中，本发明的木聚糖酶的指明的分子量包括糖基化 (glysosylation)，如果有的话。或者，本发明的木聚糖酶的分子量不包括糖基化。
[0136] 分子量可通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）来测定，这种本 领域公知的一种测定蛋白质分子量（MW)的有用方法。
[0137] 在实施例3中可找到一种通过SDS-PAGE测定分子量的合适规程。在供选择的实 施方案中，进行实施例3的实验：（i)用10% Bis-Tris凝胶和MOPS运行缓冲液；（ii)使用 BenchMark Ladder (目录号 10747-012)，其商业上可从 Invitrogen/Novex 得到且包含 20、 25和30kDa的蛋白质；和/或（iii)使用Tricine和Tris-甘氨酸凝胶，它们商业上也可 从Invitrogen/Novex得到。实施例3是对一种发酵上清液的SDS-PAGE，关于哪条带代表木 聚糖酶是没有疑问的（只有一个具有期望大小的主带）。但是如果有疑问的话，木聚糖酶可 能需要纯化到更高的程度，如果有抗体的话，可以进行Western印迹，或者可以将关注的条 带切下进行N末端序列测定，这样做可以鉴定该木聚糖酶。
[0138] 作为选择，可以计算一个木聚糖酶分子中所有原子的原子量的总和来作为木聚 糖酶的分子量。为此目的，使用成熟蛋白中氨基酸的平均同位素质量和一个水分子的平 均同位素质量。分子量可以从1997IUPAC标准原子量获得。计算蛋白质分子量的程序 可以例如在下列因特网站点获得：http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html(也参 见 Gasteiger等，JohnM.Walker(编):TheProteomicsProtocolsHandbook,Humana Press(2005)，pp. 571-607) 〇
[0139] 在另一个替代方案中，木聚糖酶的分子量可以使用质谱法（例如Maldi-TOF)来测 定，这也是本领域公知的。
[0140] 糖基化是将糖附接于蛋白质的现象。糖基化仅当在真核生物如真菌和转基因植物 中表达蛋白时才观察到，而在原核生物如细菌中表达时则没有。有多种糖基化类型：针对天 冬酰胺侧链的酰胺氮的N-连接糖基化，和针对丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧的0-连接糖 基化。例如，成熟的糖蛋白可含有多种寡聚甘露糖N-连接寡糖，这些寡糖含有5-9个甘露 糖残基。
[0141] 显然，当基于蛋白质序列计算分子量时，其未反映（account for)翻译后修饰如糖 基化的影响。
[0142] 但是糖基化确实会导致SDS-PAGE凝胶中的蛋白质迀移，而且通过质谱 (Maldi-TOF)也可观察到糖基化。因此，如果想要排除这些方法中糖基化的影响，可以首先 将木聚糖酶去糖基化。去糖基化试剂盒是本领域公知的并可用于此目的，例如，Enzymatic CarboRelease?试剂盒（目录号 KE-DG01，其商业上可从 QA-Bio, LLC, MSutton Place 如81?&1111〇6861%04 92211，旧得到）。该试剂盒包括去除所有^连接寡糖和许多〇-连 接糖所需的试剂、对照和酶。该试剂盒中包含下列去糖基化酶：PNGase F(脑膜脓毒性金黄 杆菌（Chryseobacterium meningosepticum))，〇-糖苷酶（肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae))，唾液酸酶（产脈节杆菌（Arthrobacter ureafaciens))，0 -半乳糖苷酶（肺 炎链球菌），氨基葡萄糖苷酶（肺炎链球菌）。
[0143] 蛋白质的分子量当然取决于其组成氨基酸的数目以及确切的化学组成。作为分子 量的估计，可以选择仅指称氨基酸的数目。这样，本发明的木聚糖酶可不限定其分子量，而 可具有由220个以下的氨基酸残基组成的成熟氨基酸序列。在这个方面的一个具体的实施 方案中，氨基酸的数目为215、210、200个以下；或195个以下；优选为194、193、192、191以 下，或190个以下；还更优选189、188、187、187、186、185、184个以下，或183个以下。
[0144] 在具体的实施方案中，（i)本发明的木聚糖酶用作唯一的木聚糖酶；（ii)该 木聚糖酶不是来自枯草芽孢杆菌的23kDa GHllxynA;(iii)该木聚糖酶不是具有 SWISSPR0T:P18429的序列的木聚糖酶的成熟部分；（iv)该木聚糖酶不是Belfeed B 1100MP 或 ML 产品（商业上可从 BelFeed, Belgium 得到，参见 http://www.agrimex.be)中 所含的木聚糖酶。
[0145] 下面的实施例中进一步描述了本发明，这些不应解释为对本发明范围的限制。 实施例
[0146] 用作缓冲剂或底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
[0147] 实施例1:木聚糖酶体外测试：NSP的溶解
[0148] 本项研宄的目的是考察多种木聚糖酶有关非淀粉多糖（NSP)溶解的效力。
[0149]太聚糖酶
[0150] 测试了下列木聚糖酶：
[0151] R0N0ZYME WX木聚糖酶，一种已知的单组分动物饲料木聚糖酶，源自细毛嗜热霉 (Thermomyces lanuginosus)，商业上可从 DSM Nutritional Products, Wurmisweg 576, CH -43〇3Kaiseraugst, Switzerland 得到（该木聚糖酶在 W0 96/23〇62 中也有记载）；
[0152] -种来自饲料类芽孢杆菌的木聚糖酶，具有SEQ IDN0:2的氨基酸1-182的氨基 酸序列，在W0 2005/079585中有记载；
[0153] 一种来自类芽孢杆菌属菌种（多粘类芽孢杆菌）的木聚糖酶，具有SEQ ID N0:4(UNIPR0T:Q9F9B9)的氨基酸1-184的氨基酸序列；
[0154] -种来自黑曲霉的木聚糖酶（〃xyl 11〃），具有SEQ IDN0:6的氨基酸1-188的氨 基酸序列，（与W097/13853中具有SEQ IDN0:6的木聚糖酶非常相似）；和
[0155] 另一种来自黑曲霉的木聚糖酶（"xyl III")的成熟部分（不包括信号肽和前肽， 如果有的话），其完整氨基酸序列在本申请中是SEQ ID N0:8(与W02004/018662中具有SEQ ID N0:9的木聚糖酶相同）。
[0156] 如本领域中已知的那样将上述两种细菌木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中表达，将两种 曲霉属木聚糖酶在米曲霉（Aspergillus oryzae)中表达。将表达菌株发酵，将含有木聚糖 酶的上清液用于下述的实验，只是对饲料类芽孢杆菌木聚糖酶用标准方法进行了进一步纯 化。根据SDS凝胶估计了木聚糖酶上清液的酶蛋白含量，而经纯化的饲料类芽孢杆菌木聚 糖酶的酶蛋白含量如下文所述测定。
[0157] 本研宄关注的是在模拟单胃消化中的胃和小肠消化步骤的过程中进行体外温育 后不溶性阿拉伯木聚糖含量的定量。在所述体外系统中，将多达60个包含感兴趣底物的试 管与HC1/胃蛋白酶温育（模拟胃消化），然后与胰酶制剂温育（模拟肠消化）。对于所包 括的每个处理使用三个试管。在肠温育阶段结束时，取出体外消化物的样品，并分析不溶性 NSP〇
[0158] 下表中显示了上述体外过程的概要，其中pH和温度表示各个设定点（目标值）。
[0159] 体外消化讨稈概要
[0163] 溶液
[0164] 0. 215M NaOH
[0165] 0.072MHC1
[0166] 0? 072M HC1，含6000U胃蛋白酶/5ml
[0167] 1M NaHC〇3# 16mg胰酶制剂/ml
[0168] lOOmM NaAc-缓冲液，pH 5. 0
[0169] 酶蛋白测丨宙
[0170]木聚糖酶酶蛋白（EP)量根据48(|值和氨基酸序列（氨基酸组成）使用 S.C.Gill&P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326，（1989)概括的原理 来测定。
[0171] 体外樽塑的实骀步驟
[0172] 实验步骤是依照上述概要进行的。在1、2. 5和5. 5小时的时间测量pH。在6小时 后终止温育，移出样品置于冰上，然后离心（l〇〇〇〇x g，10min，4°C)。弃去上清，并将沉淀残 余物用100mM乙酸盐缓冲液（pH 5. 0)洗涤一次。
[0173] 分析
[0174]依照 Theander 等（1995):Total dietary fiber determined as neutral sugar residues, uronic acid residues, and Klason 1 ignin(the Uppsala method) :Collaborative study, J. A0AC Int. vol. 78, no. 4, pp. 1030-1044 进行残余 NSP 的 分析，只是在本实施例中没有分析纤维素。简单地说，利用a-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶通过 酶消化过程来去除样品中的淀粉。然后用80%乙醇沉淀非淀粉多糖，并在125°C下于0. 4M 硫酸中水解非淀粉多糖。利用气相-液相色谱将释放的中性糖作为乙酸糖醇酯（alditol acetates)定量，相对于内标并考虑初始样品重量来计算它们的含量。
[0175] 下面的表1显示与所述各种木聚糖酶体外温育后，饲料中阿拉伯糖、木糖和阿拉 伯木聚糖（阿拉伯糖和木糖的总和）残余物的含量（干物质的％)。对照未添加木聚糖酶。
[0176]表1
[0179] abed: -行中不具有相同字母上标的平均值之间有统计学上显著的差异（means within a row sharing a common letter superscript differ with statistical significance) (P〈0. 05) 〇
[0180] 从表1可见，令人惊讶的是，就对不溶性纤维多糖（NSP)的溶解而言，与1)未添加 木聚糖酶的对照，2)已知的动物饲料木聚糖酶R0N0ZYME WX，以及3)两种黑曲霉木聚糖酶 比较，饲料类芽孢杆菌木聚糖酶和多粘类芽孢杆菌木聚糖酶统计学上显著地更好。
[0181] 实施例2:剂量应答效应
[0182] 在如实施例1所述的体外实验中测试各种剂量的饲料类芽孢杆菌木聚糖酶。
[0183] 下面的表2显示了与不同剂量的这种木聚糖酶体外温育后，饲料中不溶性阿拉 伯糖、木糖和阿拉伯木聚糖（阿拉伯糖和木糖的总和）残余物的含量（％鲜重（fresh weight))。对照未添加木聚糖酶。
[0184]表 2
[0187] abed: -行中不具有相同字母上标的平均值之间有统计学上显著的差异 (P〈0. 05) 〇
[0188] 从表2可见，饲料类芽孢杆菌木聚糖酶对不溶性纤维多糖（NSP)的溶解具有明显 的、统计上显著的剂量-应答效应。
[0189] 实施例3:分子量的测定
[0190] 将表达SEQ ID N0:6之氨基酸1-188的木聚糖酶的转化米曲霉宿主在500ml带挡 板摇瓶中用l〇〇ml YP+2%G培养基（10g酵母提取物，20g胰蛋白胨，加水至1L，121°C高压 灭菌20分钟，加100ml 20%无菌葡萄糖溶液）在30°C、200RPM条件下发酵4天。将发酵液 通过0. 22 ym(微米）过滤元件过滤以提供上清液。
[0191] 将10 y 1 (微升）所述上清液与10 y 1NuPAGE_?LDS样品缓冲液（4X)(可从 Invitrogen，目录号NP0007 获得）、2yl l%EDTA、2yl 6%PMSF、4yl 0.5MDTT和 2yl H20混合，至总体积20 y 1。
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