专利名称：从的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化学物质的分离方法，特别涉及一种从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法。
背景技术：
同位素标记15N-L-丙氨酸是一种具有特殊用途的氨基酸，应用于医学药理、生化代谢研究及仪器分析等众多领域，远比普通的丙氨酸具有更高的价值。近年来，随着15N-氨基酸国际市场的开拓，15N-L-丙氨酸的市场需求也日益增大。在其研发和生产过程中(包括酶转化法生产和发酵法生产)，一方面，15N-L-丙氨酸一次提取后遗留下大量的数种15N-氨基酸(杂酸)与15N-L-丙氨酸(目的氨基酸)共存的分离母液；另一方面，由于研究条件的改变和生产条件的波动，不可避免地会产生大量的数种15N-氨基酸与15N-L-丙氨酸共存的反应混和液。在这以上两种混和液中，目的氨基酸与杂酸间的含量相差均不大，采用现有方法难于进一步分离。由于15N生产原料及15N-氨基酸均价值不菲，为提高15N利用率，降低15N-氨基酸研发及生产成本，必须对氨基酸混合液中15N-L-丙氨酸进行分离提纯。
目前，国内外一般采用强酸性阳离子交换树脂从反应液中直接提取15N-L-丙氨酸，如Zvi E.Kahana的研究(Analytical Biochemistry 126，389-393，1982)和中国专利申请CN03141991.7的技术方案。但这种方法仅在酶催化15N-L-天冬氨酸反应过程中转化率高的情况下或在15N-L-丙氨酸的一次提取中适用。对于下列情况①转化率低，有较多底物15N-L-天冬氨酸残留的情况；②发酵法生产15N-L-丙氨酸过程中，由于菌种代谢过程的复杂性，有部分其它15N-氨基酸同时积累的情况；③发酵培养基中的有机氮源被利用不完全而分解引人其它普通氨基酸的情况；④15N-L-丙氨酸一次提取后余下含杂酸母液的二次提取的情况。上述情况利用现有方法均不能得到纯的15N-L-丙氨酸以及回收其他15N-氨基酸。而且目前国内外也无有关15N-L-丙氨酸二次提取的报道。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法。该方法可从含有不同的非目的氨基酸的混和液中分离提取15N-L-丙氨酸，同时得到其他15N-氨基酸。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，所述的15N-氨基酸混和液包括酶法生产15N-L-丙氨酸过程中的酶反应液和发酵法生产15N-L-丙氨酸过程中的发酵液，包括以下主要步骤a、菌体及金属离子的去除将15N-氨基酸混和液用草酸处理，将其中的菌体及金属离子沉淀分离去除；b、15N-L-丙氨酸的分离根据15N-氨基酸混和液中的氨基酸种类和含量的不同，分别采用不同的离子交换树脂，对步骤a所得15N-氨基酸混和液进行单步或多步吸附洗脱，分离出15N-L-丙氨酸；c、15N-L-丙氨酸的精制将步骤b所得15N-L-丙氨酸溶液去NH4+、脱色、浓缩、结晶、分离、干燥后精制出15N-L-丙氨酸。
所述的步骤b中，对于转化率较低的酶反应液或转化率较高的酶反应液经常规方法一次提取后的母液，其溶液中的15N-L-天冬氨酸含量＞1％，调节pH为9-12，采用碱性阴离子树脂进行吸附，用去离子水或弱酸性溶液洗脱，分部收集15N-L-丙氨酸和15N-L-天冬氨酸，分离出15N-L-丙氨酸。
所述的步骤b中，当酶反应液中含有缬氨酸、赖氨酸中的一种或两种时，或者发酵液中含有15N-L-缬氨酸、15N-L-苯丙氨酸、15N-L-赖氨酸中的一种或多种时，采用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂，通过多步吸附和洗脱，分离出15N-L-丙氨酸。
所述的多步吸附和洗脱包括以下步骤第一步、先将酶反应液或发酵液调节pH为1.0-5.0，采用NH4+-强酸性阳离子交换树脂吸附，其中的赖氨酸或15N-L-赖氨酸被吸附，在流出液中首先得到缬氨酸和15N-L-丙氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-缬氨酸的混和液，接着得到15N-L-苯丙氨酸，最后在弱碱性洗脱液中得到(15N-)L-赖氨酸，分部收集；第二步、将第一步所得15N-L-丙氨酸和缬氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-缬氨酸的混和液调节pH为1.0-5.0，采用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂吸附，用强酸弱碱性盐溶液洗脱，在洗脱液中首先得到15N-L-丙氨酸，其后得到(15N-)L-缬氨酸，分部收集，分离出15N-L-丙氨酸。
所述的分离出的15N-L-丙氨酸再采用酸性阳离子交换树脂吸附，用去离子水洗柱，至流出液中检验不出酸根离子，再用弱碱性溶液洗脱，得到不含酸根离子的纯15N-L-丙氨酸。
步骤c中所述的脱色采用活性炭脱色；浓缩采用加热减压蒸发浓缩，加热温度为40-70℃；结晶在无水乙醇介质中结晶；干燥采用真空加热干燥，加热温度为40-80℃。
所述的弱酸性溶液为0.025-0.5mol/L的盐酸或乙酸。
所述的弱碱性溶液为0.025-0.5mol/L的氨水，所述的强酸弱碱性盐溶液为0.025-0.5mol/L的氯化铵溶液。
本发明的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，有效地解决了酶法和发酵法生产15N-L-丙氨酸过程中因杂酸多导致15N-L-丙氨酸难于分离的问题，提高了15N-L-丙氨酸的产量并增大了15N原料的利用率。实现了从酶反应液及发酵液中分别分离出15N-L-天冬氨酸、15N-L-缬氨酸、15N-L-苯丙氨酸以及15N-L-赖氨酸，而得到15N-L-丙氨酸。
本发明工艺路线简单，操作方便，投入少，提高了15N-L-丙氨酸的生产得率，避免了研发和生产过程中15N-L-丙氨酸及其它15N氨基酸的损失，最大限度地节省了15N原料。产品质量达到药品标准。适合工业应用。
具体实施例方式
实施例1.
原料为酶法生产15N-L-丙氨酸过程中的酶反应液，其主要成分包括15N-L-丙氨酸52g/L、15N-L-天冬氨酸12g/L和少量KH2PO4、MgSO4·7H2O，溶液的pH＝7-9，总体积为50mL。
首先向酶反应液中在不断搅拌的同时加入草酸，一边溶解一边加入，直至混和液的pH值达到3.0，然后置于冷冻离心机在5000rpm下离心30min，除去菌体及金属离子。收集上清液，沉淀用相当于其体积的去离子水洗涤3遍，将洗涤液和上清液合并后备用。
接着将上述混合液用10mol/L的NaOH溶液调节pH＝9.0，以80mL/h的流速通入强碱性阴离子交换树脂201×4柱(717树脂，3.4×64cm)吸附，用去离子水以50mL/h的流速洗柱至流出液清澈无色且pH＝7。再用0.025mol/L的HCl溶液以50mL/h的流速洗脱，在上样吸附流出液与去离子水洗脱液以及HCl洗脱流出液体积为1-1800mL段收集到15N-L-丙氨酸，2700-4200mL段收集到15N-L-天冬氨酸，从而将二者完全分离。得到的15N-L-丙氨酸和15N-L-天冬氨酸分别用6mol/L的HCl调节pH＝2.5，再经一次001×7树脂(732树脂，2.5×55cm)以50mL/h的流速吸附，用去离子水以30mL/h的流速洗柱至流出液加入AgI不出现白色沉淀，流出液清澈无色且pH＝7时，换2mol/L的氨水洗脱，得到不含阴离子的纯15N-L-丙氨酸或15N-L-天冬氨酸。
将15N-L-丙氨酸纯组分合并，先蒸发至固体并用水反复溶解蒸发至冷凝液pH＝7，再加去离子水稀释至1.5％的浓度(重量比)，加热至80℃时加入0.2g的活性炭，并在搅拌下维持80-90℃加热30min后，多次反复抽滤混和液，直至溶液清澈明亮。再将溶液于60℃下减压蒸发浓缩，至蒸发液即将饱和时再分批、少量、多次加入温度为-10℃的无水乙醇，且边加入边搅拌，直至白色15N-L-丙氨酸大量析出且不再增多时为止。将此结晶母液于-20℃下放置过夜，然后抽滤分离出15N-L-丙氨酸结晶，将其于60℃真空干燥箱内放置3h.，得到纯净的白色粉末状15N-L-丙氨酸2.18g，提取收率为83.6％，15N丰度为9.88％，纯度为98.24。15N-L-天冬氨酸也用类似方法精制，得白色粉末状产品0.48g，提取收率为80.0％，15N丰度为10.17％，纯度为98.34％。
实施例2原料同实施例1。
首先将酶反应液按实施例1的步骤除去菌体及金属离子后，用10mol/L的NaOH溶液调节pH＝12.0，以80mL/h的流速通入弱碱性阴离子交换树脂331柱(3.4×64cm)上样吸附，用去离子水以50mL/h的流速洗柱至流出液清澈无色且pH＝7。再用0.05mol/L的HCl溶液以50mL/h的流速洗脱，在上样吸附的流出液与去离子水洗脱液中即得到15N-L-丙氨酸，在HCl洗脱液体积为2500-6100mL段收集到15N-L-天冬氨酸，从而将二者完全分离。其后，用与实施例1相同的方法除去阴离子后精制。得到15N-L-丙氨酸产品2.25g，收率为86.4％，15N丰度为98.31％，纯度为98.26％；15N-L-天冬氨酸产品0.52g，收率为86.7％，15N丰度为98.8％，纯度为98.33％。
实施例3.
原料为酶法生产15N-L-丙氨酸过程中的酶反应液，其主要成分包括15N-L-丙氨酸55g/L、缬氨酸3.4g/L、赖氨酸2.8g/L、15N-L-天冬氨酸4.3g/L和少量KH2PO4、MgSO4·7H2O，总体积为50mL。
将001×7(732)树脂装填于2.5×55cm的玻璃柱中，以每小时50mL的流速通入0.5mol/L的氨水，待流出液pH＝10时结束洗涤，静止4h后，水洗至pH＝7时完成转型，得到NH4+型001×7树脂柱备用。
首先向酶反应液中在不断搅拌的同时加入草酸，一边溶解一边加入，直至溶液的pH达到1.0，然后将其置于冷冻离心机中在5000rpm下离心30min，除去菌体及金属离子。收集上清液，沉淀用相当于其体积的去离子水洗涤3遍，将洗涤液和上清液合并后备用。
然后将上述溶液用6mol/L的HCl调节至pH＝2.5，以22mL/h的流速通过NH4+型001×7树脂柱，收集流出液，对流出液的纸层析测试显示没有赖氨酸斑点，有15N-L-丙氨酸、15N-L-天冬氨酸和缬氨酸斑点。说明赖氨酸被吸附，流出液中含有15N-L-丙氨酸、15N-L-天冬氨酸和缬氨酸。将这三种氨基酸流出液用6mol/L的HCl调节pH＝2.5，经一次001×7树脂(2.5×55cm)以35mL/h的流速吸附，用去离子水以30mL/h的流速洗柱至流出液清澈无色且pH＝7时，采用0.05mol/L氯化铵溶液洗脱。在洗出液体积为1500-2200mL段收集到15N-L-天冬氨酸，8000-8600mL段收集到15N-L-丙氨酸，7500-7900mL段收集到缬氨酸，从而将三者完全分离。其后，将得到的15N-L-丙氨酸用6mol/L的HCl调pH＝2.5，再经一次001×7树脂(2.5×55cm)以50mL/h的流速吸附，用去离子水以35mL/h的流速洗柱至流出液清澈无色且加入AgI没有出现白色沉淀时，换2mol/L氨水洗脱，得到15N-L-丙氨酸纯组分。用与实施例1相同的方法精制后得到15N-L-丙氨酸产品2.12g，提取收率为77.2％，丰度为98.31％，纯度为98.29％。对15N-L-天冬氨酸纯组分用同处理15N-L-丙氨酸相同的方法去氯离子、精制，得到15N-L-天冬氨酸产品0.68g，提取收率为78.8％，丰度为98.8％。
实施例4原料为发酵法生产15N-L-丙氨酸过程中的发酵液，主要成分包括15N-L-丙氨酸16.6g/L、15N-L-缬氨酸2.2g/L、15N-L-苯丙氨酸0.91g/L、15N-L-赖氨酸0.46g/L、葡萄糖和少量无机盐，总体积为400mL。
将001×7(732)树脂装填于4.4×84cm的玻璃柱中，以每小时100mL的流速通入3mol/L的氨水，待流出液pH＝10时结束洗涤，静止4h后，水洗至pH＝7时转型为NH4+型001×7树脂柱备用。
将上述发酵液在玻棒搅拌的同时加入草酸，一边溶解一边加入，直至混和液pH达到4.0，然后置于冷冻离心机中在5000rpm下离心30min，收集上清液，沉淀用1倍体积的去离子水洗涤3遍，将洗涤液和上清液合并后备用。
将上述混合液以类似实施例3的方式用6mol/L的HCl调节pH＝2.5，以120mL/h的流速通过NH4+型001×7树脂柱，15N-L-赖氨酸被吸附，流出液中在220-2500mL段为15N-L-丙氨酸和15N-L-缬氨酸的混合液，在2700-3300mL段为纯15N-L-苯丙氨酸溶液。将NH4+型001×7树脂柱再用1.0mol/L氨水洗脱，洗脱液为纯15N-L-赖氨酸溶液。其后，以类似实施例3的方式，分离15N-L-丙氨酸与15N-L-缬氨酸的混和液，用6mol/L的HCl调pH＝2.5，经一次001×7树脂(3.4×64cm)以70mL/h的流速吸附，在洗脱液体积为4000-7200mL段得到15N-L-丙氨酸，7200-8100mL段得到15N-L-缬氨酸，从而将两者完全分离。15N-L-丙氨酸用与实施例1相同的方法精制后得到产品4.88g，提取收率为73.5％，15N丰度为98.22％，纯度为98.27％。15N-L-缬氨酸、15N-L-苯丙氨酸、15N-L-赖氨酸溶液分别用与实施例3相同的方法去氯离子、精制，结果表1所示。
表1
实施例5原料为酶法生产15N-L-丙氨酸过程中的酶反应液(转化率99.60％)一次提取后的母液，主要成分包括15N-L-丙氨酸5.1g/L、l5N-L-天冬氨酸6.5g/L，总体积为200mL(为先后四次一次提取后母液的合并液)。将上述母液用10mol/L NaOH溶液调节pH＝10.0，以30mL/h的流速通入弱碱性阴离子交换树脂331柱(2.5×55cm)上样吸附，用去离子水以30mL/h的流速洗柱至流出液清澈无色且pH＝7。再用0.05mol/L的HCl溶液以30mL/h的流速洗脱，在上样吸附的流出液与去离子水洗脱液中即得到15N-L-丙氨酸，在HCl洗脱液体积为1700-4500mL段收集到15N-L-天冬氨酸，从而将二者完全分离。其后，用与实施例1相同的方法除去阴离子后精制。得到15N-L-丙氨酸0.84g，提取收率为82.7％，15N丰度为9.88％，纯度为98.21％；得到15N-L-天冬氨酸1.10g，提取收率为84.5％，15N丰度为10.17％，纯度为98.36％。
权利要求
1.一种从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，所述的15N-氨基酸混和液包括酶法生产15N-L-丙氨酸过程中的酶反应液和发酵法生产15N-L-丙氨酸过程中的发酵液，其特征在于包括以下主要步骤a、菌体及金属离子的去除将15N-氨基酸混和液用草酸处理，将其中的菌体及金属离子沉淀分离去除；b、15N-L-丙氨酸的分离根据15N-氨基酸混和液中的氨基酸种类和含量的不同，分别采用不同的离子交换树脂，对步骤a所得15N-氨基酸混和液进行单步或多步吸附洗脱，分离出15N-L-丙氨酸；c、15N-L-丙氨酸的精制将步骤b所得15N-L-丙氨酸溶液去NH4+、脱色、浓缩、结晶、分离、干燥后精制出15N-L-丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于所述的步骤b中，对于转化率较低的酶反应液或转化率较高的酶反应液经常规方法一次提取后的母液，其溶液中的15N-L-天冬氨酸含量＞1％，调节pH为9-12，采用碱性阴离子树脂进行吸附，用去离子水或弱酸性溶液洗脱，分部收集15N-L-丙氨酸和15N-L-天冬氨酸，分离出15N-L-丙氨酸。
3.根据权利要求1所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于所述的步骤b中，当酶反应液中含有缬氨酸、赖氨酸中的一种或两种时，或者发酵液中含有15N-L-缬氨酸、15N-L-苯丙氨酸、15N-L-赖氨酸中的一种或多种时，采用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂，通过多步吸附和洗脱，分离出15N-L-丙氨酸。
4.根据权利要求3所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于所述的多步吸附和洗脱包括以下步骤第一步、先将酶反应液或发酵液调节pH为1.0-5.0，采用NH4+-强酸性阳离子交换树脂吸附，其中的赖氨酸或15N-L-赖氨酸被吸附，在流出液中首先得到缬氨酸和15N-L-丙氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-缬氨酸的混和液，接着得到15N-L-苯丙氨酸，最后在弱碱性洗脱液中得到(15N-)L-赖氨酸，分部收集；第二步、将第一步所得15N-L-丙氨酸和缬氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-缬氨酸的混和液调节pH为1.0-5.0，采用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂吸附，用强酸弱碱性盐溶液洗脱，在洗脱液中首先得到15N-L-丙氨酸，其后得到(15N-)L-缬氨酸，分部收集，分离出15N-L-丙氨酸。
5.根据权利要求2或3或4所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于所述的分离出的15N-L-丙氨酸再采用酸性阳离子交换树脂吸附，用去离子水洗柱，至流出液中检验不出酸根离子，再用弱碱性溶液洗脱，得到不含酸根离子的纯15N-L-丙氨酸。
6.根据权利要求1所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于步骤c中所述的脱色采用活性炭脱色；浓缩采用加热减压蒸发浓缩，加热温度为40-70℃；结晶在无水乙醇介质中结晶；干燥采用真空加热干燥，加热温度为40-80℃。
7.根据权利要求2所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于所述的弱酸性溶液为0.025-0.5mol/L的盐酸或乙酸。
8.根据权利要求4所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于所述的弱碱性溶液为0.025-0.5mol/L的氨水，所述的强酸弱碱性盐溶液为0.025-0.5mol/L的氯化铵溶液。
9.根据权利要求5所述的从15N-氨基酸混合液中分离提纯15N-L-丙氨酸的方法，其特征在于所述的弱碱性溶液为0.025-0.5mol/L的氨水。
全文摘要
本发明提供了一种从
文档编号C07C227/00GK1781902SQ200410089079
公开日2006年6月7日 申请日期2004年12月3日 优先权日2004年12月3日
发明者周震, 侯静华, 李良君, 杜晓宁, 宋明鸣 申请人:上海化工研究院