专利名称：桑寄生凝集素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种桑寄生属植物中凝集素的提取或制备方法，属中草药提取或制备工艺技术领域。
背景技术：
桑寄生来源于桑寄生科植物桑寄生的干燥带叶茎枝，别名广寄生等。主产于我国南方诸如广东、广西等地。它主要用于风湿痹病、腰膝酸软、筋骨无力、崩漏经多、高血压等疾病的治疗。近年来，欧洲科学家已从欧寄生中分离出凝集素、毒肽、粘毒素等具有抗肿瘤活性的物质，并对凝集素Lectin-1的生化特性及其对细胞特性和肌体免疫机制进行了深入的研究。目前我国对桑寄生科植物的研究主要集中在小分子物质如黄酮类、生物碱等多种成分上，而对大分子物质如毒蛋白和凝集素的研究较少。
近年来国内外从植物中发现的抗肿瘤药物的化学成分及药理机制，显示出从植物中开发抗肿瘤新药的巨大潜力。正由于我国拥有丰富的中药资源，因此，从中草药中寻找抗肿瘤药物研究具有广阔前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种从中草药桑寄生植物中提取抗肿瘤药物有效成分凝集素的方法。
本发明一种桑寄生凝集素的制备方法，其特征在于具有以下的工艺过程和步骤a.将干燥的中草药桑寄生用粉碎机打成细粉，用含有浓度为0.05～0.5mol/L的氯化钠及pH值为6.0～8.0、浓度为0.05～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡6～24h，在此期间不断搅拌；然后将此混合物用布氏漏斗进行抽滤，得棕色滤液；b.根据上述滤液体积加入硫酸铵固体，充分搅拌调至饱和度达25～75％，静置数小时后，低温离心分离，取其上清液；按该上清液体积再次加入硫酸铵固体，充分搅拌，调至饱和度达45～95％，静置数小时后，低温离心分离，去除上清液，取其沉淀物，即为粗蛋白；c.将上述沉淀物粗蛋白溶于少量蒸馏水并转移至透析袋中，分别用蒸馏水和0.01～0.1mol/L、pH6.0～8.0的磷酸盐缓冲液进行透析，透析后的蛋白液用微孔滤膜过滤，得到滤液；
d.将上述粗蛋白滤液上琼脂糖亲和柱；用琼脂糖4％或琼脂糖6％的亲和柱；琼脂糖亲和柱事先需经0.1～0.5mol/L的盐酸、硫酸或醋酸酸化后装柱；用含有0.05～0.5mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液洗脱解吸附；分部收集，将有凝血活性的各管合并，再经透析去盐和半乳糖后，冷冻干燥，即可制得桑寄生凝集素粉末。
所制得的桑寄生凝集素可用于制备抗癌药物。
本发明方法所制得的凝集素其分子量为5万～15万。
本发明方法的特点是用硫酸铵沉淀法得到粗蛋白，再将粗蛋白溶于少量蒸馏水经透析后上琼脂糖亲和柱，并用磷酸盐缓冲液洗脱；在此过程中，对缓冲液洗脱的流出液采用核酸蛋白检测仪动态地进行监控。用核酸蛋白检测仪不时监控层析柱桑寄生蛋白提取液的整个分离过程。因为目前认为280nm紫外光波长处为蛋白质吸收最大点，此处也称为蛋白质特征吸收波长。在监控过程中，选择放置280nm波长的光来检测流出液，在开始初期看到的蛋白质层析峰是杂蛋白，待排出的流出液直至核酸蛋白检测值于280nm的检测值降到零点时，表示已完全去除杂蛋白，达到了层析目的。然后依据同样原理洗脱和收集目标蛋白质流出液，实现层析分离的过程。
具体实施例方式
现将本发明的实施例叙述于后。
实施例1本实施例中的制备步骤如下(1)将干燥的中草药桑寄生用粉碎机打成200目的细粉，称取100g粉末，用含有浓度为0.1mol/L的氯化钠及PH值为7.4、浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液750mol在4℃温度下浸泡12h，在此期间不断搅拌；然后将此混合物用布氏漏斗进行抽滤，得棕色滤液；(2)根据上述滤液体积加入硫酸铵固体，充分搅拌，调至饱和度达30％，在4℃静置4小时后，用转速为3000rpm的离心机低温离心分离15分钟，取其上清液；根据上清液体积再次加入硫酸铵固体，充分搅拌，调至饱和度达50％，在4℃静置4小时后，再用转速为3000rpm的离心机低温离心分离15分钟，取其沉淀物，即为粗蛋白；(3)将上述沉淀物粗蛋白溶于少量蒸馏水并转移至透析袋中，分别用蒸馏水和0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液进行透析，在4℃温度下透析3次，透析后的蛋白液用孔径为0.45um微孔滤膜过滤，得到滤液；
(4)将上述粗蛋白滤液上琼脂糖亲和柱；用琼脂糖4％的亲和柱，该琼脂糖亲和柱事先经0.3mol/L的醋酸酸化后装柱；用pH值为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液脱，直至核酸蛋白检测化所检测到的洗脱流出液于280nm波长处的吸收值降至正常值，表示已去除杂蛋白；然后再用含有0.2mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液洗脱解吸附；分部收集，将有凝血活性的各管合并，再经透析去盐和半乳糖后，冷冻干燥，即可制得桑寄生凝集粉末。
实施例2本实施例的制备步骤与上述实施例1完全相同。
(1)将干燥的中草药桑寄生用粉碎机打成200目的细粉，称取100g粉末，用含有浓度为0.3mol/L的氯化钠及PH值为6.0、浓度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲液750mol在4℃温度下浸泡12h，在此期间不断搅拌；然后将此混合物用布氏漏斗进行抽滤，得棕色滤液；(2)根据上述滤液体积加入硫酸铵固体，充分搅拌，调至饱和度达25％，在4℃静置4小时后，用转速为3000rpm的离心机低温离心分离15分钟，取其上清液；根据上清液体积再次加入硫酸铵固体，充分搅拌，调至饱和度达95％，在4℃静置4小时后，再用转速为3000rpm的离心机低温离心分离15分钟，取其沉淀物，即为粗蛋白；(3)将上述沉淀物粗蛋白溶于少量蒸馏水并转移至透析袋中，分别用蒸馏水和0.5mol/L、pH 6.0的磷酸盐缓冲液进行透析，在4℃温度下透析3次，透析后的蛋白液用孔径为0.45um微孔滤膜过滤，得到滤液；(4)将上述粗蛋白滤液上琼脂糖亲和柱；用琼脂糖6％的亲和柱，该琼脂糖亲和柱事先经0.3mol/L的醋酸酸化后装柱；用pH值为6.0的0.5mol/L磷酸盐缓冲液脱，直至核酸蛋白检测化所检测到的洗脱流出液于280nm波长处的吸收值降至正常值，表示已去除杂蛋白；然后再用含有0.5mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液洗脱解吸附；分部收集，将有凝血活性的各管合并，再经透析去盐和半乳糖后，冷冻干燥，即可制得桑寄生凝集粉末。
本发明方法制得的桑寄生凝集素对人体肝、胃癌细胞具有抑制作用，可作为抗癌药物的有效成分。
现将桑寄生凝集素对人体癌细胞抑制作用的实验叙述于下
A.桑寄生凝集素对人体肝癌细胞的抑制作用的实验1.实验材料人肝癌BEL-7402细胞株购于上海生命科学院细胞所；PRMI1640培养基为Invitrogen公司产品；噻唑蓝和二甲基亚砜为Sigma公司产品。
2.实验方法采用MTT法测定桑寄生凝集素对肝癌细胞生长抑制作用。取对数生长期细胞，用完全培养基整调细胞浓度至10,000个/mL，加到96孔培养板中，每孔100uL，置37℃、5％湿化的CO2培养箱中培养24h，吸出培养液，实验组分别加入含不同浓度的桑寄生凝集素的培养基100uL，药物浓度依次为200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL、6.25ug/mL；阳性对照组加入含5-Fu的培养基100uL，浓度100ug/mL；阴性对照组仅加入不含药物的培养基100uL，每个浓度做4个复孔，同时做三块板。在37℃，5％CO2培养箱培养48h，吸去上清液，每孔加入0.5mg/mL的MTT 100uL，孵育4h，再次吸去上清液，每孔加入DMSO 100uL，用微量振荡器振荡30min，490nm处用酶标仪测定每孔吸光度值，并计算出细胞生长抑制率、药物的半数抑制质量浓度。肿瘤细胞生长抑制率％＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，IC50＝细胞生长抑制率为50％的药物质量浓度。
3.实验结果结果如表1所示，桑寄生凝集素对肝癌细胞有明显的抑制作用，随着药物质量浓度的增加，抑制率逐渐增强。凝集素对肝癌BEL-7402的IC50为24.2ug/mL。
表1桑寄生凝集素对肝癌BEL-7402细胞的抑制作用(n＝12)
B.桑寄生凝集素对人体胃癌细胞的抑制作用的实验
1.实验材料人胃癌MGC-823细胞株购于上海生命科学院细胞所；PRMI1640培养基为Invitrogen公司产品；噻唑蓝和二甲基亚砜为Sigma公司产品。
2.实验方法采用MTT法测定桑寄生凝集素对胃癌细胞生长抑制作用。取对数生长期细胞，用完全培养基整调细胞浓度至10,000个/mL，加到96孔培养板中，每孔100uL，置37℃、5％湿化的CO2培养箱中培养24h，吸出培养液，实验组分别加入含不同浓度的桑寄生凝集素的培养基100uL，药物浓度依次为200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL、6.25ug/mL；阳性对照组加入含5-Fu的培养基100uL，浓度100ug/mL；阴性对照组仅加入不含药物的培养基100uL，每个浓度做4个复孔，同时做三块板。在37℃，5％CO2培养箱培养48h，吸去上清液，每孔加入0.5mg/mL的MTT 100uL，孵育4h，再次吸去上清液，每孔加入DMSO 100uL，用微量振荡器振荡30min，490nm处用酶标仪测定每孔吸光度值，并计算出细胞生长抑制率、药物的半数抑制质量浓度。肿瘤细胞生长抑制率％＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，IC50＝细胞生长抑制率为50％的药物质量浓度。
3.实验结果结果如表2所示，桑寄生凝集素对胃癌细胞有明显的抑制作用，随着药物质量浓度的增加，抑制率逐渐增强。凝集素对胃癌MGC-823的IC50为20.9ug/mL。
表2桑寄生凝集素对胃MGC-823细胞的抑制作用(n＝12)
权利要求
1.一种桑寄生凝集素的制备方法，其特征在于具有以下的工艺过程和步骤a.将干燥的中草药桑寄生用粉碎机打成细粉，用含有浓度为0.05～0.5mol/L的氯化钠及pH值为6.0～8.0、浓度为0.05～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡6～24h，在此期间不断搅拌；然后将此混合物用布氏漏斗进行抽滤，得棕色滤液；b.根据上述滤液体积加入硫酸铵固体，充分搅拌调至饱和度达25～75％，静置数小时后，低温离心分离，取其上清液；按该上清液体积再次加入硫酸铵固体，充分搅拌，调至饱和度达45～95％，静置数小时后，低温离心分离，去除上清液，取其沉淀物，即为粗蛋白；c.将上述沉淀物粗蛋白溶于少量蒸馏水并转移至透析袋中，分别用蒸馏水和0.01-0.1mol/L、pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液进行透析，透析后的蛋白液用微孔滤膜过滤，得到滤液；d.将上述粗蛋白滤液上琼脂糖亲和柱；用琼脂糖4％或琼脂糖6％的亲和柱；琼脂糖亲和柱事先需经0.1～0.5mol/L的盐酸、硫酸或醋酸酸化后装柱；用含有0.05-0.5mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液洗脱解吸附；分部收集，将有凝血活性的各管合并，再经透析去盐和半乳糖后，冷冻干燥，即可制得桑寄生凝集素粉末。
2.如权利要求1所述的桑寄生凝集素的制备方法所制得的凝集素，其用途为制备抗癌药物。
全文摘要
本发明涉及一种桑寄生属植物中凝集素的提取或制备方法，属中草药提取或制备工艺技术领域。本发明方法的特征在于具有以下工艺过程和步骤(1)将干燥的中草药桑寄生粉碎，用pH 6.0～8.0、浓度0.05～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡6～24h，将此混合物抽滤得棕色滤液；(2)滤液中加入硫酸铵固体，调至饱和度25～75％、静置、低温离心，取上清液；再次加入硫酸铵固体，调至饱和度45～95％，静置、低温离心，取其沉淀物粗蛋白；(3)将沉淀物粗蛋白溶于少量蒸馏水并转移至透析袋中，用磷酸盐缓冲液进行透析，其蛋白的液用微孔滤膜过滤，得滤液；(4)将滤液上琼脂糖亲和柱，用含有半乳糖的磷酸盐冲液洗脱解吸附，分部收集，经冷冻干燥即可得桑寄生凝集粉末。该生物对癌细胞具有明显的抑制作用。
文档编号C07K1/14GK1793173SQ20051011208
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者刘山莉, 潘鑫, 梁晓蔷 申请人:上海大学