动物饲料组合物的制作方法

专利名称：动物饲料组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有游离吲哚乙酸(游离IAA)或其衍生物的动物饲料组合物。本发明还涉及通过给动物饲喂本发明的组合物来提高动物生长的方法。本发明还涉及游离IAA或其衍生物在需要促进生长治疗的动物，例如免疫受损的动物、生长不足(growth deficit)的动物或生长缓慢的动物的治疗方法中的用途。本发明还涉及游离IAA或其衍生物在制备用于增加需要此类治疗的动物，特别是免疫受损或生长缓慢的动物的生长率和/或饲料转化率和/或免疫力的治疗组合物中的用途。优选地本发明的组合物可以是食品或饲料补充剂的形式。
背景技术：
面对世界人口迅速增长的一个主要问题是常规食物蛋白的有限供给。包含具有人体所需必需氨基酸的蛋白质的动物生产是特别重要的。由于生产设施有限以及缺乏生产技术的改进，动物蛋白生产的增加似乎无法与世界人口的增加相适应。
因此，看来非常需要提高动物蛋白生产的生产能力。一种提高生产能力的方法是开发促进动物生长的饲料组合物。
已知通过施用某些种类的物质，例如抗生素、表面活性剂和雌激素可以加快动物的生长速率。但是施用这些种类的物质各自有其缺点，这妨碍了它们被普遍接受。因此，据信抗生素和表面活性剂虽然在某些条件下有效，但主要用于抑制疾病而不是引起真正的生长反应。正是由于这个原因，抗生素的此类应用在欧洲受到限制，而在美国和亚洲还尚在争论中。
雌激素作为生长促进剂的应用也存在某些固有的困难和危害。因而，雌激素经常使施用了雌激素的动物质量降低。另一个缺点是某些雌激素物质可能在动物的可食用部分残留，并推测当食用时可能对人体产生不利影响。此外，此类已知物质主要通过注射或植入方法来施用，即昂贵又费时，经常不受用户的喜欢。
发明概述本发明的一个目的是提供动物饲料组合物。本发明的另一个目的是提供能够促进动物生长的饲料组合物。本发明的进一步目的是提供通过给动物饲喂该饲料组合物而促进动物生长的方法。本发明的另一个目的是提供动物饲料组合物的制备方法。当在下文更充分地公开本发明时，本发明的其他目的、特征和优点将会变得明显。
现在已经发现通过将游离吲哚乙酸(游离IAA)或其衍生物与其常规饲料或饮用水组合口服施用于动物能够克服现有技术物质和方法的缺点，并且能够促进非人类动物的生长。
发明详述游离IAA及其衍生物是已知化合物。游离IAA是一种已被广泛研究的天然存在的植物生长植物激素。在植物中，大多数IAA以缀合的形式存在(Slovin等.1999，Biochemistry and molecular biology ofplant hormones，Elsevier，Amsterdam.第115-140页)，或者是通过酯键与糖缀合或者是通过酰胺键与氨基酸和肽缀合。
此处使用的术语“游离IAA”指游离IAA是游离或酸的形式，而术语“缀合IAA”指的是通过酯键或酰胺键结合的IAA。
早在1956年就研究了游离IAA对人体的影响，证明了0.1g/kg的单次剂量是无毒的(Mirsky A and Diengott D，Hypoglycemicaction of indole-3-acetic acid by mouth in patients withdiabetes mellitus，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.93109-110，1956)。在1964年，发现游离IAA的光氧化产物可作为微生物生长抑制剂(Still C，Fukuyama T and Moyed H，InhibitoryOxidation Products of Indole-3-acetic acid，J.BiologicalChemistry，240，6，2612-2618，1964)。
游离IAA及其某些衍生物在医学上的应用在以前也有记载。EP1.296.676描述了游离IAA作为药物，特别是用于治疗人类肿瘤疾病的药物用途。WO02/080906描述了游离IAA治疗女性子宫内膜异位的用途。Nachson等(Food and Chemical Toxocology 41，745-752)报道了某些游离IAA衍生物(吲哚-3-甲醇和3，3′-二吲哚基甲烷)对在人前列腺癌细胞系中增殖和诱导编程性细胞死亡的影响。而Rossiter等(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，12，2523-2526)和Folkes等(Biochemical Pharmacology 63，265-272)都描述了游离IAA和某些衍生物在酶-前药介导的癌症治疗中的应用。
现在出乎意料地发现游离IAA或其衍生物在非人动物，特别是家畜，例如鱼、家禽、牛和猪或玩赏动物，例如马、猫、狗、兔和鱼中产生显著的促生长反应。因此本发明提供了一种通过给动物施用游离IAA，优选通过饲料施用IAA的饲养非人动物的方法。
可以给动物饲喂游离IAA或其衍生物，当在动物饲料和/或水中在清楚规定的浓度内施用时最为有效。注射和/或植入是不必要的，动物可自由选择与它们的饲料一起口服摄取游离IAA或其衍生物。
根据本发明的一个具体实施方式
，提供了促进动物生长的含有游离IAA或其衍生物的动物饲料组合物。这种动物饲料组合物可以是添加有游离IAA或其衍生物的常规饲料组合物，游离IAA或其衍生物的浓度足够保证每天每公斤活体重25至1000微克(μg/kg LW/天)游离IAA或其衍生物的日摄入量。因而这种饲料组合物每公斤饲料可以含有0.2mg至10g的游离IAA或其衍生物。
当直接给动物饲喂每公斤饲料含有0.24mg以上游离IAA或其衍生物的饲料组合物，例如每公斤饲料含有0.30mg以上游离IAA或其衍生物的饲料组合物，或每公斤饲料含有0.40mg以上游离IAA或其衍生物的饲料组合物，例如每公斤饲料含有0.6、0.8、1、5、10、20、30、50、100、200或500mg游离IAA或其衍生物的饲料组合物时，可获得特别有益的结果。
因此，本发明涉及每公斤含有240微克以上游离IAA或其衍生物的动物饲料组合物。
游离IAA或其衍生物浓度的上限在很大程度上由预期的用途来确定。饲料组合物可以是饲料或必须以适宜的比例混入动物饲料中的食品添加剂的形式。在这种情况下，游离IAA或其衍生物的浓度可以高达10％，即100g/kg。饲料组合物还可以为可立即使用的混合物的形式。在该情况下，一旦动物的饲料日摄取量是已知的，则上限由动物需要的剂量来确定。在日常实践中，证实了含有1、2或4％(10至40g/kg)游离IAA或其衍生物的饲料组合物以家畜饲料添加剂的形式储存最为实用。因此，优选的被混入可立即使用的饲料或饲料添加剂的饲料组合物的储存形式是约1-4％游离IAA或其衍生物与其他适合摄取的干燥物质的混合物。
因此本发明涉及每公斤含有高至40g游离IAA或其衍生物的饲料组合物。
当用于给可立即使用的饲料组合物中配入正确剂量的游离IAA或其衍生物时，每公斤饲料添加剂含有100mg至1000mg，例如500mg游离IAA或其衍生物的配制品最为实用。
因此，本发明还涉及每公斤含有100至1000mg游离IAA或其衍生物的饲料组合物。
本领域技术人员将会意识到必须调整可立即使用的饲料中的游离IAA的量以便给动物提供有效量的游离IAA。为了调整饲料中游离IAA的浓度以达到一定的游离IAA日摄取量，必须估计一个动物或动物群的饲料摄取量。本领域技术人员知道一个(特定的种或群)动物的饲料摄取量，除了偶然的可高达20％例如小鸡以外，通常每日的饲料摄入量是动物体重的0.5到10％之间。动物通常会摄入为其所摄入饲料的两倍单位体积的水。因此，当给动物饲喂含有10mg游离IAA/kg的饲料组合物时，动物将与通过饮用游离IAA浓度为5mg/l的水或通过饮用浓度为2.5mg/l的水加上摄入比例为5mg/kg的饲料一样摄入相同量的游离IAA。
在这里使用的动物饲料组合物包括固体或液体形式的动物营养组合物。饲料是动物能量和营养的主要来源，通常来自动物或植物。因此饲料可以被定义为具有对动物生长和维持适当的身体状况有充足营养价值的物质。在一个典型的具体实施方式
中，动物饲料组合物由丸、粗粉、颗粒、挤出或膨胀的颗粒、片剂、粉末或团块形式组成。特别有利的饲料组合物包括选自干燥的草料和粗粮、能量饲料、蛋白质饲料、矿物质饲料、维生素饲料、酵母制品、常规预混合饲料、玉米粉、棉籽、小麦麸质、玉米青贮芜菁甘蓝、甜菜废粕、苹果浆、黑麦草、牛毛草、苜蓿饲料浓缩物和饲料补充剂的食物。可将游离IAA或其衍生物与任何适合的基础饲料物质，例如油菜籽、棉籽、大豆、鱼粉、麦麸、小麦饲料粗粉、矿物质、维生素以及粘合剂混合或用例如氨基酸、盐、磷或玉米粉制备成预混合饲料。在一个特别有利的具体实施方式
中，饲料或饲料添加剂是经政府机构例如FDA，美国农业部或加拿大食品检查处批准的形式和/或组成。在欧洲，食品准则委员会(CAC)关于动物饲养的专题研究组以及动物福利法案(AWA)提供了动物饲料的定义。在一个有利的具体实施方式
中，本发明涉及在FFDCA第201(x)部分中的“动物饲料”定义之内的添加有游离IAA的动物饲料。
可方便地将游离IAA或其衍生物直接掺入动物饲料和/或水中。可以使用任何适合将该物质在饲料中分散的方法。加入动物饲料和/或水中的游离IAA或其衍生物的量可在规定的界限内变化以获得最大的益处。
因此，本发明包括制备动物饲料的方法，包括提供动物饲料原料以及将所述饲料原料与有效剂量的游离IAA混合的步骤。
本发明的组合物可以是胶囊形式，但是其它剂型，优选口服剂型，例如片剂、混悬液、乳剂、液体、粉末、糖锭、锭剂、丸剂等也是可以的。该组合物可以采用例如饲料补充剂、饲料添加剂或药物组合物的形式。
根据本发明，还提供了促进非人动物生长和/或提高饲料效能和/或饲料转化率和/或非人动物的免疫力的方法，包括给动物施用本发明的动物饲料组合物。此处包括一种方法，其中给动物施用一种液体例如水，每升液体含有120ug以上游离IAA或其衍生物，例如240、500或1000ug/l以上游离IAA或其衍生物。
本发明添加有游离IAA或其衍生物的饲料和/或水特别适合于家畜，例如鱼、牛、家禽和猪的商业性饲养。它们也可用于玩赏动物，例如兔、马，鸟例如鸽子，鱼例如鲤鱼(koi fish)、猫和狗。通过使用这种补充饮食，不仅能极大促进非人动物的生长，而且能极大增加饲料转换率(即，动物体重增加一公斤所需的饲料公斤数)，产生更大的经济效益。
本发明动物饲料组合物和方法还可适用于存在生长不足的动物。在动物实验中，已经证明当给动物饲喂游离IAA或其衍生物时，生长不足动物的体重增加到正常水平。这些试验证明了本发明的化合物和方法使食欲提高和/或饲料转化提高的事实。
在这方面术语生长不足可以看作是实质上落后于该物种正常生长的生长。这样的动物显示出比该物种内同龄动物正常体重分布中值低10％以上，例如25、40、60或80％以上的活体重。
本发明的动物饲料组合物和方法还可适用于免疫受损的动物。在此将免疫受损动物定义为免疫系统受损或削弱的非人动物。通常这样的动物的特点是其血清中降低的IGF-1水平。在此将降低的IGF-1血清水平定义比该物种健康个体的正常中值低10％以上，例如25％、40％、60％以上，或80％以上的IGF-1水平。削弱的免疫系统经常是由疾病或不利生活条件导致死亡率增加的原因。
本发明还可用于治疗显示出与降低的IGF-1血清水平相关的多种其他适应症的动物。因此本发明的一个进一步的目的是提供增加患有与降低的IGF-1血清水平相关病症的非人动物中IGF-1血清水平的方法。
根据本发明，通过给需要此类治疗的非人动物施用游离IAA或其衍生物实现该目的。所以，本发明因此涉及游离IAA及其衍生物在制备用于增加免疫受损动物和/或生长不足动物的生长率和/或免疫力的治疗组合物中的用途。这可以使动物体重增加和/或使由疾病或不利生活条件导致的死亡率降低。
已经发现对于在此作为例证的多种适应症，存在游离IAA或其衍生物的最佳施用量。通常，为了进一步提高健康正常生长动物的生长率，游离IAA的日摄取量在25至1000，更特别地在50至500ug/kg LW/天之间是足够的。当施用150-500ug游离IAA/kg LW/天时可获得特别有益的结果。在下文作为例证，当平均施用218ug游离IAA/kg LW/天时，非洲鲶鱼表现出显著提高了7％的饲料转换率。当以400ug游离IAA/kg LW/天的剂量饲喂时，健康家禽在5周内体重多增加18％。在牛和猪农场中获得相似的结果。
为了提高表现出生长不足动物(特别是家畜或玩赏动物)的生长率，经常需要稍高的剂量。在短期内例如在少于6周、4周，但更特别地是在少于3周，例如2周内，使用50-1000ug游离IAA/kgLW/天，特别是250-1000ug游离IAA/kg LW/天，更特别是400-1000ug游离IAA/kg LW/天例如500或750-1000ug游离IAA/kg LW/天的剂量可获得特别有益的结果。
可根据经验和在某种程度上根据饲料的特定类型，物种以及饲养条件在本发明规定的界限内确定游离IAA或其衍生物的最佳剂量。本领域技术人员知道如何建立这样的剂量试验的方案，在实施例7中的试验设计可能会有帮助。
因此，本发明的关键化合物是游离吲哚乙酸。然而，使用游离IAA衍生物也可达到相当的结果。在此将游离IAA衍生物定义为与在施用该化合物之前同一动物体内游离IAA水平相比，使非人动物体内游离IAA水平增加的化合物。这些衍生物可以分成不同种类。
游离IAA的一类衍生物是缀合IAA。缀合IAA可以以通过酯键缀合的IAA形式出现，例如与糖缀合，例如IAA-葡萄糖、IAA-α-天门冬氨酸1N-葡萄糖苷、IAA-肌醇、IAA-肌醇类或与多种其他碳水化合物连接的IAA。IAA也可以通过酰胺键缀合，例如与氨基酸和肽缀合。其例子是乙酰胺、α-亮氨酸、α-丙氨酸、α-天门冬氨酸(植物中最重要的IAA缀合物)、α-谷氨酸、α-赖氨酸、α-甘氨酸、α-缬氨酸、α-苯丙氨酸或与赖氨酸或色氨酸的缓释酰胺缀合物。与肽结合是常见的，然而在不同的植物中也存在与其他氨基酸结合。另外，这类含有易于转化为相应的酸的3-乙腈衍生物，如吲哚-3-乙腈，其可以通过化学作用(在碱性条件下)也可以通过酶作用(通过腈水解酶活性)分解为游离IAA。
为了在本发明中使用，这种缀合IAA必须转化成游离IAA。这可以通过同时给动物输入酶例如酯酶、酰胺酶或腈水解酶来实现。这可以例如通过将酶与缀合IAA一起混入动物饲料组合物中来实现。
因此，本发明涉及如上所述的动物饲料组合物，其还包含能够将游离IAA衍生物转化为游离IAA的酶。
但是，通过依靠在动物循环或胃肠道中天然存在的使缀合IAA转化为游离IAA的酶的活性，也可将缀合IAA照原样加入饲料中和/或对动物施用。
通过酰胺酶(氨基水解酶)使游离IAA从酰胺中释放出来。可以通过葡萄糖苷酶使游离IAA从葡萄糖苷中释放出来。在植物中，可能存在相当数量的缀合IAA，可以通过酶水解(例如葡萄糖苷酶或酰胺酶)也可以通过化学水解使其释放出来。在植物中的全部IAA集合(pool)中，酰胺连接的IAA通常占90％，而酯连接的IAA为约10％，以及游离IAA少于1％。在植物中，例如9天大的Arabidopsis中发现游离+结合游离IAA的水平可高达约1.2ug/g干重。在植物生命周期的后期这些水平会下降。游离IAA的最大值为约1％。
在植物中还可发现多种羟基化的、磷酸化的、甲氧基化的、N-氧化的以及N-甲基化的吲哚衍生物。这些化合物也能够在胃、肠、肝或体内其他地方转化为游离IAA。这种转化可以是酶作用或化学作用的。因此本发明还涉及这些通过代谢能够直接或间接转化成游离IAA的化合物。这些所谓前体例如为4-羟基-IAA、4-甲氧基-IAA、5-羟基-IAA、5-甲氧基-IAA、6-羟基-IAA、6-甲氧基-IAA、7-羟基-IAA、7-甲氧基-IAA。
此外，术语衍生物还可以包括具有其他取代基的IAA，化合物可以是天然存在或合成的。术语“天然存在”还包括通过活细胞，例如植物、微生物、哺乳动物细胞以及人或动物体新陈代谢的结果。在自然界特别是在海洋生物中可找到卤代吲哚生物碱(即6-溴代靛蓝)。可以通过合成在芳环上的4、5、6和7位引入所有类型的取代基，例如甲基、氨基、硝基、氟、氯、溴和碘。这些化合物都可以用于提高动物游离IAA水平。
术语衍生物还可包括由其形成游离IAA以及如上文所列类似物的前体，例如色氨酸、4-羟基色氨酸、4-甲氧基色氨酸、5-羟基色氨酸、5-甲氧基色氨酸、6-羟基色氨酸、6-甲氧基色氨酸、7-羟基色氨酸、7-甲氧基色氨酸、刺桐碱、色胺、4-羟基色胺、4-甲氧基色胺、裸头草辛(4-羟基，二甲基色胺)、西洛西宾(4-磷酸酯，二甲色胺)、baeocystin、血清素(5-羟色胺)、5-甲氧色胺、蟾蜍特宁(二甲基5-羟色胺)、O-甲基蟾蜍特宁、褪黑激素(5-甲氧基，在色胺NH2上乙酰胺官能团)、6-羟基色胺、6-甲氧基色胺、7-羟基色胺、7-甲氧基色胺。其他天然存在的形成游离IAA的前体是吲哚丁酸和吲哚-3-丙酮酸。
术语衍生物还包括是可转化回游离IAA的游离IAA类似物或代谢产物的化合物。这些化合物还包括上文提及的4-、5-、6-和7-羟基以及甲氧基-衍生物。这些化合物例如是吲哚、吲哚-3-乙醛、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-醛、吲哚-3-甲醇、吲哚-3-羧酸、3-甲基吲哚(类臭素)、吲哚-3-乙醛肟、3-氨甲基吲哚、N-甲基氨甲基吲哚、芦竹碱(N-二甲基氨甲基吲哚)。
术语衍生物还可包括具有变化的吲哚生色团的化合物，例如吲哚酚类(吲哚甙类)、indoleninones、3-亚甲基-2-羟基吲哚、相思子碱、isotan B、靛红、吲哚甙、靛青、indurubin、靛蓝、3-吲哚甲基(类臭素基(skatolyl))、烟酸和2-羟吲哚-3-乙酸。
术语衍生物还可包括通常在植物或蔬菜组织中发现的化合物，例如3-亚甲基-2-羟基吲哚、羟基吲哚-3-甲醇、羟基吲哚-3-醛、羟基吲哚-3-羧酸以及3-甲基羟基吲哚。
此外，本发明还涉及其他天然IAA衍生物的缀合物(酯类和酰胺类)的用途，所述衍生物为例如2-羟基吲哚衍生物和4-、5-、6-或7-羟基衍生物二羟基吲哚-3-乙酸、3-O-β-葡萄糖基-二羟基吲哚-3-乙酸、7-羟基-2-羟基吲哚-3-乙酸-7′-O-β-d-吡喃葡萄糖苷、吡喃葡萄糖基-β-1，4-吡喃葡萄糖基-β-1-N-羟基吲哚-3-乙酰基-N-天门冬氨酸、吡喃葡萄糖基-β-1-N-羟基吲哚-3-乙酰基-N-天门冬氨酸、2-吲哚酮-3-乙酰基天门冬氨酸、3-(O-β-葡萄糖基)-2-吲哚酮-3-乙酰基天门冬氨酸、3-羟基-2-吲哚酮-3-乙酰基天门冬氨酸、吲哚-3-磷酸甘油(在碱性条件下分解为游离IAA)、吲哚-3-甘油(在碱性条件下分解为游离IAA)、硫代葡萄糖酸酯类，例如吲哚-3-基甲基硫代葡萄糖酸酯(芸苔葡糖硫苷)、4-羟基吲哚-3-基甲基硫代葡萄糖酸酯(4-羟基芸苔葡糖硫苷)、1-乙酰基-吲哚-3-基甲基硫代葡萄糖酸酯(1-乙酰基-芸苔葡糖硫苷)、1-甲氧基吲哚-3-基甲基硫代葡萄糖酸酯(新芸苔葡糖硫苷)、4-甲氧基吲哚-3-基甲基硫代葡萄糖酸酯(4-甲氧基芸苔葡糖硫苷)、1-磺基-吲哚-3-基甲基(芸苔葡糖硫苷-1-硫酸酯)，其通过黑芥子酶(葡糖硫苷酶)转化成吲哚衍生物。
通常，游离IAA衍生物优选是能够通过化学合成或酶转化一步合成游离IAA的分子。此类衍生物的实例是可以通过IAAld氧化酶(AA01)的作用转化成游离IAA的吲哚-3-乙醛(IAAld)或通过腈水解酶NIT1、NIT2或NIT3的作用转化成游离IAA的吲哚-3-乙腈(IAN)(Bartel等，J.Plant growth Regul(2001)20；198-216)。可选地，游离IAA的衍生物可以是能够两步合成游离IAA的分子。此类衍生物的实例是涉及已知为myrosidase的酶作用的吲哚硫代葡萄糖酸酯、吲哚-3-乙醛肟(IAOx)以及很多其他现在对本领域技术人员来说显然的前体。可选地，游离IAA的衍生物可以是三步或更多步合成游离IAA的分子。
因此，本发明涉及含有游离IAA衍生物的动物饲料组合物，其中衍生物能够经3步以上，优选经3步，更优选经2步，最优选经1步转化成游离IAA。
现在对于本领域技术人员来说，调整动物饲料中游离IAA衍生物的剂量以使动物体中游离IAA浓度符合本文给出的游离IAA的范围是显然的。这必须考虑当通过化学方式制备时通常不完全的转化和在生产期间的损失。因此，最好是根据经验确定衍生物的浓度，如实施例7所概述的试验计划在这方面可能有所帮助。因此当此处提及游离IAA或其衍生物的某一浓度时，指的是动物体中游离IAA的浓度或获得该特定游离IAA浓度的衍生物的浓度。本领域技术人员将会意识这一点并且知道在此处所提供的教导的帮助下如何确定衍生物的适当浓度。
作为商业产品，游离IAA可以容易得到。可以通过化学合成游离IAA或用生物学方法制备游离IAA。产生IAA的微生物在自然界是广泛存在的。已知酵母、真菌以及很多细菌和植物能将IAA前体转化成游离IAA。除了通过细菌转化L-色氨酸外，也广泛记载了向游离IAA转化的不依赖于L-色氨酸的生化途径(J.Plant Growth Regul(2001)20198-216)。
公知的能够产生游离IAA的细菌是巴西固氮螺菌(AzospirillumBrasilense)(AB)。在常规发酵过程的生长期的最后，AB能够将L-色氨酸转化为游离IAA。为了提高该转化效率，可向培养基中加入少量合成的游离IAA。通过反馈机制，AB增加了L-色氨酸向游离IAA的转化。
很容易制得1克游离IAA/升肉汤培养基的最终浓度，但是即使是更高的浓度也是可能的，这取决于所使用的微生物。
在发酵结束后，可将微生物溶解，通过喷雾干燥或任何其他干燥肉汤培养基的适宜方法可以获得富含游离IAA的粉末。可以使用其他技术部分或完全除去液体。
实施例实施例1游离IAA的来源游离IAA或其衍生物可以从任何商业来源获得。可选地，可以通过微生物途径生产游离IAA。
为此，按照在培养管中的琼脂培养获得巴西固氮螺菌Sp7(ATCC)。在28℃175rpm下将LB培养基用于培育菌株过夜。向培养物中加入甘油直到10％，混合，分到Nalgene冷冻小瓶中，在-80℃冷冻。在-80℃将原种储存在冷冻小瓶中。
为制备巴西固氮螺菌(A.brasilence)的种子培养物，将一份原种(1.2到1.8ml)解冻，加到1升LB培养基中，在28℃和175rpm下培育约20小时至光密度(OD620nm)为约2.5。
用水将10升的发酵罐漂净，校准pH电极。制备9升LB培养基，加入1g/l L-色氨酸以及0.1g/l游离IAA。培养基与2ml消泡剂一起放入发酵罐中。发酵罐在121℃灭菌30min。冷却至28℃后，分别用N2和O2，0和100％饱和度的空气校准O2探针。
将种子培养物通过分别在高压灭菌器中灭菌的烧瓶和导管转移到发酵罐中。当加入完成后，移走导管和烧瓶，按下列参数开始进行发酵搅拌速度400rpm温度28℃通气0.75Nl/minPH715分钟后，取出样品测量OD620nm并检查pH值。按一定时间间隔取出样品以对巴西固氮螺菌的生长进行定量。当生长率下降时，加入额外的培养基以保证形成足够的生产游离IAA的生物量。当活跃生长期结束时，发现开始产生游离IAA，并持续很久的时间。通过LC-MS观察游离IAA的浓度的进程。当游离IAA的浓度为约1g/l的水平时，终止发酵，收集细胞并以约1400bar使用nonojet匀浆器使细胞溶解。将剩余的上清液和溶解的细胞灭菌，喷雾干燥得到要求的产品剂型。
实施例2用游离IAA能够提高生长不足小猪的生长率试验是在管理良好具有1000只Dutch Land种母猪的农场进行。尽管该农场运行良好，但其技术性能不是最理想的。小猪的死亡率和生长率是潜在问题。有太多生长不足的小猪，没有确定的根本的技术或兽医学原因。在农场没有观察到确定的病理学原因。
在试验第1天随机选择3组小猪。第一组(对照)由正常的生长良好的小猪组成。B组由78只生长不足的小猪组成，这些小猪用游离IAA治疗。X组由52只没有进行治疗的生长不足的小猪组成。
由试验的第5天开始B组在饲料中获得游离IAA。通过首先将游离IAA与葡萄糖混合，然后再与饲料混合来制备B组用的饲料。为此，4g纯游离IAA(Aldrich)与96g葡萄糖混合，然后将混合物分散在饲料中。B组猪接受的剂量为500ug游离IAA/kg LW/天(LW＝活体重)，相当于12.5mg/kg LW/天的4％游离IAA/葡萄糖混合物的量。
小猪在试验开始时断奶两天。在试验第5天和试验结束时从各组采集用于IGF-1测量的血样。在试验第5天和结束时将B和X组中两栏(13只小猪)的小猪称体重。使用免疫放射测定法(IRMA)(DSL-5600 ACTIVETM，DSL，Germany GmbH，Germany)对IGF-1进行定量。测定内-和测定间分析差异是GH为4.0％和9.2％；IGF-1为3.0％和1.5％。
治疗一周后，农场主已经注意到了B和X组之间明显的差异。与X相比，B组中的小猪看起来更健康，腹部更饱满，小猪的总的外观开始看上去更好。当治疗继续时该现象变得更明显。B组中生长不足的小猪变少，皮肤和毛发看起来更好。
在试验第1天，3组之间的IGF-1水平(表1)没有差别。IGF-1水平较低，在0.8到13.1之间，平均为4.6。可能由于对断奶的应激，在(生长良好的)对照组和(生长不足的)X和B组之间没有观察到差异。
在试验第26天，再次测量IGF-1水平。B组的水平处于健康对照组的水平(25.3对23.6hmol/l)，明显高于非治疗组X的水平(17.2nmol/l)。
表1
B 3L栏(左)的小猪平均比其相邻的X 4L栏(左)的小猪多长了850克。B3R栏(右)的小猪的平均体重增加与其相邻的X4R栏(右)的小猪一样，但是在开始试验时重量比其少310g。平均起来，治疗组(对于称重的栏而言)在21天的期间内几乎多增加了0.5kg(表2)。
表2
在治疗停止后，与X组相比，B组的小猪继续表现更好。B组的小猪开始看上去比非治疗组更好，并且生长也比非治疗组更好。很明显这些特征与治疗组中较高的IGF-1水平有关。
该试验的结果证实了用500ug游离IAA/kg LW/天单一/次治疗14-21天能有效地恢复生长不足小猪的IGF-1水平，并促进生长到正常的发育良好的小猪水平。作为该治疗的结果，猪赶上了损失的生长，并且在上膘期间生长良好，而不需要继续治疗。
实施例3用游离IAA可以改善健康产卵母鸡的生长在本实施例中用游离IAA处理正常生长的动物。在鸡群中选出10周大的正在生长的产卵母鸡，将其分作有10只母鸡的两组-GB组10只正常生长的母鸡，不治疗-GNA组10只正常生长的母鸡，用游离IAA治疗每天给受治疗的禽类强制饲喂400ug游离IAA/kg LW/天的胶囊，相当于10mg/kg LW/天的由游离IAA在葡萄糖中形成的4％混合物。治疗一直持续到母鸡开始产卵。每周对两组进行称重。
从第一周起，当与非治疗组比较时在治疗组观察到改善了的体重增加。在试验的最先四周体重增加的改善是始终如一的。GNA组先于常规饲养进度约2周。
由于非常热，试验的最后几周对禽类的压力很大，对禽类进行接种以对抗ILT。
表3
在一周以后的体重增加已明确显示游离IAA对正常母鸡生长率具有有益效果。可以得出结论，游离IAA对正常禽类的生长具有有益效果，并且游离IAA能够加速常规饲养进程，在饲养期末生产出强壮得多的禽类。在试验5周后，在其饲料中接受游离IAA的禽类平均比没有接受游离IAA的对照组重18％。
实施例4用游离IAA可改善生长不足产卵母鸡的性能产卵母鸡的生长不足在母鸡饲养中是一个大问题。在本实施例中，用游离IAA治疗生长不足的禽类。在试验农场的鸡群中生长不是均一的，约10-15％的禽类有生长过于不足的表现。
在鸡群中选出10周大的正在生长的产卵母鸡，将其分作有10只母鸡的三组-GB组10只正常生长的母鸡，不治疗-SB组10只生长不足的母鸡，不治疗-SNA组10只生长不足的母鸡，用游离IAA治疗每天给受治疗的禽类强制饲喂400ug游离IAA/kg LW/天的胶囊，相当于10mg/kg LW/天的由游离IAA在葡萄糖中形成的4％混合物。治疗一直持续到母鸡开始产卵。每周对不同组进行称重。
从第一周起，当与非治疗的SB组比较时在治疗的SNA组观察到改善了的体重增加。在试验的最先四周体重增加的改善是始终如一的。SNA组赶上了正常生长的进程并且在某些周胜过GB组中没有治疗的正常生长母鸡。
由于非常热，试验的最后几周对禽类的压力很大，对禽类进行接种以对抗ILT。
表4
在一周以后的体重增加已明确显示游离IAA对生长不足母鸡的生长率具有有益效果。在此试验期间SNA组表现出最高的体重增加。可以得出结论，游离IAA可以适用于治疗生长不足母鸡以便使其赶上它们“损失”的生长。
还可以得出结论似乎游离IAA以400ug游离IAA/kg LW/天的剂量不会导致母鸡对其作用方式产生抗性。
因此本实施例的结果表明使用游离IAA能够使生长不足母鸡恢复到正常饲养进程，防止正常生产的动物损失，并且游离IAA在饲养期末生产出强壮得多的禽类。
实施例5用游离IAA饲喂的猪生殖和呼吸系统综合征病毒的存活者本实验使用具有PRRSV病史的Belgian Land Race小猪来进行。将小猪在4周大时断奶，并重新分配为每栏12头小猪。在5周龄时测量三个不同组的IGF-1水平。
P组这些猪具有严重的问题。它们看起来体质差、体重低、气色不好并且它们中有些被葡萄球菌感染。农场主和兽医坚持认为这些小猪不能活到上膘期结束。从12头小猪中随机采集5头的血液样本。
表5
表5的结果表明低IGF-1水平显示了免疫系统的严重损伤。不良生长和健康与IGF-1浓度之间存在明显的关联。给大约7千克的每个动物用125mg的4％的游离IAA组合物治疗10天，该组合物含有5mg游离IAA和120mg NaCl和WPC 70(乳清蛋白浓缩物)。将该产品在液体饲料中混合，在槽中饲喂。所有小猪从同一个槽进食。该剂量相当于用715ug游离IAA/kg LW/天进行治疗。
在治疗10天以后，全部12头小猪仍然存活，并且它们的状况有了显著改善。它们都有漂亮的粉红色、不再有硬毛、耳朵在正常位置，没有小猪再受到葡萄球菌感染。它们的体重和肌肉生长增加很多，并且完全追上其他“正常”同窝出生小猪的平均数。良好健康的所有外部体征现在都出现了。
10天后，从随机选取的5只小猪中采集血液样本，测定其IGF-1浓度。添加代码表示动物的大小(K＝小的；N＝正常；Z＝重的)。
表6
小猪健康、体重和状况的显著改善没有反映在它们的IGF-1水平中。在试验的前10天平均IGF-1水平没有升高。我们设想当时所有额外产生的IGF-1仍然用于额外生长的过程。在个体重量和IGF-1水平之间仍有明确的关联。
10天后，停止游离IAA治疗，然后动物继续正常进食。再过3周后再次从该组中随机选取的7只小猪中采集血液样本。
表7
这些结果清楚显示即使停止治疗，小猪的IGF-1产生现在也有相当大的增加。
可以得出结论，用游离IAA进行治疗显著改善了问题小猪的状况。它们的免疫系统清除了葡萄球菌的感染。这种改善没有立即(10天以后)反映在IGF-1血清浓度上，但是在停止治疗后3周，IGF-1水平升高到(几乎)正常水平。
R组这些小猪看起来最好。它们在断奶前接受专门的哺乳期饲料(pre-starter feed)。随机选出5只小猪，并测定了它们的IGF-1水平(表8)。
表8
专门的哺乳期饲料似乎提高了该组的IGF-1水平。从第1天起，给这些小猪饲喂添加有和P组相同剂量游离IAA的常规市售的小猪仔猪饮食(starter diet)。R组生长正常。没有特殊的征候出现。在第10天，从随机选取的6只小猪中采集血液样本。
表9
2周之内R组中的平均IGF-1浓度从9.9nmol/l上升到15.72。
T组这些是具有正常外表的小猪。它们在断奶前接受常规的小猪仔猪饲料。
表10
这些小猪正常生长，但是没有R组好。这也反映在较低的IGF-1水平。
给这些小猪饲喂添加有与P组和R组相同剂量的游离IAA的它们原始的小猪仔猪饲料。T组也正常生长，而没有任何特殊症状。从随机选取的5只小猪中采集血液样本，测定它们的IGF-1水平。
表11
在10天内该组的平均IGF-1浓度从1.6上升到9.36nmol。
实施例6在哺乳期饲料中使用游离IAA的生长不足的小猪一般公认在早期生命中有较低体重的动物在整个生产期间性能都较差。早期生长的差异在很大程度上可以解释为对应激和/或感染压力的个体敏感性的差异。本试验用来研究在其生命早期阶段游离IAA对健康的但生长不足的猪的生长率的影响。
本试验在有1400头母猪的大型商业化的农场进行，从其中选出生长不足的小猪。选择的小猪没有患有任何特殊的疾病，并且经测试农场中的小猪对抗PRRS抗体(对母猪接种以对抗PRRS)呈阴性。在断奶前7天，从有600只21天龄的小猪的组中选出39只小猪。将这些小猪随机分为3组，由3头母猪喂养直至断奶。在母猪分娩期间以500ug游离IAA/kgLW/天的剂量使两组小猪接受在哺乳期饲料中的游离IAA。在断奶后，以同样的剂量给这两组在仔猪饲料中补充游离IAA直到断奶后14天。加入饲料的游离IAA量是基于估计的重量和饲料摄入量。第3组接受同样的饲料，但是没有游离IAA。
在断奶时以及14天以后对动物进行称重并且监视死亡率。在表12中给出了三组体重的发育。
表12小猪的体重和生长
用游离IAA治疗的组比对照组表现更好，第2组和第3组体重增加都比对照组多。明显地游离IAA改善了生长不良小猪的性能。在对照组中，有2只动物死亡，相反在游离IAA治疗组则没有死亡。
由于性能不良以及预期的高药物成本，生长不足的小猪(矮小动物)经常从生产中剔除。用游离IAA治疗有助于挽救这些动物，降低其药物成本和改善农场的生产性能以及经济情况。
实施例7不同浓度游离IAA对非洲鲶鱼的影响。
在本试验中使用了360条的非洲鲶鱼(Clarias gariepinus)，每条大约为30g。在到达以后一周，将鱼随机分在12个相同的水族箱中，每个水族箱中30条鱼。水温设定为25℃，照明时间表是12小时明亮接着12小时黑暗。水循环为每个水族箱每小时2升，每个水族箱中水的体积与生物量适合。为了使其习惯于饲料，在实验开始前两周内给鱼饲喂基础饲料。
形成四组，每组由分在3个水族箱的90条鱼组成。一组不接受治疗，作为对照。其它三组接受如表13中所示的三种不同剂量的游离IAA治疗。通过将游离IAA以表13所示浓度和基础饲料混合来制备饲料。每天给予鱼固定量的饲料，相当于生物量的2.5％。
表13
试验周期持续5周，每周对鱼进行称重。在下面的表14中给出了整个试验周期的平均增长。
表14
结果显示以同样的饲料摄入量第4组(剂量为218ug游离IAA/kgLW/天)产生了明确和显著的改善，超过对照组7.1％。因为所有鱼完全接受相同量的饲料，这表示饲料转换率改善的水平也相同。对于鱼业而言这是一个显著的增加，反映了游离IAA刺激健康鱼类生长的潜能。与对照组相比，更高的剂量没有表现出任何明确的积极或消极反应。因此可以得出结论这种治疗的最佳剂量有待根据经验确定。
实施例8优选的IAA原料混合物(stock mixture)制备4％游离IAA饲料原料添加剂的原料。为此将游离IAA(Aldrich)与94％的马铃薯蛋白(protamyl)和2％的酵母提取物混合。如下表15所详述将来自该原料的1.25％加入饲料添加剂中。
表15
可将按照表15的饲料添加剂以适宜量加到动物饲料中以确保给动物施用要求剂量。显然饲料中的浓度可以根据动物的饲料日摄入量以及动物体重而变化。为了给10kg的动物提供每公斤活体重500ug游离IAA的日摄入量，可将10g量的表15中的混合物与动物每天摄入的饲料量的饲料混合。
权利要求
1.动物饲料组合物，每公斤含有240微克以上的游离IAA或其衍生物。
2.根据权利要求1的饲料组合物，每公斤含有高至40g的游离IAA或其衍生物。
3.根据权利要求1或2的饲料组合物，每公斤含有100至1000mg的游离IAA或其衍生物。
4.根据权利要求1至3的饲料组合物，还含有能够将衍生物转化为游离IAA的酶。
5.根据权利要求1至4的饲料组合物，其中衍生物选自4-羟基-IAA、4-甲氧基-IAA、5-羟基-IAA、5-甲氧基-IAA、6-羟基-IAA、6-甲氧基-IAA、7-羟基-IAA和7-甲氧基-IAA。
6.根据权利要求5的饲料组合物，其中芳环在4、5、6和7位中的一个或多个位置被甲基、氨基、硝基、氟、氯、溴或碘取代。
7.根据权利要求1至4的饲料组合物，其中衍生物能经3步以上，优选经3步，更优选经2步，最优选经1步转化为游离IAA。
8.根据权利要求1至7的饲料组合物，其为丸、粗粉、颗粒、挤出或膨胀的颗粒、片剂、粉末或团块型的形式。
9.根据权利要求1至8的饲料组合物，其组成经政府机构批准。
10.增加非人动物生长率和/或提高饲料效能和/或饲料转换率和/或免疫力的方法，该方法包括给所述动物施用有效量的根据权利要求1-9的组合物。
11.游离IAA或其衍生物用于制备在需要这种治疗的动物中刺激生长和/或刺激免疫系统的治疗组合物的用途。
12.根据权利要求11的用途，其中游离IAA或其衍生物能够增加胰岛素样生长因子1(IGF-1)的血清水平。
13.根据权利要求11或12的用途，其中动物具有降低的IGF-1水平。
14.根据权利要求11-13的用途，其中动物具有生长不足和/或削弱的免疫系统。
15.动物饲料组合物的制备方法，所述方法包括为获得根据权利要求1-9的动物饲料组合物将根据权利要求1-9的组合物与一种或多种饲料物质或成分混合。
16.动物饲料组合物的制备方法，所述方法包括为获得根据权利要求1-9的动物饲料组合物给动物饲料补充游离IAA或其衍生物的步骤。
17.饲养非人动物的方法，包括a)将有效剂量的游离IAA或其衍生物与适合特定动物物种的饲料混合，b)用该饲料饲喂所述物种。
全文摘要
本发明涉及含有游离吲哚乙酸(游离IAA)或其衍生物的动物饲料组合物。本发明还涉及通过给动物饲喂本发明的组合物来提高动物生长的方法。本发明还涉及游离IAA或其衍生物在需要促进生长治疗的动物，例如免疫受损的动物、生长不足的动物或生长缓慢的动物的治疗方法中的用途。本发明还涉及游离IAA或其衍生物在制备用于增加需要此类治疗的动物，特别是免疫受损或生长缓慢的动物的生长率和/或饲料转化率和/或免疫力的治疗组合物中的用途。优选地本发明的组合物可以是食品或饲料补充剂的形式。
文档编号C07D209/18GK1870992SQ200480031468
公开日2006年11月29日 申请日期2004年9月28日 优先权日2003年10月3日
发明者H·J·M·F·吉尔森, C·雷比尔 申请人:维伊林股份有限公司