专利名称：二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及肽化合物及其制备方法，尤其是二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物及其制备方法。
背景技术：
近年来国内外生命科学领域中研究的最新热点“细胞调亡”现象，是由20年前美国生物学家克尔道发现的，他认为人体的细胞也橡树叶、花草等其它植物一样，具有新生和调谢的过程。人体细胞凋亡，是人体正常的生理现象。为了保证个体发育成熟，清除一些不需要的细胞，使其自行凋亡或自杀，从而为维护正常生存提供一条有效的途径。如果没有细胞凋亡的过程，人体就难以形成和存活，或出现畸形，或出现疾病。肿瘤的发生和细胞凋亡有关，肿瘤细胞之所以无休止地增殖就是因为细胞凋亡的过程受到了破坏，细胞凋亡的动能停止了。
目前治疗肿瘤的方法主要有采用一些化学制剂、紫外线、γ-射线等诱导肿瘤细胞凋亡。随着凋亡研究的逐步深入，人们发现临床上应用的化疗药物大部分都有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，许多肿瘤内在地抵抗化疗可能与其不能激活凋亡机制有关，人们已经认识到特异性地诱导肿瘤细胞凋亡可能是肿瘤治疗中最具有广阔前景的尝试。
在现有技术中，尚未发现3，4，5-三甲氧基-二异丙氧基磷酰化二肽苯酰胺化合物。专利申请号为03100173.4公开了一种二异丙氧基磷酰化二肽甲酯化合物及其制备方法和以其为活性成分的药物的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有多种抗肿瘤活性基团的3，4，5-三甲氧基-二异丙氧基磷酰化二肽苯酰胺化合物及其制备方法，这类化合物能够被开发用于抗肿瘤活性药物。
本发明所提供的3，4，5-三甲氧基-二异丙氧基磷酰化二肽苯酰胺化合物或其主体异构体的结构式为 其中AA1和AA2为相同或不相同的氨基酸残基。
“主体异构体”是对某个分子所有异构体的通称，它们之间的区别只是它们的原子在空间方向的不同。包括镜像异构体(对映异构体)，几何异构体(顺/反异构体)，以及含有多于1个手性中心时它们互相不关镜像关系的化合物(差向异构体)。
本发明提供的3，4，5-三甲氧基-二异丙氧基磷酰化二肽苯酰胺化合物的制备方法包括(1)二异丙氧基磷酰化二肽甲酯在甲醇存在下与氢氧化钠作用制得并分离纯化出二异丙氧基磷酰化二肽；(2)二异丙氧基磷酰化二肽在缩合剂作用下与3，4，5-三甲氧基苯胺反应制得并分离纯化出二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物。
活性实验证实本发明的3，4，5-三甲氧基-二异丙氧基磷酰化二肽苯酰胺化合物抗肿瘤活性高，具有广泛的药用前景。
具体实施例方式
本发明的3，4，5-三甲氧基-二异丙氧基磷酰化二肽苯酰胺化合物可简写为DIPP-AA1-AA2-R，其中DIPP代表二异丙氧基磷酰基，R代表3，4，5-三甲氧基苯胺基。
AA1和AA2为相同或不相同的氨基酸残基，优选L-氨基酸残基，尤其是缬氨酸残基和苯丙氨酸残基。
以下用实施例来描述本发明，但是实施例不构成对本发明的任何限制。实施例1DIPP-L-VAL-L-Phe-R，化合物的结构式为 该化合物的制备过程包括(1)DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3在甲醇存在下与氢氧化钠作用制得并分离纯化出DIPP-L-VAL-L-Phe；(2)DIPP-L-VAL-L-Phe在缩合剂作用下与3，4，5-三甲氧基苯胺反应制得并分离纯化出DIPP-L-VAL-L-Phe-R。
所使用到的DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3根据中国专利申请03100173.4所公开的方法进行制备。制备过程为酸碱中和法合成二异丙基亚磷酸酯(DIPPH)，再由DIPPH与缬氨酸合成DIPP-L-Val，最后由DIPP-L-Val与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐合成DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3。
第(1)步的具体过程为
将2mmol(0.88g)DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3溶于8ml甲醇中，冰水浴冷却下加入2.5ml(2.5mmol)1N NaOH溶液，室温搅拌反应5小时，旋转蒸发除去甲醇，残余物中加入5ml H2O，冰水浴冷却下，用1N HCl调节pH至3。过滤除去少量不溶物，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用饱和NaCl溶液洗涤3次，无水Na2SO4干燥。过滤，洗涤，合并滤液和洗液，旋蒸除去乙酸乙酯，残余物用乙酸乙酯～石油醚重结晶得到产品。
第(2)步的具体过程为在50ml烧瓶中加入4mmol(0.73g)R、4mmol(0.405g)NMM(N-甲基吗啡啉)和10ml干燥的四氢呋喃，搅拌下加入4.2mmol(1.80g)DIPP-L-VAL-L-Phe和4.2mmol(0.567g)HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)，冰水浴下滴加4.2mmol(0.866g)DCC(二环己基碳化二亚胺)与5ml干燥的四氢呋喃的混合溶液，室温反应过夜后过滤，残余物用四氢呋喃洗涤三次，合并滤液和洗液，旋蒸除去溶剂，残余物加饱和NaHCO3溶液，充分搅拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸、饱和NaCl溶液洗涤三次，无水Na2SO4干燥，过滤、洗涤、旋蒸除去氯仿，残余物用硅胶柱层析纯化或用甲醇-乙醚重结晶，即可得到目的产物，产率为70.2％所得化合物用电喷雾质谱(ESI-MS)及核磁共振(NMR)检测，得到波谱数据如下ESI-MS(pos)m/z607.3(M+H)+31P NMR(CCL3)7.16ppm1H NMR(CDCl3)δ0.71(d，6H，Valine CH3)，0.76(d，6H，Valine CH3)，1.03～1.26(m，12H，i-Propyl CH3×4)，1.81(m，1H，Valine β-CH)，2.88(m，H，Phenylalanine β-CH2，3.26(m，H，Phenylalanine β-CH2，5.51(d，H，Valine α-CH)，3.31(d×t，1H，Phenylalanine α-CH)，3.62(s，3H，OCH3)，3.72(s，6H，OCH3)，4.33(m，2H，OCH)，4.39(m，2H，OCH)，5.51(s，1H，Valine NH)，6.98(s，1H，Phenylalanine NH)，7.25～7.95(m，5H，Ph-H)，9.94(S，1H，aniline NH)ppm证明得到的化合物为DIPP-L-VAL-L-Phe-R。
对所制得的产物进行诱导细胞调亡的活性实验，过程及结果如下细胞培养及药物处理K562细胞为悬浮生长的细胞，HepG2细胞为贴壁生长的细胞，均购自上海细胞研究所，在37℃，5％CO2条件下培养于RPMI-1640培养液中(含10％灭活小牛血清)。取对数生长期的细胞，以2105个/mL的密度接种于培养板中，培养4h后，加入样品溶液(使孔中甲醇终浓度为1％)，同时设阴性对照(仅含1％的甲醇)和阳性对照(50μg/mL的顺铂)。用四甲基偶氮唑盐法(methylthiazolyl tetrazolium assay，MTT)比色实验分析DIPP-L-VAL-L-Phe-R对人类慢性髓性白血病细胞K562和肝癌细胞HepG细胞增殖抑制率的影响；收集药物作用24h后的K562细胞和HepG2细胞，加入MTT溶液(终浓度为5μg/mL)，培养4h后离心吸去上清，加入100μL的DMSO，37培养约10min，待结晶溶解完全后，用酶标仪于490nm处测量吸光度A值，计算IC50值。结果DIPP-L-VAL-L-Phe-R对人类慢性髓性白血病细胞K562和肝癌细胞HepG2的IC50值(24h)分别为15umol/L和10umol/L。
实施例2DIPP-L-Phe-L-Phe-R，该化合物的结构式为 该化合物的合成过程为使用实施例1相同的方法制备DIPP-L-Phe-L-Phe-OCH3。
将2mmol(0.88g)DIPP-L-Phe-L-Phe-OCH3溶于8ml甲醇中，冰水浴冷却下加入2.5ml(2.5mmol)1N NaOH溶液，室温搅拌反应3小时，旋转蒸发除去甲醇，残余物中加入5ml H2O，冰水浴冷却下，用1N HCl调节pH至3。过滤除去少量不溶物，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用饱和NaCl溶液洗涤3次，无水Na2SO4干燥。过滤，洗涤，合并滤液和洗液，旋蒸除去乙酸乙酯，残余物用乙酸乙酯～石油醚重结晶得到DIPP-L-Phe-L-Phe。
在50ml烧瓶中加入4mmol(0.73g)3，4，5-三甲氧基苯胺、4mmol(0.405g)NMM和10ml干燥的四氢呋喃，搅拌下加入4.2mmol(1.99g)DIPP-L-Phe-L-Phe和4.2mmol(0.567g)HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol(0.866g)DCC与5ml干燥的四氢呋喃的混合溶液，室温反应过夜后过滤，残余物用THF洗涤三次，合并滤液和洗液，旋蒸除去溶剂，残余物加饱和NaHCO3溶液，充分搅拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸、饱和NaCl溶液洗涤三次，无水Na2SO4干燥，过滤、洗涤、旋蒸除去氯仿，残余物用硅胶柱层析纯化，即可得到产物，产率为77％所得化合物用电喷雾质谱(ESI-MS)及核磁共振(NMR)检测，得到波谱数据如下ESI-MS(pos)m/z641.8(M+H)+31P NMR(CCL3)6.01ppm
1H NMR(CCL3)δ1.05～1.20(m，12H，i-propyl CH3×4)，2.88～3.10(m，4H，Phenylalanine β-CH2×2)，3.31(q，1H，Phenylalanine NH)，3.76(s，1H，OCH3)，4.15(m，1H，Phenylalanine αCH)，4.53～4.60(m，2H，i-propyl CHO×2)，4.9(m，1H，*Phenylalanine α-CH)，6.00～6.20(d，1H，*Phenylalanine NH)，6.29～6.41(m，10H，Ph-H×10)，9.00(S，1H，aniline NH)ppm证明得到的化合物为DIPP-L-Phe-L-Phe-R。
使用以上相同的方法进行活性实验，测得所制得化合物对人类慢性髓性白血病细胞K562和肝癌细胞HepG2的IC50值(24h)分别为150umol/L和17umol/L。
权利要求
1.二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物或其主体异构体，其特征在于该化合物的结构式为 其中AA1和AA2为相同或不相同的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物，其特征在于AA1和AA2均为L-氨基酸残基。
3.根据权利要求2所述的二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物，其特征在于AA1和AA2依次为缬氨酸残基和苯丙氨酸残基。
4.根据权利要求2所述的二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物，其特征在于AA1和AA2都为苯丙氨酸残基。
5.权利要求1所述的二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物的制备方法，其特征在于制备过程包括(1)二异丙氧基磷酰化二肽甲酯在甲醇存在下与氢氧化钠作用制得并分离纯化出二异丙氧基磷酰化二肽；(2)二异丙氧基磷酰化二肽在缩合剂作用下与3，4，5-三甲氧基苯胺反应制得并分离纯化出二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物。
6.根据权利5所述二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物的制备方法，其特征在于二异丙氧基磷酰化二肽的制备过程为将二异丙氧基磷酰化二肽甲酯溶于甲醇中，冰水浴冷却下加入氢氧化钠溶液，加入的二异丙氧基磷酰化二肽甲酯与氢氧化钠的摩尔比为1∶1.25，室温搅拌反应3-5小时，再分离纯化得到二异丙氧基磷酰化二肽。
7.根据权利5所述二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物的制备方法，其特征在于(2)的过程为在反应容器中加入3，4，5-三甲氧基苯胺、NMM和干燥的四氢呋喃，搅拌下加入异丙氧基磷酰化二肽和HOBt，加入的3，4，5-三甲氧基苯胺与异丙氧基磷酰化二肽的摩尔比为1∶1.05，冰水浴下滴加DCC与干燥的四氢呋喃的混合溶液，室温反应过夜，再分离纯化得到目的产物。
全文摘要
本发明属于生物化学领域，提供二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物及其制备方法。本发明二异丙氧基磷酰化二肽三甲氧基苯酰胺化合物的结构式如上式，其中AA
文档编号C07K1/00GK1789277SQ200510101669
公开日2006年6月21日 申请日期2005年11月18日 优先权日2005年11月18日
发明者蒋宇扬, 宇小青, 张楠, 刘峰, 蔡普钦, 周建宇, 莫卓华 申请人:清华大学深圳研究生院