专利名称：雪卡毒素的人工抗原合成方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种雪卡毒素的人工抗原合成方法。
背景技术：
雪卡毒素(ciguatoxin，CTX)是一种脂溶性的有机化合物，分子内包含13个连续连接的环醚，化学结构式如下 雪卡毒素常存在于珊瑚鱼的鱼肝、鱼肉和鱼头部，是最主要的一种引起人类中毒的珊瑚鱼毒素，毒性极强，对灵长类动物的半致死量为2.0ug/kg。雪卡毒素通过食物链，由小鱼吃海藻，大鱼吃小鱼层层积聚并累积。雪卡毒素不会被高温分解，故烹煮过程并不能除去毒素。毒素进入血液后，需要很长时间才能将毒素排出，患者日后若再次接触到雪卡毒素，就算吃下很少的份量，也会産生中毒症状。中毒症状表现为在进食含雪卡毒素的珊瑚鱼数小时后，会出现肠胃或神经系统不适等现象，主要病征包括呕吐、腹泻、口角及四肢麻痹、冷热感觉颠倒、关节及肌肉疼痛等，病症可维持数天至数星期不等。
现有对雪卡毒素的仪器分析如气相色谱、液相色谱和质谱等方法虽然测定结果准确，但需要贵重仪器，对于样品的前处理操作繁琐，不适应现场简单快速和大批量样品残留检测的要求。国外有采用生物方法测定雪卡毒素含量的方法(United States Patent 6,174,690)，但测试过程时间长，灵敏度低，未广泛使用。另有通过制备雪卡毒素的多克隆和单克隆抗体采用膜免疫方法测定雪卡毒素的专利(United States Patent 6,770,490和United StatesPatent 6,770,490)，但测试过程需要多次温育和洗涤，使用致癌性的邻苯二胺作为显色底物，步骤繁琐，不适于现场测定。目前，国内外对雪卡毒素的测定主要采用美国Oceanit TestSystems，Inc.(www.cigua.com)公司利用美国专利号6,770,490研制的免疫测定试剂盒，国内购买该试剂盒测定一个样品的成本是500元以上。
由于国内尚未见雪卡毒素的测定方法报道，因此，很有必要开展这方面的科学研究，以开发有自主知识产权的雪卡毒素快速检测方法。为了建立雪卡毒素的现场免疫分析方法，首先必须得到抗雪卡毒素抗体。而雪卡毒素分子量小，属于半抗原，不能直接免疫动物制取抗体。必须首先将其与载体蛋白质偶联制备出它的完全抗原，才能诱发动物产生抗体。
为此，通过重铬酸钾氧化后在雪卡毒素分子中产生羧基，然后用碳二亚胺盐酸盐使其与蛋白质上的氨基基团相连，透析后冷冻干燥即得雪卡毒素人工抗原，经凝胶电泳和免疫小鼠证明合成的雪卡毒素人工抗原是成功的，该人工抗原合成方法操作简便，实际可行。
发明内容
本发明是如下实现的该合成方法有以下步骤先用重铬酸氧化雪卡毒素分子中的羟基为羧基，再用碳二亚胺为交联试剂将雪卡毒素分子上的羧基与载体蛋白质上的氨基基团相连，透析后冷冻干燥即得雪卡毒素人工抗原。
上述方法中进行交联反应时，取氧化为羧基后的雪卡毒素溶液4.0mL加入8.0～12.0mL载体蛋白液中，再加入1.0～3.0mL碳二亚胺水溶液，磁力搅拌，15～25℃条件下反应24小时，然后取水层装入分子量1万的透析膜制备的透析袋中，透析袋悬于2000mL烧杯的PBS缓冲液中，4℃条件下每4小时换水1次共换水8次后，将透析袋中的液体冷冻干燥即为合成的雪卡毒素人工抗原。
上述雪卡毒素溶解于二氯甲烷中，浓度为0.01～0.06mg/mL；重铬酸溶于吡啶中，形成重铬酸吡啶盐，浓度为0.20～0.50mg/mL；然后在5.00mL雪卡毒素的二氯甲烷中加入0.20～0.80mL重铬酸吡啶盐，反应1小时。
上述载体蛋白质可以用牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白质(OVA)，分别溶于双蒸水中，浓度为0.50～3.00mg/mL；双功能交联试剂碳二亚胺用双蒸水配成0.10～0.20mg/mL。
具体实施例方式
实施例1取0.10mg雪卡毒素溶于5.00mL二氯甲烷中，然后加入0.60mL浓度为0.40mg/mL重铬酸吡啶盐溶液，反应1小时后，取其中的4.00mL加入到8.0mL浓度为1.00mg/mL载体牛血清蛋白液中，再加入2.0mL浓度为0.10mg/mL的碳二亚胺水溶液，磁力搅拌25℃条件下反应24小时，然后取水层装入分子量1万的透析膜制备的透析袋中，透析袋悬于2000mL烧杯的PBS缓冲液中，4℃低温条件下每4小时换水1次共换水8次后，将透析袋中的液体冷冻干燥即为合成的雪卡毒素人工免疫抗原(简称BSA-CTX)。
实施例2取0.15mg雪卡毒素溶于5.00mL二氯甲烷中，然后加入0.80mL浓度为0.50mg/mL重铬酸吡啶盐溶液，反应1小时后，取其中的4.00mL加入到8.0mL浓度为1.00mg/mL载体卵清蛋白液中，再加入2.0mL浓度为0.10mg/mL的碳二亚胺水溶液，磁力搅拌25℃条件下反应24小时，然后取水层装入分子量1万的透析膜制备的透析袋中，透析袋悬于2000mL烧杯的PBS缓冲液中，4℃低温条件下每4小时换水1次共换水8次后，将透析袋中的液体冷冻干燥即为合成的雪卡毒素包被抗原(简称OVA-CTX)。
人工抗原的鉴定1用凝胶电泳方法测定人工抗原的偶联率，BSA-CTX的偶联率为13，OVA-CTX的人工抗原偶联率为11。
2免疫动物证明产生了抗雪卡毒素的抗体(1)小鼠免疫实验用0.8％的生理盐水将上述合成的BSA-CTX配成0.5mg/mL的溶液，第一次免疫用0.6mL完全弗氏佐剂与上述配好的BSA-CTX等量混合，充分乳化后，每只小鼠(BaLb/c鼠，6周龄)腹腔注射0.2mL，相当于50μg蛋白质，共免疫4只小鼠。每隔2周从第2次免疫和以后换用不完全弗氏佐剂同上法再加强免疫3次。第4次免疫后15天从小鼠尾部取血，制备抗血清。(2)ELISA竞争抑制试验 在酶标条内每孔加入100μL用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的OVA-CTX包被抗原，内含1μg OVA-CTX，37℃恒温孵育1h后，移置4℃冰箱过夜。取出用PBST洗三次(PBSTPBS 20nmoL/L，0.05％Tween-20，pH7.4)，甩干。从中取三条放在酶标板上，在每条的前1-2孔(共6孔)加入50μL二抗稀释液(PBS配制，内含0.1％的明胶)，3-4孔加入用二甲基亚砜和二抗稀释液配制的标准雪卡毒素液50μL，内含0.05μg标样雪卡毒素，5-6孔同3-4孔，内含0.5μg标样雪卡毒素，7-8孔内含5.0μg标样雪卡毒素，9-10孔内含50μg标样雪卡毒素，11-12孔也加入50μL二抗稀释液，然后每条的前10孔均加入用二抗稀释液配制的1∶2000上述抗血清50μL，11-12孔还是加入50μL二抗稀释液，加完后放在37℃恒温水箱孵育充分反应2h，取出，用PBST洗三次，然后每孔加入100μL用二抗稀释液配制的1∶5000的羊抗鼠酶标二抗，37℃恒温水箱孵育1h，取出用PBST洗三次，加入100μL用pH5.0磷酸-柠檬酸配制的邻苯二胺和过氧化氢底物液，37℃恒温水箱密封放置15min后，每孔加入50μL 10％浓硫酸，然后在酶标仪上用492nm波长读取OD值，取6孔平均计算结果如下竞争抑制ELISA实验结果
竞争抑制ELISA实验证明小鼠产生了抗雪卡毒素的特异性抗体，进一步证明人工抗原合成成功。
权利要求
1一种雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于该合成方法有以下步骤先用重铬酸氧化雪卡毒素分子中的羟基为羧基，再用碳二亚胺为交联试剂将雪卡毒素分子上的羧基与载体蛋白质上的氨基基团相连，透析后冷冻干燥即得雪卡毒素人工抗原。
2.根据权利要求1所述的雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于上述方法中进行交联反应时，取氧化为羧基后的雪卡毒素溶液4.0mL加入8.0～12.0mL载体蛋白液中，再加入1.0～3.0mL碳二亚胺水溶液，磁力搅拌，15～25℃条件下反应24小时，然后取水层装入分子量1万的透析膜制备的透析袋中，透析袋悬于2000mL烧杯的PBS缓冲液中，4℃条件下每4小时换水1次共换水8次后，将透析袋中的液体冷冻干燥即为合成的雪卡毒素人工抗原。
3.根据权利要求2所述的雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于上述雪卡毒素溶解于二氯甲烷中，浓度为0.01～0.06mg/mL；重铬酸溶于吡啶中，形成重铬酸吡啶盐，浓度为0.20～0.50mg/mL；然后在5.00mL雪卡毒素的二氯甲烷中加入0.20～0.80mL重铬酸吡啶盐，反应1小时。
4.根据权利要求2所述的雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于上述载体蛋白质可以用牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白质(OVA)，分别溶于双蒸水中，浓度为0.50～3.00mg/mL；双功能交联试剂碳二亚胺用双蒸水配成0.10～0.20mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种雪卡毒素的人工抗原合成方法，该方法以重铬酸氧化雪卡毒素分子中的羟基为羧基，再用碳二亚胺为交联试剂将雪卡毒素分子上的羧基与载体蛋白质上的氨基基团相连，经透析冷冻干燥后即得雪卡毒素人工抗原，该人工抗原合成方法操作简便，实际可行。
文档编号C07D493/00GK1844140SQ20051010190
公开日2006年10月11日 申请日期2005年12月2日 优先权日2005年12月2日
发明者赵肃清, 张焜, 黄宝华, 方岩雄 申请人:广东工业大学