用于动物饲料的木聚糖酶的制作方法
【专利说明】用于动物饲料的木聚糖酶
[0001] 本发明是基于申请日为2007年9月27日，申请号为"200780036415. 2"（国际申 请号为PCT/EP2007/060242)，发明名称为"用于动物饲料的木聚糖酶"的专利申请的分案申 请。
[0002] 对序列表的援引
[0003] 本申请包含计算机可读形式的序列表。将该计算机可读形式通过援引并入本申 请。
[0004] 发明背景 发明领域
[0005] 本发明涉及动物饲料领域。
[0006] 谷物颗粒（cereal grains)是动物饲料的重要组分。它们含有能够在饮食中起主 要营养成分作用的植物多糖（例如淀粉）等，还含有若干种非淀粉多糖（NSP)，包括阿拉伯 木聚糖等。主要的农场动物如家禽和猪的消化道中缺少用于消化NSP的相关酶。在动物饲 料中使用木聚糖酶来改善饲料的利用是本领域已知的。
[0007] 本发明涉及与源自类芽孢杆菌属（Paenibacillus)的木聚糖酶（SEQ ID N0:4的 氨基酸1-184)具有至少82. 7%的同一性百分比的木聚糖酶在动物饲料中的用途。
[0008] 相关技术描述
[0009] W0 2006/083240在实施例6中公开了一种称为XylAlA的木聚糖酶在鸡饲 料中的用途。XylAlA的氨基酸序列对应于W0 2006/083240中的SEQ ID N0:2,其与 UNIPR0T:Q6TLP3(作为SEQ ID N0:9包含在本申请序列表中）的成熟部分相同。根据所述 UNIPR0T数据库条目，该序列源自一种从环境样品分离的细菌。SEQ ID N0:9的木聚糖酶与 SEQ ID N0:4的氨基酸1-184的百分比同一性低于82. 7%。
[0010] R0N0ZYME WX木聚糖酶是一种已知的单组分（mono-component)动物饲料木聚 糖酶，其源自细毛嗜热霉（Thermomyces lanuginosus)，商业上可从DSM Nutritional Products, Wurmisweg 576, CH_4303Kaiseraugst，Switzerland 得到。这种木聚糖酶和它在 动物饲料中的用途在W0 96/23062中也有记载。这种木聚糖酶不具有低于24kDa的分子量。
[0011] W0 2005/079585中记载了一种来自伺料类芽抱杆菌（Paenibacillus pabuli)的 木聚糖酶，其具有本申请中SEQ ID NO: 2的氨基酸1-182的氨基酸序列；还记载了其在制备 基于面团的产品的方法中的用途。
[0012] 一种来自类芽孢杆菌属菌种KCTC 8848P的木聚糖酶的氨基酸序列已经提交到了 公共Uniprot数据库，登录号为UNIPR0T:Q9F9B9;本申请序列表中收入该序列作为SEQ ID N0:4〇
[0013] TO 97/13853 公开了（SEQ ID NO:6) -种来自黑曲霉（Aspergillus niger)的木 聚糖酶，其与本申请中SEQ ID N0:6的氨基酸1-188的序列除了 1个氨基酸之外是相同的 (来自黑曲霉的"xylll"）。
[0014] TO 2004/018662 公开了（作为TO 2004/018662 中的 SEQ ID NO:9)另一种来自黑 曲霉的木聚糖酶，其与本申请中的SEQ IDN0:8是相同的（来自黑曲霉的"xyllll"）。
[0015]Chesson 等在 J. Sci. Food Agric. 1997, 75, 289-295 中报道了关于小麦秸杆和小 麦颗粒级分的细胞壁孔隙率（cell wall porosity)及可用表面积（available surface area)的研宄。
[0016] 本发明的一个目的是改善不溶性非淀粉多糖（NSP)如阿拉伯木聚糖的溶解和/或 降解，同时着眼于改善动物饲料的营养价值，例如通过改善饲料转化率（FCR)、生长速率和 /或体重增加。
[0017] 发明概述
[0018] 本发明涉及木聚糖酶在动物饲料中的用途，所述木聚糖酶与SEQ IDN0:4的氨基 酸1-184具有至少82. 7%的同一,性百分比，该同一,性百分比是如下确定的：1)用Needle程 序比对两个氨基酸序列，使用BL0SUM62取代矩阵，缺口形成罚分为10,且缺口延伸罚分为 0. 5 ;2)对比对中精确匹配的数目进行计数；iii)用精确匹配的数目除以所述两个氨基酸 序列中最短者的长度，和iv)将iii)的除法的结果换算成百分比。
[0019] 本发明还涉及这样的木聚糖酶在制备用于动物饲料的组合物中的用途。
[0020] 本发明进一步涉及一种组合物，其包含这样的木聚糖酶，和（a)至少一种脂溶性 维生素；(b)至少一种水溶性维生素；和/或（c)至少一种痕量矿物质。
[0021] 更进一步，本发明涉及一种动物饲料组合物，其具有50_800g/kg的粗蛋白含量， 且包含这样的木聚糖酶；还涉及一种改善动物饲料的营养价值的方法，其中将这样的木聚 糖酶添加于饲料。
[0022] 最后，本发明涉及这样的木聚糖酶用于在胃和肠消化期间溶解和/或降解非淀粉 多糖的用途，以及用于预处理动物饲料或动物饲料组分的用途。
[0023] 发明详述
[0024] 在下文中，表述"本发明的木聚糖酶"是指供根据本发明使用的木聚糖酶，如本申 请所描述的。
[0025] 酶的EC分类-Bernard Henrissat糖苷水解酶家族
[0026] 酶可基于来自NC-IUBMB的酶命名法（Enzyme Nomenclature)手册，1992进行分 类，也参见在因特网上的ENZYME站点：http://www. expasy. ch/enzyme/。ENZYME是与酶命 名有关的信息储存库。其主要是以国际生物化学和分子生物学联合会（IUB-MB)命名委员 会的建议为基础，描述了已提供其EC(酶学委员会）号的每种已表征的酶（Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305)。该 IUB-MB 酶命名法是以它们 的底物特异性以及偶尔以它们的分子机制为基础的；这样的分类并不反映这些酶的结构特 征。
[0027] 几年前，已提出另一种基于氨基酸序列相似性将某些糖苷水解酶，例如内切葡聚 糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、右旋糖酐酶和a -半乳糖苷酶分类为多个家族 的分类法。它们目前分成90个不同的家族：参见CAZy(ModO)因特网站点（Coutinho, P. M.&Henrissat，B. (1999)Carbohydrate-Active Enzymes (碳水化合物-活性酶）服 务器，在11此：111^口：//3；1^11113.〇^8-1]1^.；1^'/~032：7/〇六2￥/；[11(161.111：1111(相应的论文： Coutinho, P. M.&Henrissat, B. (1999)Carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach.在"Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering" 中，H.J. Gilbert, G. Davies, B.Henrissat 和 B.Svensson 编，The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12 ；Coutinho,P. M. &Henrissat, B. (1999)The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach.在"Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation" 中?，K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita 和 T. Kimura 编，Uni Publishers Co.，Tokyo, pp. 15-23)0
[0028] 木聚糖酶
[0029] 为本申请的目的，木聚糖酶的意思是具有木聚糖酶活性的蛋白质或多肽。
[0030] 木聚糖酶活性可以使用任何如下所述的测定法来加以测量：这样的测定法中使用 在木聚糖中包含1，4-0-〇-木糖苷内-键（1，4-匕6七&-〇-叉丫1〇81(1；[0611(10-1；[111^86)的底物。 测定pH和测定温度要根据所述的木聚糖酶来调适。测定pH值的实例为pH 4、5、6、7、8、9、 10 或 11。测定温度的实例为 30、35、37、40、45、50、55、60、65、70 或 80°C。
[0031] 不同类型底物可用于测定木聚糖酶活性，例如Xylazyme交联阿拉伯木聚糖片（来 自MegaZyme)或带偶氮染料的（azo-dyed)阿拉伯木聚糖的不溶性粉末分散体及溶液。
[0032] 对于测定饲料、预混物（premix)及类似样品中的木聚糖酶，在50°C乃至70°C的温 度（其中较高的温度用于热稳定性更高的酶），在通常由磷酸盐缓冲液（〇. lM，pH调节到所 述酶的最适pH)组成的提取介质中提取酶，历时30-60分钟。实施例4中公开了一种优选 的木聚糖酶测定法。
[0033] 所有的测量均根据分光光度测定原理在大约590_600nm进行。将酶或提取的酶 (取其适用者（as applicable))与已知量的底物一起温育，并相对于标准曲线测量颜色释 放（color release)，所述标准曲线是通过将已知量的酶标准品加入不含酶的类似对照饮 食（control diet)而获得的。如果没有可用的对照饲料，则将已知量的酶加入样品中（掺 加（spiking))，并由掺加和未掺加样品之间响应上的差异可以计算出酶的添加量。
[0034] 在一个具体的实施方案中，木聚糖酶是归类为EC 3. 2. 1. 8 (见上文所述的ENZYME 站点）的酶。正式名称是内切_1，4-0-木聚糖酶。系统命名为1，4-0-D-木聚糖木聚 糖水解酶。可使用其它的名称，如内切-(l-4)-f3-木聚糖酶；（l-4)-f3-木聚糖4-木聚 糖水解酶；内切-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；0 -1，4-木聚糖酶；内切-1，4-木聚糖酶；内 切-0 -1，4-木聚糖酶；内切-1，4- -D-木聚糖酶；1，4- 0 -木聚糖木聚糖水解酶；0 -木 聚糖酶；0 -1，4-木聚糖木聚糖水解酶；内切-1，4-0 -木聚糖酶；0 -D-木聚糖酶。所催化 的反应是木聚糖中1，4_ 0-D-木糖苷键的内水解。
[0035] 根据上文所称的CAZy(M〇d0)站点，木聚糖酶目前被归类于下列糖苷水解酶家族 之一 ：5、8、10、11、16、43或62。例如，GH家族11糖苷水解酶可如下表征：
[0036] CAZy家族 糖苷水解酶家族11 已知活性: 木聚糖酶（EC3.2.1.8) 机制： 保留性(Retaining) 催化性亲核体/碱：Glu(实验） 催化性质子供体：Glu(实验) 3D结构状态: 可用（参见PDB). 折叠： P-果冻卷型(beta-jellyroll) 族群(clan): GH-C
[0037] 在具体的实施方案中，本发明的木聚糖酶是i)糖苷水解酶（GH)家族5、8、10、11、 16、43或62的木聚糖酶，优选GH家族10或11，更优选GH家族11的木聚糖酶。表述"糖苷 水解酶家族NN的..."意思是所述木聚糖酶归类于，或者可以归类于GH家族"NN"（例如 10 或 11) 〇
[0038] 在另一个具体的实施方案中，本发明的木聚糖酶源自细菌木聚糖酶，优选来自（i) 厚壁菌门（Firm