将以上溶液pH值调回至7，收集有机相；9)向有机相中加入活性炭，于45℃～60℃脱色，抽滤去除有色杂质，将抽滤所得溶液减压蒸干；10)将9)所获得固体溶解于浓度＞85％乙醇溶剂中，保证上述溶液在室温下接近饱和程度，将其置于＜4℃的环境中结晶，抽滤出针状结晶，于＜60℃条件下真空干燥或室温风干即为所得岩藻甾醇。
全文摘要
本发明公开了一种从海藻中提取岩藻甾醇的方法。是通过层析、结晶等技术，从天然材料海藻中快速提取岩藻甾醇。具有分离速度快、分离成本低、原料丰富易得等优势。且该方法生产的产品纯度高(纯度＞90％)、晶体规则(白色针晶)、熔点范围小113～114℃等特点，适宜作为岩藻甾醇标准品及医药原料使用。本发明所涉及工艺中采用了一次硅胶柱层析分离，产品以一元溶剂(乙醇)，一步结晶，无任何毒害，且其相对成本低廉，能够实现大规模工业化生产的要求。
文档编号C07J9/00GK1563072SQ200410017519
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月5日 优先权日2004年4月5日
发明者龚兴国, 郭建军, 张锐 申请人:浙江大学