专利名称：天然1，3，7，9－四甲基尿酸的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然1，3，7，9-四甲基尿酸的生产工艺，即涉及一种以天然植物为原料的1，3，7，9-四甲基尿酸的生产工艺。
背景技术：
1，3，7，9-四甲基尿酸(1，3，7，9-tetramethyluric acid，theacrine)属于甲基黄嘌呤生物碱(methylxanthine)类物质。甲基黄嘌呤类生物碱是嘌呤核苷酸的二次衍生物，其分子结构以嘌呤环为主体，在不同部位再经甲基化或氧化。植物中的嘌呤类生物碱最为人熟知的是黄嘌呤的三种甲基衍生物，即咖啡碱(1，3，7-三甲基黄嘌呤)、可可碱(3，7-二甲基黄嘌呤)和茶碱(1，7-二甲基黄嘌呤)。该类物质在中枢神经系统、循环系统、呼吸系统等诸多方面都具有非常强的生理和药理作用，其中许多都为临床常用药物或者极有希望开发为药物的先导化合物。鉴于嘌呤生物碱显著的药理活性，临床上早已将咖啡碱、茶碱等嘌呤生物碱作为治疗多种疾病的药物。
嘌呤生物碱类物质一直以来备受人们的关注，以往研究表明，嘌呤生物碱中的代表咖啡碱可以兴奋中枢神经，统帅人体生理全局，其作用具体体现在振奋精神，强化思维，提高工作效率；帮助消化，增强营养健康水平；增强呼吸作用，提高代谢功能；强心活血，提高循环系统功能；利尿通便，消除废、残及有害物质；增强肝脏的净化解毒功能；消毒灭菌，抵御疾病；解热镇痛，对急性中毒起抢救作用等多个方面。
不同嘌呤生物碱类物质的结构区别主要在于嘌呤环上甲基的位置和个数。结构上的微小差别，导致了生理活性的不同。例如可可碱、茶碱与咖啡碱三者结构非常相似，但在上述活性方面与咖啡碱相比作用范围与作用强度均有很大不同，因此其临床应用范围也不尽相同。咖啡碱临床主要用于对抗中枢性抑制和调节大脑皮层活动，可可碱主要作为利尿剂、心兴奋剂和动脉扩张剂，茶碱则主要作为磷酸二脂酶抑制剂用于松弛支气管平滑肌。另有文献报道，尿酸和其它嘌呤类生物碱，包括1-甲基、7-甲基尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤，及类似结构的化合物，在铜催化的抗坏血酸氧化反应中都可以起到保护作用。但如果尿酸3或9位上的氢被甲基取代的话，则没有保护作用。可见生物碱上的取代基团对其作用性质有很大的影响。饮用传统茶由于咖啡碱的存在而有兴奋神经的作用，而可可茶(一种不含咖啡碱而含有大量可可碱的野生茶)由于含可可碱为主，其药理和生理作用与传统茶叶存在着差异，研究表明饮用可可茶不仅没有兴奋神经作用，相反具有中枢安定作用。
嘌呤类生物碱的一个主要来源就是茶。人类在过去5000多年里一直通过茶叶来提神醒脑，就是嘌呤生物碱类物质对中枢神经药理活性的具体体现。茶的许多其它的保健作用的物质基础也来源于所含的嘌呤生物碱类物质。
我国是茶叶原产地，茶叶物种资源极其丰富，具有很多野生种和变种茶，大部分分布在我国云南、贵州和四川一带。目前人们日常饮用的茶主要为两种茶C.sinensis(L.)O.Ktze和普洱茶C.assamica(Mast.)Chang.，它们都属于山茶科山茶属茶组植物，该组植物(Camellia Sect.Thea L.)共有32种(中国拥有30种)。目前在茶叶中发现的嘌呤类生物碱有咖啡碱、可可碱、茶碱、腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和拟黄嘌呤等。茶叶虽然富含嘌呤生物碱类物质，但32种茶组植物所含嘌呤生物碱的模式有所不同其中包括日常饮用的两种茶在内的一部分茶组植物的嘌呤生物碱模式以咖啡碱占绝对多数，其次为可可碱，茶碱只含有微量；还有一部分茶组植物，如可可茶(C.ptilophylla Ching)、滇缅茶(C.irrawadiensis Barua)和紫果茶(C.purpurea Chang et Chen)等，含有大量可可碱，而不含或少含咖啡碱，茶碱同样含量甚微；另外，据有的专利(中国专利公开号1149585A)报道，野生厚轴茶(C.crassicolumna)中含有大量茶碱，而咖啡碱和可可碱含量均非常低，故该种茶可以作为提取天然茶碱的原料。
本发明所应用的苦茶(C.assamica var.kucha)与上述几种茶均不相同，其中四甲基尿酸含量高达该种茶叶干重的1-2％，迄今在其他茶组植物甚至其他种属的植物中还没有发现过。苦茶是我国植物分类学专家张宏达先生1982年发表的茶的新变种(C.sinensis var.kucha Chang et Wang)，1998年，在《中国植物志》第49卷第3分册中，张先生又将其组合成C.assamica var.kuchaChang et Wang，作为普洱茶的变种。其雌蕊由3个心皮组成，在分类学系统上属于山茶属茶亚属茶组茶系，在亲缘关系上与云南大理茶和中国茶里的大叶品系接近，属大叶到特大叶品种。最近，在植物系统分类领域应用分子生物学新技术，用叶绿体DNA的二磷酸核酮糖羧化基因(rbcl.DNA)序列解析分系遗传相似性也证实了苦茶在分类学系统中的位置。
苦茶中，四甲基尿酸与咖啡碱含量相当，但在化学结构上比咖啡碱又多了一个甲基，因此脂溶性可能更高，生理活性可能与咖啡碱、可可碱等存有差异。虽然四甲基尿酸早在1937年，就已经从提取完咖啡碱后的几百吨茶叶废水中分离得到过少量，但近一百年过去了，由于其来源有限，关于其药理作用还只有很少零散的报导，并没有任何系统深入的研究。鉴于四甲基尿酸所属的嘌呤生物碱类化合物活性均非常强，加之以往我们的一些工作基础，对四甲基尿酸的系统药理学研究和开发具有重要的意义。但前提条件是解决其来源问题。
关于四甲基尿酸的化学合成方法曾有一篇报导(Vestnik SlovenskegaKemijskega Drustva，29(4)，331-43；1982)，以尿酸为反应底物，反应过程中使用到叠氮化钠，在使用该方法进行大量制备时极易爆炸，非常危险。因此仅可以在实验室少量合成，不适于大量工业化生产。
曾经采用以下方法合成了四甲基尿酸 该种方法虽然反应条件较温和，但是四甲基尿酸的收率很低，且反应底物3，7，9-三甲基尿酸价格昂贵，采用此种方法大量合成，成本将会非常高，因此实际可行性不大。
本发明的发明人之一叶创兴教授曾在1999年报道从苦茶C.sinensis var.kucha Chang et Wang中分离得到1，3，7，9-四甲基尿酸(叶创兴等，1999年9月，苦茶C.sinensis var.kucha Chang et Wang的嘌呤生物碱，中山大学学报(自然科学版)，第38卷第5期)。具体方法是采用100倍热水浸提30分钟，过滤，提取液浓缩后加入醋酸铅溶液沉淀酚性杂质。过滤后滤液以氯仿萃取，氯仿层以60-100目硅胶进行柱层析，乙酸乙酯洗脱，得到两个产物，分别是咖啡碱和1，3，7，9-四甲基尿酸，收率分别为干重的0.88％和0.84％。该实验初步证实了苦茶C.sinensis var.kucha是富含1，3，7，9-四甲基尿酸的品种，该文并未摸索出比较成熟的提取天然1，3，7，9-四甲基尿酸的工艺，原文所述的提取过程损失很大，收率较低，并非最佳工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供以一种天然1，3，7，9-四甲基尿酸的生产工艺。该工艺是以富含1，3，7，9-四甲基尿酸的野生变种茶—苦茶为原料，具有原料来源为天然植物，生产成本低廉，原料中四甲基尿酸含量高，工艺流程简单，产品得率高等特点。
本发明的天然1，3，7，9-四甲基尿酸的生产工艺，采用野生或栽培变种苦茶Camellia assamica var.kucha为原料，经过杀青、烘干、粉碎、溶剂提取、氯仿萃取或聚酰胺柱层析、反相色谱分离步骤富集获得1，3，7，9-四甲基尿酸，具体步骤如下A)苦茶提取液的制备将新鲜采摘的苦茶于笼屉上水蒸气加热迅速杀灭酶活性2.5分钟；取出晾干，于60℃烘箱中过夜烘干，干燥后粉碎成苦茶粉末；将苦茶粉末称重，以10～50倍量的水、乙醇或者含水乙醇于80～90℃浸提30～60分钟，过滤，将滤渣再以10～50倍量的水、乙醇或者含水乙醇于80～90℃浸提30～60分钟，过滤，合并两次滤液，减压浓缩成小体积，得苦茶提取液；B)苦茶总嘌呤生物碱的制备将苦茶提取液以等体积氯仿萃取三次，合并氯仿萃取液，减压回收氯仿，得苦茶总嘌呤生物碱部分；或者以聚酰胺填料装填开放玻璃柱管，苦茶提取液直接上样，水洗20个柱体积，减压蒸干水洗部分，得苦茶总嘌呤生物碱；C)1，3，7，9-四甲基尿酸的制备将苦茶总嘌呤生物碱部分溶解于10％甲醇—水溶液，ODS(反相C-18)填料以甲醇溶涨后装填开放玻璃柱，将ODS开放柱中的甲醇替换成10％甲醇—水后，将苦茶总嘌呤生物碱溶液上样，以10％甲醇—水衡比例洗脱。洗脱液以三分之一或二分之一保留体积收集为一个流分，以硅胶薄层层析检查，Rf值可可碱＞1，3，7，9-四甲基尿酸＞咖啡碱，合并相同流分，减压蒸干得四甲基尿酸纯品；D)结构鉴定和含量测定制得的1，3，7，9-四甲基尿酸经熔点、红外光谱或质谱的简单测定与标准品或者文献数据对照即可确证其化学结构，经RP-HPLC鉴定其纯度大于99％。
上述的生产工艺，杀青方法可以采取隔水蒸青等多种，其目的均在于迅速使茶叶中的酶失活，保持茶叶原有的成分和风味。如果采用隔水蒸青的方法，蒸青时间可以控制在0.5～20分钟之间，时间太短，酶灭活不完全，时间过长，茶叶中的茶多酚等类物质则易在高温下产生变化。本专利实施例中，采用隔水蒸青2.5分钟。
上述的生产工艺，烘干温度可以采用室温到90℃，最好控制在70-80℃，时间以茶叶干透为标准。
上述的生产工艺，由于1，3，7，9-四甲基尿酸、咖啡碱等嘌呤生物碱在热水、强极性溶剂乃至氯仿中溶解度都非常好，因此提取溶剂可采用水或者低级醇等强极性溶剂，或者其与水的混合溶剂。但鉴于苦茶提取物及四甲基尿酸是以药剂或健康食品作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂尽量选择水、乙醇或者含水乙醇为宜。提取时苦茶与溶剂的比率没有特定限制，但一般苦茶与溶剂的比例以1∶10～50范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可使用。如果采用水提取则温度应适当提高(80～90℃)比较理想。浸提过程中可以采用加热提取、超声提取、微波提取等多种处理方法，也可多种方法结合起来应用。提取时间从10秒到12小时范围都可以，以30～60分钟最佳。以上条件的改变，实验证明，其四甲基尿酸的得率都在允许的范围之内。
上述的生产工艺，总提取液浓缩为水溶液后，可进行萃取，萃取溶剂优选用氯仿，也可加入酚类物质的沉淀剂后再进行萃取，氯仿萃取部分即为苦茶总嘌呤生物碱部分。也可经过聚酰胺柱层析处理，以浓缩水提取液上样，以水，然后再以乙醇或甲醇进行洗脱，水洗部分同样为苦茶总嘌呤生物碱部分。
上述的生产工艺得到的苦茶总嘌呤生物碱部分，经过ODS(反相C-18)柱层析分离，10％甲醇水溶液恒比例洗脱，即可先后得到三种嘌呤类生物碱，分别是可可碱、1，3，7，9-四甲基尿酸和咖啡碱。
本发明的原料来源为山茶科山茶属茶组植物苦茶(Camellia assamica var.kucha)。苦茶原产地在云南铜厂乡，分布集中在海拔1320-1390米的向阳缓坡上。现已经通过人工扦插种植，进行了种群纯化和繁殖。本实验所采用的苦茶经高效液相色谱进行定量分析，其1，3，7，9-四甲基尿酸含量为1.58％，咖啡碱含量为0.94％，可可碱含量为0.22％，其它主要指标性成分与现行商品茶相当。本发明的原料苦茶的成分含量如下水浸出物33.9％茶多酚中(-)-epigallocatechin 3-O-gallate6.79％Catechin3.00％与现有技术比，本发明的有益效果在于1、采用的原料是一种富含1，3，7，9-四甲基尿酸的天然植物，即我国特有的变种茶苦茶(Camellia assamica var.kucha)，克服了现有化学合成方法采用有毒危险品为原料造成的高成本、低收率及环境污染等缺点；2、由于只用常规的粉碎、水加热提取、萃取、色谱分离等步骤，且所用试剂均为常用的成本低廉的化学试剂，使得本发明工艺流程简单、产品得率高(达茶叶干重1.5％左右)。
本发明的发明人之一叶创兴教授曾在1999年报道从苦茶C.sinensis var.kucha Chang et Wang中分离得到1，3，7，9-四甲基尿酸(见背景技术部分)。该论文所述的实验仅仅是初步证实了苦茶C.sinensis var.kucha是富含1，3，7，9-四甲基尿酸的品种，并未摸索出比较成熟的提取天然1，3，7，9-四甲基尿酸的工艺，原文所述的提取过程损失很大，收率较低，并非最佳工艺。本发明是在包括叶创兴教授在内的研究小组的努力摸索中，在这一发现的基础之上对生产工艺做了具有突破意义的补充和完善，达到了最高效的从苦茶中分离纯化1，3，7，9-四甲基尿酸的目的，产品得率远高于在先报道。
由于四甲基尿酸合成较难，因此苦茶可以作为四甲基尿酸的一个理想的低成本天然来源。在人们向往大自然，回归大自然的今天，避开化学合成方法而从天然原料中高收率的提取获得1，3，7，9-四甲基尿酸是一种创新的方法。
具体实施例方式
现用本发明的实施例进一步来说明本发明的详细内容，但本发明的内容不局限于此。
实施例一采用中山大学茶园中移栽的天然植物苦茶(Camellia assamica var.Kucha)芽和嫩叶160g为原料A)苦茶提取液的制备将新鲜采摘的苦茶芽与嫩叶于笼屉上水蒸气加热迅速杀灭酶活性2.5分钟；取出晾干，于60℃烘箱中过夜烘干，干燥叶片粉碎成苦茶粉末；将苦茶粉末称重，以20倍量的水90℃浸提30分钟，过滤，将滤渣再以20倍量的水90℃浸提30分钟，过滤，合并两次滤液，减压浓缩成小体积，得苦茶提取液；B)苦茶总嘌呤生物碱的制备将苦茶提取液以等体积氯仿萃取三次，合并氯仿萃取液，减压回收氯仿，得苦茶总嘌呤生物碱部分；C)1，3，7，9-四甲基尿酸的制备将苦茶总嘌呤生物碱部分溶解于10％甲醇—水溶液，ODS(反相C-18)填料以甲醇溶涨后装填开放玻璃柱，将ODS开放柱中的甲醇替换成10％甲醇—水后，将苦茶总嘌呤生物碱溶液上样，以10％甲醇—水衡比例洗脱。洗脱液以三分之一或二分之一保留体积收集为一个流分，以硅胶薄层层析检查，Rf值可可碱＞1，3，7，9-四甲基尿酸＞咖啡碱，合并相同流分，减压蒸干得四甲基尿酸纯品；D)结构鉴定和含量测定制得的1，3，7，9-四甲基尿酸FAB Ms225(M++1)，209，168，153。1H NMR(500FT，CDCl3，TMS)3.38(S，3H)，3.59(S，3H)，3.64(S，3H)，3.74(S，3H)；13C NMR28.2，29.3，30.6，31.6，99.4，135.5，150.7，151.9，153.5。该化合物的熔点、质谱数据与文献数据对照一致，紫外、红外光谱与标准品比较一致，可确证其化学结构，经RP-HPLC鉴定，其纯度大于99％。
HPLC条件Dionex HPLC系统P680泵/PDA 100二极管阵列检测器/ASI-100自动进样器色谱柱Mightysil RP-18 150-4.6(5um)柱温40℃流速1ml/min检测波长231nm流动相A乙腈∶水∶85％磷酸(5∶95∶0.05)B乙腈∶水∶85％磷酸(50∶50∶0.05)
实施例二采用中山大学茶园中移栽的天然植物苦茶(Camellia assamica var.kucha)芽和嫩叶200g为原料，A)苦茶提取液的制备将新鲜采摘的苦茶叶于笼屉上水蒸气加热迅速杀灭酶活性5分钟；取出晾干，于60℃烘箱中过夜烘干，干燥叶片粉碎成苦茶粉末；将苦茶粉末称重，以25倍量的95％乙醇60℃超声提取两次，每次1小时，合并滤液，减压浓缩至不含乙醇，得苦茶提取液。
B)苦茶总嘌呤生物碱的制备同实施例一。
C)1，3，7，9-四甲基尿酸的制备方法同实施例一，得1，3，7，9-四甲基尿酸纯品721mg，收率1.44％(占干重)。
D)结构鉴定和含量测定同实施例一。
实施例三采用中山大学茶园中移栽的天然植物苦茶(Camellia assamica var.kucha)芽和嫩叶120g为原料A)苦茶提取液的制备将新鲜采摘的苦茶嫩枝于笼屉上水蒸气加热迅速杀灭酶活性10分钟；取出晾干，于60℃烘箱中过夜烘干，干燥叶片粉碎成苦茶粉末；将苦茶粉末称重，以30倍量60％乙醇微波提取2次，每次1小时，过滤，合并两次滤液，减压浓缩成小体积水溶液，得苦茶提取液。
B)苦茶总嘌呤生物碱的制备同实施例一。
C)1，3，7，9-四甲基尿酸的制备方法同实施例一，得产品1，3，7，9-四甲基尿酸472mg，收率1.56％(占干重)。
D)结构鉴定和含量测定同实施例一。
实施例四采用中山大学茶园中移栽的天然植物苦茶(Camellia assamica var.kucha)芽和嫩叶200g为原料，A)苦茶提取液的制备将新鲜采摘的苦茶的芽叶于笼屉上水蒸气加热迅速杀灭酶活性20分钟；取出晾干，于60℃烘箱中过夜烘干，干燥叶片粉碎成苦茶粉末；将苦茶粉末称重，以10倍量的90℃热水浸提45分钟2次，合并提取液，浓缩为小体积，得苦茶提取液。
B)苦茶总嘌呤生物碱的制备在浓缩提取液加入醋酸铅溶液至沉淀不再产生为止，过滤，滤液以等体积氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，减压蒸干后得苦茶总嘌呤生物碱。醋酸铅溶液是酚类物质的沉淀剂。
C)1，3，7，9-四甲基尿酸的制备方法同实施例一，得产品1，3，7，9-四甲基尿酸698mg，得率1.40％(占干重)。
D)结构鉴定和含量测定同实施例一。
实施例五采用中山大学茶园中移栽的天然植物苦茶(Camellia assamica var.kucha)芽与嫩叶160g为原料A)苦茶提取液的制备将新鲜采摘的苦茶种芽与嫩叶笼屉上水蒸气加热迅速杀灭酶活性20分钟；取出晾干，于60℃烘箱中过夜烘干，干燥叶片粉碎成苦茶粉末；将苦茶粉末称重，以50倍量的水90℃浸提30分钟，过滤，将滤渣再以50倍量的水90℃浸提30分钟，过滤，合并两次滤液，减压浓缩成小体积，得苦茶提取液。
B)苦茶总嘌呤生物碱的制备提取液浓缩后，以聚酰胺填料装填开放玻璃柱管，进行开放柱层析，苦茶提取液直接上样，水洗20个柱体积，减压蒸干水洗部分，得苦茶总嘌呤生物碱。
C)1，3，7，9-四甲基尿酸的制备方法同实施例一，得产品1，3，7，9-四甲基尿酸578mg，得率1.44％(占干重)。
D)结构鉴定和含量测定同实施例一。
权利要求
1.天然1，3，7，9-四甲基尿酸的生产工艺，其特征在于采用野生或栽培变种苦茶Camellia assamica var.kucha为原料，经过杀青、烘干、粉碎、溶剂提取、氯仿萃取或聚酰胺柱层析、反相色谱分离步骤富集获得1，3，7，9-四甲基尿酸，具体步骤如下A)苦茶提取液的制备将新鲜采摘的苦茶于笼屉上水蒸气加热迅速杀灭酶活性2.5分钟；取出晾干，于60℃烘箱中过夜烘干，干燥后粉碎成苦茶粉末；将苦茶粉末称重，以10～50倍量的水、乙醇或者含水乙醇于80～90℃浸提30～60分钟，过滤，将滤渣再以10～50倍量的水、乙醇或者含水乙醇于80～90℃浸提30～60分钟，过滤，合并两次滤液，减压浓缩成小体积，得苦茶提取液；B)苦茶总嘌呤生物碱的制备将苦茶提取液以等体积氯仿萃取三次，合并氯仿萃取液，减压回收氯仿，得苦茶总嘌呤生物碱部分；或者以聚酰胺填料装填开放玻璃柱管，苦茶提取液直接上样，水洗20个柱体积，减压蒸干水洗部分，得苦茶总嘌呤生物碱；C)1，3，7，9-四甲基尿酸的制备将苦茶总嘌呤生物碱部分溶解于10％甲醇-水溶液，ODS(反相C-18)填料以甲醇溶涨后装填开放玻璃柱，将ODS开放柱中的甲醇替换成10％甲醇-水后，将苦茶总嘌呤生物碱溶液上样，以10％甲醇-水衡比例洗脱。洗脱液以三分之一或二分之一保留体积收集为一个流分，以硅胶薄层层析检查，Rf值可可碱＞1，3，7，9-四甲基尿酸＞咖啡碱，合并相同流分，减压蒸干得四甲基尿酸纯品；D)结构鉴定和含量测定制得的1，3，7，9-四甲基尿酸经熔点、红外光谱或质谱的简单测定与标准品或者文献数据对照即可确证其化学结构，经RP-HPLC鉴定其纯度大于99％。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于采用的原料为苦茶Camellia assamica var.kucha的芽、叶。
3.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于步骤A中，浸提过程中以超声波或微波或加热处理。
4.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于步骤B中，在苦茶提取液中加入酚类物质的沉淀剂后再进行溶剂萃取，得苦茶总嘌呤生物碱部分。
全文摘要
本发明涉及一种天然1，3，7，9－四甲基尿酸的生产工艺。本发明采用野生或栽培变种苦茶Camellia assamica var.kucha为原料，经过杀青、烘干、粉碎、溶剂提取、氯仿萃取或聚酰胺柱层析、反相色谱分离步骤富集获得1，3，7，9－四甲基尿酸。较以往1，3，7，9－四甲基尿酸制备方法比，本发明所述的生产工艺具有以天然植物为来源，成本低廉，原料中1，3，7，9－四甲基尿酸含量较高，工艺流程简单，产品得率高等特点。
文档编号C07D473/10GK1785999SQ20041007723
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者栗原博, 续洁琨, 叶创兴, 姚新生 申请人:暨南大学