抗体的制作方法

专利名称：抗体的制作方法
相关的申请本申请要求2004年5月10日提交的美国临时申请系列号60/569,892的优先权，在此完整引用作为参考。
背景过度侵袭性的T细胞常常引起不必要的免疫应答，其随后导致各种失调，例如，自体免疫疾病、移植排斥、过敏性疾病和T细胞来源的癌症。因此，在治疗这些疾病中控制侵袭性T细胞是关键的。通过免疫抑制或通过免疫耐受性的诱导可以限制这些细胞的活性。可选择的方案是诱导细胞凋亡，据信这涉及除去不需要的细胞，包括过度侵袭性的T细胞。参见，例如，Kabelitz等(1993)Immunol Today 14，338-340；和Raff(1992)Nature 356，397-399。
概述本发明涉及抗体和它们的衍生物，当其在活化的T细胞上与P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1)结合时诱导细胞凋亡，在一个方面，本发明的特征是具有三个序列的免疫球蛋白链，其(i)分别含有RSSQSIVHNDGNTYFE、KVSNRFS和FQGSHVPLT(SEQ ID NOs1-3)；(ii)分别含有SFGMH、YINGGSSTIFYANAVKG和YASYGGGAMDY(SEQ IDNOs4-6)；(iii)分别含有RASSTVNSTYLH、GSSNLAS和QQYSGYPLT(SEQID NOs7-9)；(iv)分别含有AYYIH、VNPNTGGTSYNPKFKG和SGSPYYRYDD(SEQ ID NOs10-12)；(v)分别含有RSSQSIVNSNGNTYLE、KVSNRFS和FQGSHVPWT(SEQ ID NOs13-15)；或(vi)分别含有TNAMNWVRQAPGKGLE、TYYADSVKD和GGSYWYFDV(SEQ ID NOs16-18)。
刚才描述的六组序列的每一组相应于与PSGL-1结合的抗体的三个轻链或重链互补决定区(CDR)，所述抗体例如以下实施例中描述的三种小鼠15A7、4386和9F9抗体。以下显示的是这三个抗体的轻链和重链可变(V)区(SEQ ID NO19-26)，CDR是下划线和高亮的SEQ ID NO19(小鼠15A7轻链V区)1 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAT1 M K L P V R L L V L M F W I P A S S S D61 ATTTTGATGACCCAAACTCCACTGTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCAATA21 I L M T Q T P L S L P V S L G D Q A S I121 TCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTAC41 S C W Y181 CTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAACTCCTGATCTACAAAGTTTCCAATCGATTTTCT61 L Q K P G Q S P K L L I Y 241 GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACACATTTCACACTCAACATCAGC81 G V P D R F S G S G S G T H F T L N I S301 AGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTC101 R V E A E D L G I Y Y C 361 ACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA121TF G A G T K L E L KSEQ ID NO20(小鼠15A7重链V区)1 ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTGTCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAT1 M D S R L N L V F L V L I L K G V Q C D61 GTGCAGCT6GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCC2l V Q L V E S G G G L V Q P G G S R K L S121 TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCCA41 C A A S G F T F S W V R Q A P181 GAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCA61 E K G L E W V A 241 AACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAATACCCTGTTCCTG81 R F T I S R D N P K N T L F L301 CAAATGACCATTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGGAAGGTATGCTAGT101 Q M T I L R S E D T A I Y Y C G R 361 TACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA121 W G Q G T S V T V S S
SEQ ID NO21(小鼠4386轻链V区)1 ATGGATTTTCTGGTGCAGATTTTCAGCTTCTTGCTAATCAGTGCCTCAGTTGCAATGTCC1 M D F L V Q I F S F L L I S A S V A M S61 AGAGGAGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAG21 R GFN V L T Q S P A I M S A S P G E K121 GTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAACTGTAAATTCCACTTACTTGCACTGGTTCCAG41 V T M T C W F Q181 CAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGGCTCATCCAACTTGGCTTCTGGA61 Q K S G A S P K L W I Y G241 GTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGT81 V P A R F S G S G S G T S Y S L T I S S301 GTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCACTCACG101 V E A E D A A T Y Y C 361 TTCGGTGCTGGGACCACGCTGGAGCTGAAA121 F G A G T T L E L KSEQ ID NO22(小鼠4386重链V区)1 ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTCACTACAGGTGTCCACTCTGAG1 M E W S W V F L F L L S V T T G V H S E61 GTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGACCTGGTGAAGCCTGGGGCTTTAGTGAAGATATCC21 V Q L Q Q S G P D L V K P G A L V K I S121 TGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGCCTACTACATTCACTGGGTGAAGCAGAGCCAT41 C K A S G Y S F T W V K Q S H181 GGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTGTTAATCCTAATACTGGTGGTACTAGCTACAAC61 G K S L E W I G R 241 CCGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATATTAAATGTAGATAAGTCATCCAGCACAGCCTACATG81 K A I L N V D K S S S T A Y M301 GAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGATCC101 E L R S L T S E D S A V Y Y C A R 361 CCCrACTATAGGTACGACGACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA121 W G Q G T T L T V S S
SEQ ID NO23(小鼠9F9轻链V区)1 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAT1 M K L P V R L L V L M F W I P A S S S D61 GTTTTGATGACCCACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATC21 V L M T Q T P L S L P V S L G D Q A S I121 TCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTAAATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTAC41 S C W Y181 CTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCT61 L Q K P G Q S P K L L I Y 241 GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGC81 G V P D R F S G S G S G T D F T L K I S301 AGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGG101 R V E A E D L G V Y Y C 361 ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA121 T F G G G T K L E I KSEQ ID NO24(小鼠9F9重链V区)1 ATGCTGTTGGGGCTGAAGTGGGTTTTCTTTGTTGTTTTTTATCAAGGTGTGCATTGTGAG1 M L L G L K W V F F V V F Y Q G V H C E61 GTGCAGCTTGTTGAGACTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGGTCATTGAAACTCTCA21 V Q L V E T G G G L V Q P K G S L K L S121 TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATACCAATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCA41 C A A S G F T F N 181 GGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAATAATTATGCAACATAT61 W V A R I R S K S N N Y A 241 TATGCCGATTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATACACAAAGCATGATC81 F T I S R D D T Q S M I301 TATCTGCAAATGAACAACTTGAAAACTGAGGACACAGGCATGTATTACTGTGTGAGAGGG101 Y L Q M N N L K T E D T G M Y Y C V R 361 GGAAGCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA121 W G A G T T V T V S S由于抗体的抗原结合特异性取决于它的轻链和重链CDR，上述的CDR可以用于产生保持了抗原结合特异性的抗体衍生物。抗体衍生物的实例包括嵌合抗体、人源化抗体和它们的功能等同物。以下显示的是人源化15A7抗体的轻链V区(SEQ ID NO25)和重链V区(SEQ ID NO26)，其分别包括SEQ ID NOs 1-3和SEQ ID NOs4-6SEO ID NO25(人源化15A7轻链V区)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY GVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYC FGQGTKVEIK
SEQ ID NO26(人源化15A7重链V区)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS WVROAPGKGLEWVA RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR WGQGTSVTVSS本发明的特征还在于分离的核酸，所述核酸具有编码上述免疫球蛋白链之一的序列。术语“抗体”或“免疫球蛋白链”是指分离的多肽，即，基本上从与它天然相关的其他蛋白质、脂质和核酸分离的多肽。多肽可以构成纯化的制品干重的至少50％、70％或95％。“分离的核酸”是指核酸，它的结构与任何天然产生的核酸或任何天然产生的基因组核酸的片段不同。因而该术语涵盖了，例如(a)DNA，其具有天然产生的基因组DNA分子的部分的序列但侧翼都不是编码序列，所述编码序列在该DNA天然产生的有机体的基因组中处在所述分子的部分的侧翼；(b)以一定方式掺入到载体中或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的核酸，从而产生的分子不同于任何天然严生的载体或基因组DNA；(c)分离的分子，例如cDNA、基因组片段、聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，其是杂交基因，即，编码融合蛋白的基因的部分。本发明的核酸可用于表达本发明的多肽。为了这个目的，人们可以将核酸可操作地连接到合适的调节序列来产生表达载体。
载体是指能够转运与之连接的另一个核酸、还能够自主复制或整合到宿主DNA中的核酸分子。实例包括质粒、粘粒和病毒载体。本发明的载体包括处在适于宿主细胞中表达核酸的形式的核酸。优选的，载体包括与要表达的核酸序列可操作连接的一个或多个调节序列。调节序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调节序列还包括指导核苷酸序列的组成型表达的那些序列，以及组织特异性调节和/或可诱导序列。这种表达载体的设计基于一些考虑，包括要转化的宿主细胞和期望表达水平的选择。表达载体可以被导入宿主细胞来产生本发明的多肽。本发明还包括含有上述核酸的宿主细胞。宿主细胞是指含有外源的编码序列或非编码序列的细胞。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔将外源序列导入到细胞中。适合的宿主细胞包括细菌细胞(例如，E.coli(大肠杆菌)、Bacills subtilis(枯草杆菌)和Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌))，酵母细胞(例如，Saccharomyces cerevisiae和Schizosaccharomyces pombe)，植物细胞(例如，Nicotiana tabacum(烟草)和Gossypium hirsutum(陆地棉))，以及哺乳动物细胞(例如鼠杂交瘤细胞，CHO细胞和3T3成纤维细胞)。
为了产生本发明的免疫球蛋白链，人们可以将宿主细胞置于一定条件下的培养物中，所述条件允许表达由上述核酸编码的多肽，并从所述培养物分离多肽。或者，本发明的核酸可以体外转录和翻译，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
抗体在本发明的范围内的。它由第一免疫球蛋白链和第二免疫球蛋白链形成，其分别含有上述小鼠15A7、43B6或9F9抗体的轻链CDR和重链CDR。优选的，该抗体由15A7的轻链和重链形成。
另一种抗体也处在本发明的范围内，其(i)特异性结合P-选择蛋白糖蛋白配体-1而不影响P-选择蛋白糖蛋白配体-1与P-选择蛋白之间的结合，以及(ii)当在活化的T细胞上与P-选择蛋白糖蛋白配体-1结合时，诱导T细胞的死亡。在一个实施方案中，该抗体特异性地结合人P-选择蛋白糖蛋白配体-1。
另一种抗体仍处在本发明的范围内，其特异性地结合成熟人P-选择蛋白糖蛋白配体-1的氨基酸残基115-126。优选的，该抗体特异性结合氨基酸残基117-123。更优选的，它特异性结合所有测试的表位之间的共有序列，氨基酸残基119-121。实际上，这个三个氨基酸残基中的一个或多个的突变消除了抗体结合。在一个实例中，当在活化的T细胞上与P-选择蛋白糖蛋白配体-1结合时，这种抗体诱导活化的T细胞的死亡。
在一个实施方案中，以上刚刚描述的两种抗体之一由轻链和重链形成，其分别含有SEQ ID NOs1-3和SEQ ID NOs4-6(例如，SEQ ID NOs19和20，或SEQ ID NOs25和26)。
在另的方面，本发明的特征是诱导活化的T细胞的死亡的方法。该方法包括使以上描述的三种抗体之一与活化的T细胞接触，其中抗体与活化的T细胞的结合诱导细胞死亡。
本发明的特征还在于在受试者中调节T细胞介导的免疫应答的方法。该方法包括(1)鉴定患有与过度的T细胞介导的免疫应答相关的病症或存在该风险的受试者，和(2)向受试者施用有效量的上述三种抗体之一。“过度的T细胞介导的免疫应答”是指由过度水平的活化T细胞引起的应答。过度水平是指(1)高于正常水平的水平，和(2)即使不大于正常水平，高于在个体中期望水平的水平。病症的实例包括炎性疾病、自身免疫性疾病、变应性疾病或T细胞癌症，以及其中受试者接受了或预期接受同种异体或异种移植的情况。
在以下附随的说明中将阐述本发明的一个或多个实施方案的细节。根据该详细说明，本发明的其他特征、目的和益处将更为明显。

发明内容
本发明至少部分地基于一项出乎意料的发现，通过使抗体或它们的衍生物在活化的T细胞上与PSGL-1结合，活化的T细胞可以被诱导经历细胞凋亡和被耗尽。对于治疗与过度的或不需要的T细胞介导的免疫应答或T细胞增殖相关的病症，所述抗体和衍生物是有用的。
因此，本发明的特征在于含有抗PSGL-1抗体的免疫球蛋白轻链或重链CDR的多肽，以及编码它们的核酸。免疫球蛋白链和核酸都可以用于制得上述抗体和衍生物。
本发明的免疫球蛋白链可以作为合成多肽或重组多肽来获得。为了制备重组多肽，可以将编码它的核酸与编码融合伙伴(partner)的另一个核酸连接，所述融合伙伴例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6x-His表位标记、M13基因3蛋白、或免疫球蛋白重链恒定区。产生的融合核酸可以导入细胞用于蛋白质表达。可以通过本领域公知的方法从宿主细胞分离融合蛋白。可以进一步处理分离的融合蛋白，例如通过酶消化，来除去融合伙伴并获得目标重组多肽。或者，免疫球蛋白链可以通过激活编码该链的核酸的内源表达来从适合的宿主细胞获得。
可以改变本发明的免疫球蛋白链的氨基酸组成而不破坏形成能结合PSGL-1的抗体的能力。例如，这种变体可以含有一个或多个保守性氨基酸替换(substitution)。″保守性氨基酸替换″是在其中氨基酸残基被置换为具有相似侧链的氨基酸残基的一种替换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括带有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。由此，在多肽中预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。或者，可以在全部或部分的本发明多肽上随机导入突变，例如，通过饱和诱变，并且可以筛选产生的突变体的形成能结合PSGL-1的抗体的能力，来鉴别本发明的变体，如以下在实施例中描述的。因而，举例来说，术语“含有SEQ IDNO19的免疫球蛋白链”涵盖了含有SEQ ID NO19的变体的免疫球蛋白链。
以上描述的免疫球蛋白链和变体可用于制备本发明的抗体或其衍生物。“抗体”包括完整的分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv(单链抗体)和dAb(结构域抗体；Ward，等(1989)Nature，341，544)。抗体的衍生物是指具有本发明的多肽变体的蛋白或蛋白复合物。可以如以下实施例中描述的通过在适合的宿主细胞中共表达含有相应轻链和重链CDR的多肽来制备本发明的抗体或衍生物。或者，可以通过制备单克隆和多克隆抗体和片段的本领域已知方法来制备它们。参见，例如，Harlow和Lane，(1988)AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。
为了制备本发明的抗体，可以将PSGL-1或它的抗原性片段与混合了佐剂的载体蛋白，例如KLH联结，并注入到宿主动物中。然后可以通过肽亲和层析来纯化该动物中产生的抗体。通常采用的宿主动物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。可用于提高免疫应答的各种佐剂取决于宿主物种，包括弗氏佐剂(完全的和不完全的)，矿物凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂，普卢兰尼克多元醇类(pluronic polyol)，聚阴离子，肽，油乳剂，钥孔血蓝素，和二硝基酚。有用的人佐剂包括BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和Corynebacterium parvum。
抗体分子的异质性群体(heterogeneous populations)多克隆抗体存在于被免疫受试者的血清中。针对特定抗原的抗体匀质群体单克隆抗体可以使用标准杂交瘤技术来制备。参见，例如，Kohler等(1975)Nature 256，495；Kohler等(1976)Eur.J.Immunol.6，511；Kohler等(1976)Eur.J.Immunol.6，292；和Hammerling等(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.。特别地，可以通过为了在培养物中通过连续细胞系产生抗体分子的任何技术来获得单克隆抗体，例如在美国专利No.4,376,110中描述的；人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)Immunol Today 4，72；Cole等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026)和EBV杂交瘤技术(Cole等(1983)MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。这样的抗体可以是任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，和它们的任何子类。可以体外或体内地培养生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤。在体内制备高滴度单克隆抗体的能力使之成为特别有用的制备方法。
此外，可以使用为了产生“嵌合抗体”而开发的技术。参见，例如，Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6851；Neuberger等(1984)Nature 312，604；和Takeda等(1984)Nature 314，452。嵌合抗体是一种分子，其中不同的部分来自不同的动物物种，例如，具有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。或者，可以修改为了制备单链抗体而描述的技术(美国专利No.4,946,778和4,704,692)来产生单链Fv抗体的噬菌体库。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段来形成单链抗体。此外，可以通过已知的技术来产生抗体片段。例如，这种片段包括但不限于，可通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab′)2片段，以及可通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生的Fab片段。也可以通过以下实施例中描述的方法或本领域已知的方法将抗体人源化。例如，具有期望的结合特异性的单克隆抗体可以被商业地人源化(Scotgene，Scotland；和Oxford Molecular，PaloAlto，Calif.)。完全人源化的抗体，例如在转基因动物中表达的那些，处在本发明的范围之内(参见，例如，Green等(1994)Nature Genetics7，13；和美国专利No.5,545,806和5,569,825)。
还处在本发明的范围内的是诱导活化T细胞死亡的方法，例如，通过在体外使活化的T细胞与本发明的抗体接触，和通过向有需要的受试者施用有效量的抗体。需要治疗的受试者可被鉴定为患有与过度或不需要的T细胞介导的免疫应答相关的病症或存在该风险，例如，患有自体免疫疾病、移植排斥、过敏性疾病或T细胞来源的癌症的患者。可以单独地或者与其他药物或治疗共同地进行这种方法。
术语“治疗”是指向受试者施用组合物，目的是治愈、减轻、解除、矫正、防止或改善失调(disorder)、失调的病症、继发于失调的疾病状态或趋于失调的倾向。“有效量”是能够在治疗的受试者中产生医学上期望的结果的组合物的量。
要治疗的示例性疾病包括糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青年类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎)、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、全身性红斑狼疮、自体免疫甲状腺炎、皮炎(包括特异反应性皮炎和湿疹性皮炎)、牛皮癣、Sjogren氏综合症、Crohn氏病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、I型糖尿病、炎症性肠疾病、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮(cutaneous lupus erythematosus)、硬皮症、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病翻转反应、麻风的结节性红斑、自体免疫葡萄膜炎、变态反应性脑脊髓炎、急性坏死出血性脑病、自发性的双侧渐进性感觉神经性的听力丧失、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、自发性血小板减少、多软骨炎、Wegener氏肉芽肿病、慢性活动性肝炎、Stevens-Johnson综合症、自发性口炎性腹泻、扁平苔癣、Graves氏病、结节病、原发性胆汁肝硬变、后葡萄膜炎(uveitis posterior)、间隙肺部纤维化、移植物抗宿主病、移植的情况(包括使用同种异体或异种组织的移植)例如骨髓移植、肝脏移植、或任何器官或组织的移植、变态反应例如特异反应性过敏、AIDS和T细胞瘤例如白血病或淋巴瘤。
在体内途径中，治疗组合物(例如，含有本发明的抗体的组合物)被施用给受试者。一般地，抗体被悬浮在药学上可接受的载体(例如，生理盐水)中，并口服地、或通过静脉内输注、或皮下、肌肉内、鞘内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内或肺内地注射或植入来施用。
所需的剂量取决于给药途径的选择；配方的性质；受试者的疾病的性质；受试者的大小、体重、表面积、年龄和性别；施用的其他药物；以及主治医师的判断。适合的剂量在0.01-100.0mg/kg的范围内。考虑到可用组合物的种类的变化和各种给药途径的不同效率，所需剂量的变化是预期的。例如，预计口服施用比静脉内注射需要更高的剂量。这些剂量水平的变化可以使用本领域充分了解的、用于优化的经验性规则来调整。将组合物封装在适合的递送载体中(例如，聚合的微粒或可植入装置)可以提高给药的效率，特别是对于口服给药。
含有药学上可接受的载体和有效量的本发明的抗体的药物组合物也处在本发明的范围内。该药物组合物可用于治疗如上所述的疾病。药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂，以及等渗剂和吸收延迟剂。
本发明的药物组合物可以使用常规方法被制备成用于不同给药途径的剂型。例如，它可以被制备成用于口服施用的胶囊、软明胶胶囊剂(gel seal)或片剂。胶囊可以含有任何标准的药学上可接受的材料，例如明胶或纤维素。片剂可以根据常规程序通过压缩组合物与固体载体和润滑剂的混合物来制备。固体载体的实例包括淀粉和糖膨润土(bentonite)。组合物也可以以含有粘合剂，例如乳糖或甘露醇、常规填料和制片剂的硬壳片剂或胶囊剂的形式来施用。可以通过胃肠外途径施用药物组合物。胃肠外剂型的实例包括活性剂的水溶液、等渗盐水或5％葡萄糖，或其他公知的药学上可接受的赋形剂。环糊精或其他增溶剂是熟悉本领域的人员公知的，可以用作用于治疗剂递送的药物赋形剂。
可以在体外和体内评估本发明的组合物的效力。参见，例如，以下的实施例。简要地，可以在体外测试该组合物诱导活化的T细胞死亡的能力。对于体内研究，可以将组合物注射到动物(例如，小鼠模型)中，然后获取它的治疗效果。根据该结果，可以确定合适的剂量范围和给药途径。
以下的具体实施例被认为仅仅是说明性的，无论如何不是对所公开的其余部分的限定。不需进一步的详细描述，相信本领域的技术人员可以根据在此的说明将本发明利用到最大程度。此处引用的全部出版物作为参考将它们完全地引入。
实施例1小鼠单克隆抗体15A7、43B6和9F9抗PSGL-1抗体的产生使用标准技术来产生特异性结合人PSGL-1(hCD162)的小鼠单克隆抗体。更具体地，用PHA-活化的人T细胞的膜部分免疫小鼠，并处死小鼠来产生杂交瘤细胞系。针对与稳定表达hCD162的CHO细胞的结合，筛选来自产生的杂交瘤细胞系的上清液。产生与表达hCD162的CHO细胞而不是亲本CHO细胞结合的抗体的那些细胞系，如下所述进行鉴定、亚克隆和进一步分析。
在鉴定的细胞系之中有m152-15A7、m166-43B6和m128-9F9。它们分别产生IgG1抗体15A7、43B6和9F9。免疫印迹显示这三种抗体从活化的T细胞的溶胞产物中体外结合(pull down)一种可被抗hCD 162抗体(kpl-1，PharMingen，San Diego，CA)检测的蛋白。
测试刚刚描述的三种抗体诱导活化T细胞的细胞凋亡的能力。将含有由三个杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体的培养物上清液分别与未活化的人T细胞(第0天)或体外活化的人T细胞(第7天)培养6小时。然后将细胞用annexin V染色并进行FACS分析。设门于(gated)CD3阳性细胞以确定体外活化的人T细胞或静息人T细胞的计数。凋亡的细胞是annexin V染色阳性的。
表1概述了在所有扫描的T细胞中细胞凋亡T细胞的百分比。
表1凋亡的T细胞的百分比

这些结果表明，小鼠15A7、43B6和9F9抗体(1)是hCD162特异性的和(2)可以结合人活化的T细胞并诱导活化T细胞而不是静息人T细胞的细胞凋亡。
还对PHA活化的人外周血单核细胞(PBMC)进行了细胞凋亡分析。发现，这些抗体仅在活化T细胞中，而不是静息T细胞、B细胞或嗜中性粒细胞中诱导细胞凋亡。
已知T细胞耗尽的抗体(T cell-depleting antibodies)，例如抗CD3，能够诱导可溶性因子的产生。使用这种抗体的治疗通常导致有害的细胞因子综合症。为了测试抗PSGL-1抗体是否也引起细胞因子相关性副作用，将新分离的人PBMC与15A7培养24、48或72小时。然后测定了上清液中的细胞因子水平。在PHA活化的PBMC(阳性对照)中产生了相当数量的IL-2、TNF-α和IFN-γ，而15A7处理的细胞中这些细胞因子的水平是检测不到的。这些结果证明了，在细胞凋亡诱导和细胞活化方面，抗PSGL-1对静息的外周血细胞没有影响或有很小的影响。
由于上述的抗体选择性地诱导活化T细胞的细胞凋亡而不对静息T细胞或其他免疫细胞产生不利影响，将它们施用给受试者可能不会象抗CD3或免疫抑制剂一样引起淋巴细胞减少或广泛的免疫缺陷。
抗CD162抗体的表位制图为了定位(map)小鼠15A7、43B6和9179在人CD162上的结合表位，表达并纯化了覆盖人CD162的各个区域的一系列融合蛋白。通过夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)检测了融合蛋白与这些单克隆抗体之间的相互作用。
简要地，在E.coli中将覆盖人CD162基因的各个区域的片段表达为与人免疫球蛋白γ1重链恒定区的融合蛋白。用具有BglII位点和BamHI位点的引物通过PCR扩增编码人免疫球蛋白γ1重链恒定区的cDNA。用BglII和BamHI切下PCR产物，亚克隆到用相同的酶消化了的pET-32a载体(Novagen)中。然后，用具有5′末端的NdeI位点和3′末端的BglII位点的引物通过PCR扩增编码hCD162的各个区域的cDNAs。用相应的酶切下PCR产物，按阅读框融合到pET-32a载体中编码人免疫球蛋白γ1重链恒定区的序列中。每次构建中使用的引物在表2中列出，引物的序列在表3中列出。
表2.用于每个实验的引物名称.


表3.引物序列.



将以上描述的表达构建体转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。6小时IPTG(2mM)诱导后收获转化的细胞，重悬浮在PBS中。在超声破碎细胞和在14,000g旋转沉淀10分钟后，收集产生的上清液用于纯化融合蛋白。更具体地，首先在4℃将上清液与蛋白G或蛋白A珠子(bead)孵育3小时。然后在3,000g旋转沉淀珠子，用洗涤缓冲液I(0.05％Triton X-100，50mMTris-HCl，pH8.5，400mM NaCl，1mM CaCl2和1mg/ml OVA)和洗涤缓冲液II(0.05％Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH8.5和150mM NaCl)各洗涤5次。然后用含有0.1M甘氨酸-HCl、2.7的洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质，用1MTris-HCl、pH8.6中和。通过Bio-Rad蛋白质分析(Bio-Rad Laboratories，Cat.No.500-0006)定量所有纯化的融合蛋白，通过SDS-PAGE证实。
进行夹心ELISA来研究hCD162片段和15A7、9F9和43B6的每一个之间的相互作用。用山羊抗人IgG(Southern Biotechnology，Cat.No.2040-01)抗体(2μg/ml，50μl/孔)包被96孔微量滴定板，在4℃过夜。在37℃用0.25％的BSA的PBS溶液(150μl/孔)封闭平板1小时。然后将封闭的平板与含有人CD162的各种片段的融合蛋白(2μg/ml)在室温下孵育2小时。用含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤4次之后，在室温下将平板与测试抗体(2μg/ml)孵育1.5小时。孵育之后，用PBST洗涤平板4次。然后将50μl的1比3000稀释的、与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechnology，Cat.No.1031-04)添加到每个孔中，在37℃孵育平板1小时。通过添加50μl的碱性磷酸酶底物溶液(1片碱性磷酸酶底物片溶于5ml含有0.012M的Na2CO3、0.16M的NaHCO3和1mM的MgCl2(Ph8.6)的底物缓冲液)进行酶反应，测定405nm的吸光度。
发现43B6和9F9能与含有成熟人CD162的残基50到60的所有融合蛋白相互作用，表明43B6和9179的表位位于残基50-60之间。不象9F9和43B6，15A7仅与覆盖残基42到319的融合蛋白结合，而不与覆盖残基42-119的融合蛋白结合，表明15A7的表位位于残基119到319之间。然后将15A7的表位位置缩减到了残基115到126之间。位置120处一个氨基酸的改变(Glu→Arg)降低了15A7与融合蛋白之间的相互作用，表明15A7在人CD162上的原始接触结构域位于或邻近于位置120，残基Glu是相互作用所必需的。
还在哺乳动物细胞中表达了覆盖人CD162各个区域的融合蛋白并测试了它们与15A7的相互作用。在哺乳动物细胞中将覆盖这些区域的片段表达为与人免疫球蛋白γ1重链恒定区融合蛋白。首先，将编码人免疫球蛋白γ1重链恒定区的cDNA插入到pcDNA3载体(Invitrogen)中。第二，用在5′末端的导入BamHI位点和在3′末端导入XhoI位点的引物通过PCR扩增编码hCD162的各个区域的cDNA。用相应的酶切下这些PCR产物，亚克隆到含有人免疫球蛋白γ1重链恒定区的pcDNA3载体中。每个引物的名称和序列在以上的表2和3中列出。
根据厂家的指导通过Lipofectamine 2000(Invitrogen，Cat.No.11668-027)将刚描述的哺乳动物表达载体瞬时地转染到COS-7细胞中。转染的细胞在极低Ig培养基(Invitrogen，Cat.No.16250-078)中生长。纯化表达的蛋白并按以上相同的方式进行夹心ELISA。
ELISA结果显示仅含有残基94到148的融合蛋白能与15A7作用。这些结果与15A7的表位位于残基115到126之间的思想相符。
所有以上结果表明，9F9、43B6和15A7的表位是蛋白依赖性的，而不是糖(carbohydrate)修饰依赖性的，因为所有三种抗体结合细菌表达的融合蛋白。它们还表明，虽然就结合特异性和在活化T细胞中引起细胞凋亡的功能来说15A7、9F9和43B6显示了类似的性质，但它们通过人CD162的不同结构域起作用并且表现也不同。
实施例2嵌合抗体15A7、43B6和9F9克隆抗CD162抗体的轻链和重链可变区通过锚定PCR法扩增编码抗体15A7、43B6和9F9的轻链和重链可变区(VL和VH)的cDNA。3′引物与C区域杂交，5′引物与使用末端脱氧转移酶附着到cDNA的G尾部杂交。将PCR片段克隆到pCRII载体(Invitrogen)中。测序和比较每条链的几个独立的克隆。挑选出由大多数独立克隆代表的序列。然后分析翻译的氨基酸序列来证实选出的序列具有典型的小鼠轻链或重链V区的特征并属于特定的亚型。然后通过比较翻译的氨基酸序列和每种亚型的共有序列来鉴定互补决定区(CDR)。使用的每个引物的名称和序列在以上的表2和3中列出。在概述中显示了15A7、43B6和9F9的轻链和重链V区的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO19-24)。
嵌合抗体为了产生表达嵌合抗体的载体，使用引物通过PCR来扩增编码15A7、43B6和9F9的VL和VH区域的cDNA，以包括5′信号肽序列和3′剪接供体信号。引物还在PCR产物的两端引入XbaI位点，其然后由XbaI酶切割并连接到XbaI消化的pVk、pVg1、pVg2或pVg4载体中。更具体地，将15A7、43B6和9F9的VL区域cDNA亚克隆到质粒pVk中。这个质粒含有CMV启动子和编码人轻链恒定区的序列。将15A7、43B6和9F9的VH区域cDNA亚克隆到质粒pVg1、pVg2或pVg4中。这三种质粒各自具有CMV启动子。它们还分别含有IgG1、IgG2和IgG4的人重链恒定区。
将编码每种上述的轻链的质粒与编码重链的质粒共转染到COS-7细胞中。收集转染的细胞的上清液。分析上清液中嵌合抗体与人CD162结合以及诱导活化T细胞的细胞凋亡的能力。
发现由15A7、43B6和9F9产生的所有嵌合抗体都与稳定表达人CD162的Sp2/0转染子结合，而不与亲本Sp2/0细胞结合，表明它们保持了人CD162结合能力特异性。此外，发现了嵌合抗体在已经活化7天的T细胞中诱导细胞凋亡，表明它们也保持了它们的小鼠对应物的这种功能。
人源化抗体通过将小鼠15A7的CDR移植到人框架上来用它制备人源化抗体。为了保持结合亲合性和特异性，当将CDR移植到人框架上时保持V区构象是关键的。为了选择合适的框架供体，将小鼠15A7轻链和重链V区的氨基酸序列与已经人源化的50种小鼠抗体的进行比较。
发现小鼠抗体mDREG-55在轻链和重链上与小鼠15A7的V区都具有高度序列同源性。以下列出的是小鼠15A7与这个mDREG-55抗体的序列比对(CDR是高亮的)轻链比对
mDREG-55 DIVLTQSPASLSVSLGERASISC WYQQKPGQPPKLLIY DI++TQ+P SL VSLG++ASISC++SQS++DG++Y WY QKPGQ PKLLIY SN Sm15A7DILMTQTPLSLPVSLGDQASISC WYLQKPGQSPKLLIY mDREG-55 GIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC FGGGTKLEIKG+P RFSGSGSGT FTLNI VE ED YYC Q+ P TF GGTKLE+Km15A7GVPDRFSGSGSGTHFTLNISRVEAEDLGIYYC GAGTKLELK重链比对MDREG-55 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS WVRQTPEKRLEWVA +V+LVESGGGLV+PGGS KLSCAASGFTFS++M WVRQ PEK LEWVA I+G ST+Y ++VKGm15A7 DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS WVRQAPEKGLEWVA MDREG-55 RFT工SRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAR WGQGTTLTVSSRFTISRDN +N L+LQM+ LRSEDTA+YYC R Y G DYWGQGT++TVSSm15A7RFTISRDNPKNTLFLQMTILRSEDTAIYYCGR WGQGTSVTVSS小鼠DREG-55是针对L-选择蛋白的单克隆的IgG1抗体。小鼠15A7VL和VH区域的序列与小鼠DREG55的分别有64.3％(仅框架73.8％)和70％(仅框架81.6％)的同源性。已经使用来自人抗体Gal的VL和VH区域的框架序列构建了人源化DREG-55(HuDREG-55)。因此，为了人源化小鼠15A7，使用人Gal轻链和重链的框架序列来替换小鼠15A7的相应部分。
通过4对合成的寡核苷酸(长度～80碱基)分别组装人源化15A7的轻链和重链可变区。每一对的寡核苷酸重叠约20个核苷酸。选择并合成核苷酸序列来编码包括信号肽的人源化可变区的蛋白序列。基因的组装和扩增按四个步骤进行(1)在4个独立反应中将四对互补的寡核苷酸进行退火并用Klenow片段进行延伸；(2)在两个独立反应中将产生的4个dsDNA片段成对地混合、变性、再退火和延伸；(3)将产生的两个dsDNA片段混合、变性、再退火和延伸以产生最终的全长dsDNA；和(4)用引物通过PCR扩增产生DNA以在两端引入XbaI位点。然后通过XbaI切下PCR片段并插入到各个XbaI消化的pVk和pVg4载体中。然后，在考虑为重要的CDR和框架之间相互作用的位置上，将Gal的残基改变回小鼠15A7的残基(即，I62V和D74H)。以下列出的是小鼠15A7和人源化15A7(Hul5A7)与mDREG-55的比对，其中V62和H74是下划线的。
轻链比对hDREG-55 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY mouse 15A7 DILMTQTPLSLPVSLGDQASISC WYLQKPGQSPKLLIY Hu15A7 DIQMTQSpSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY
hDREG-55 GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC FGQGTKVEIKm15A7GVPDRFSGSGSGTHFTLNISRVEAEDLGIYYC FGAGTKLELKHu15A7 GVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYC FGQGTKVEIK重链比对hDREG-55 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS WVRQAPGKGLEWVA m15A7DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS WVRQAPEKGLEWVA Hu15A7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS WVRQAPGKGLEWVA hDREG-55 RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR WGQGTLVTVSSm15A7RFTISRDNPKNTLFLQMTILRSEDTAIYYCGR WGQGTSVTVSSHu15A7 RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR WGQGTSVTVSS这样获得的质粒编码人源化15A7的重链和轻链。然后将这些质粒共转染入COS-7细胞。然后收集来自培养细胞的耗尽的上清液。检测上清液中人源化15A7与稳定表达hCD162的CHO转染子结合以及在活化7天的T细胞中诱导细胞凋亡的能力。结果显示它保持了这些能力。
嵌合抗体和人源化抗体的制备制备了产生人源化和嵌合抗体的细胞。更具体地，根据厂家的说明使用Gene Pulser设备(Bio-Rad Laboratories)在360V和25μF电容下通过电穿孔、用合适的质粒稳定地转染Sp2/0细胞(Sp2/0-Agl4；ATCC CRL 1581)。在转染之前，通过BamHI酶消化来使质粒线性化。使用PBS中的107个细胞和20μg的每种质粒DNA进行所有转染。将来自每次转染的细胞铺板到两个96孔组织培养平板中。48小时后，添加选择培养基(补充了10％FBS/次黄嘌呤/胸腺嘧啶核苷的DMEM培养基)和1μg/ml的霉酚酸。通过ELISA检测培养物上清液中抗体的存在来筛选和分离产生抗体的细胞。
将分离的细胞培养在无血清或低Ig培养基中，收集培养的上清液。通过穿过葡萄球菌蛋白A-Sepharose CL-4B的柱来纯化抗体。用洗涤缓冲液I(0.05％Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH8.5，400mM NaCl，1mMCaCl2和1mg/ml OVA)和洗涤缓冲液II(0.05％Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH8.5和150mM NaCl)各洗涤5次后，用含有0.1M甘氨酸-HCl、pH2.7的洗脱缓冲液洗脱结合的抗体，用1M Tris-HCl、pH8.6来中和。
亲合性测定通过竞争性结合来测定上述小鼠的、嵌合的和人源化15A7抗体的结合亲合性。
通过EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin系统(Pierce Biotechnology，Cat.No.21217)将小鼠15A7生物素化。简要地，将0.5mg(3.3×10-6nmol)的小鼠15A7溶于187μl的PBS中，并与6.8×10-5nmole的Sulfo-NHS-Biotin混合。然后将混合物在冰上孵育2小时，之后在4℃相对PBS透析过夜来除去游离生物素。将这样获得的生物素标记的小鼠15A7保存在4℃待用。
稳定表达人CD162的Sp2/0转染子用作人CD162抗原的来源。生物素标记的小鼠15A7用作示踪物。将增加量的竞争抗体(小鼠的、嵌合的或人源化的15A7)与35ng生物素标记的小鼠15A7混合，与1×105个表达CD162的Sp2/0细胞在4℃下稳定振摇孵育1.5小时。洗涤之后，将第二抗体链霉抗生物素蛋白-PE(Becton Dickinson Immunocytometry System Inc.Cat.No.349023)添加到混合物中。在4℃孵育45分钟之后，再次洗涤细胞，重悬浮在300μl的PBS-1％FBS中，进行PACS分析。
发现，小鼠15A7的半-最大竞争浓度是3.72μg/ml，而嵌合的和人源化15A7的分别为约5.71μg/ml和4.51μg/ml。这些结果表明，小鼠的、嵌合的和人源化15A7的亲合性是相当的。换句话说，小鼠15A7的结合亲合性(Ka)是4.03×107M-1，而嵌合的和人源化15A7的分别是2.62×107M-1和3.33×107M-1。
竞争分析进行竞争分析来研究上述三种小鼠抗体、PSGL-1和P-选择蛋白之间的相互作用。
P-选择蛋白是大多数白细胞上PSGL-1的主要的高亲合性配体。为了研究三种抗体是否阻止P-选择蛋白与PSGL-1的结合，在存在三种抗体的情况下测定纯化的人P-选择蛋白与活化T细胞的结合。已知阻断P-选择蛋白和PSGL-1的相互作用的KPL-1用作阳性对照。
用1％PHA活化人PBMC 2天，并维持在含IL-2的培养基中3天。用滴定的9F9、15A7、43B6、KPL-1(PSGL-1拮抗剂)，或对照抗体(9E10)孵育细胞30分钟，之后添加重组人P-选择蛋白(1.25μg/ml)。通过FACS上的抗P-选择蛋白-FITC分析来测量P-选择蛋白与活化T细胞的结合。
与早先的报道一致，KPL-1在低浓度(0.31μg/ml)几乎完全地消除了P-选择蛋白与活化T细胞的结合。43B6与KPL-1一样有效地阻断了P-选择蛋白与活化T细胞的结合，而9F9需要更高的浓度来达到相同效果。实际上，需要0.08μg/ml的KPL或43B6来消除50％的结合。相比之下，需要5μg/ml的9F9。此外，即使在20μg/ml下，15A7对于P-选择蛋白结合也不具有任何抑制效果。令人惊讶地，它增强了P-选择蛋白与PSGL-1的结合。这些结果表明，在活化T细胞上15A7和P-选择蛋白与PSGL-1的不同基序结合。
15A7不与P-选择蛋白竞争PSGL-1的事实表明，15A7的体内施用不会通过干扰白细胞的P-选择蛋白依赖性募集来影响先天免疫。
已经报道了PSGL-1在血小板上低水平表达。检测了15A7抗体对血小板的影响。发现该抗体不会增强或抑制人血小板的聚集。
实施例3针对小鼠PSGL-1的仓鼠单克隆抗体TAB4按照与实施例1中描述的方法类似的方式，制备了针对小鼠PSGL-1的单克隆抗体TAB4。它在体外诱导T细胞的凋亡，在体内耗尽了T细胞。为了确定它是否干扰小鼠PSGL-1和小鼠P-选择蛋白之间的结合，按照与实施例2中描述的方法类似的方式进行了竞争分析。发现甚至在高达20μg/ml的浓度下TAB4也不抑制小鼠P-选择蛋白与小鼠PSGL-1的结合。
实施例4小鼠单克隆抗体4B7、5C4、12E7、14B3、17E5和18D12表征了针对人PSGL-1的其他单克隆抗体4B7、5C4、12E7、14B3、17E5和18D12。在与活化T细胞结合时，它们都诱导了活化T细胞的死亡。按照实施例2中描述的方式进行了竞争分析来确定它们是否阻断PSGL-1与P-选择蛋白之间的相互作用。发现，即使在测试的最高的浓度(5μg/ml)下，这些抗体对人P-选择蛋白与人PSGL-1的结合有轻微的、抑制效果，如果有的话。
其他实施方案在本说明书中公开的所有特征可以按任何组合来组合。在本说明中公开的每个特征可以由服务于相同、等同或类似目的的可选择特征来替代。因而，除非是特意地声明了，所公开的每个特征仅仅是普通系列的同等物或类似特征的一个实例。
根据以上的说明，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征而不背离本发明的精神和范围，可以进行本发明的各种变化和修改来使其适应各种用途和病症。因而，其他实施方案也处在本发明的范围之内。
权利要求
1.免疫球蛋白链，分别包含SEQ ID NO1-3、SEQ ID NO4-6、SEQID NO7-9、SEQ ID NO10-12、SEQ ID NO13-15或SEQ ID NO16-18。
2.权利要求1的免疫球蛋白链，其中所述免疫球蛋白链含有SEQ ID NO1-3或SEQ ID NO4-6。
3.权利要求1的免疫球蛋白链，其中所述免疫球蛋白链含有SEQ ID NO19、20、21、22、23、24、25或26。
4.权利要求3的免疫球蛋白链，其中所述免疫球蛋白链含有SEQ ID NO25或26。
5.抗体，包含权利要求1的第一免疫球蛋白链和权利要求1的第二免疫球蛋白链，其中所述第一链是轻链，所述第二链是重链，所述第一链和第二链分别含有SEQ ID NO1-3和SEQ ID NO4-6；SEQ ID NO7-9和SEQID NO10-12；或SEQ ID NO13-15和SEQ ID NO16-18。
6.权利要求5的抗体，其中所述轻链和重链分别含有SEQ ID NO1-3和SEQ ID NO4-6。
7.权利要求5的抗体，其中所述轻链和重链分别含有SEQ ID NO19和20、21和22、23和24、或25和26。
8.权利要求7的抗体，其中所述轻链和重链分别含有SEQ ID NO25和26。
9.抗体，其特异性结合P-选择蛋白糖蛋白配体-1而不影响P-选择蛋白糖蛋白配体-1与P-选择蛋白之间的结合，其中所述抗体在活化T细胞上与P-选择蛋白糖蛋白配体-1结合时，诱导活化T细胞的死亡。
10.权利要求9的抗体，其中所述抗体与人P-选择蛋白糖蛋白配体-1结合。
11.权利要求9的抗体，其中所述抗体包括轻链和重链，所述轻链和重链分别含有SEQ ID NO1-3和SEQ ID NO4-6。
12.权利要求10的抗体，其中所述轻链和重链分别含有SEQ ID NO25和26。
13.抗体，其特异性结合人P-选择蛋白糖蛋白配体-1的氨基酸残基115-126。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体特异性结合氨基酸残基117-123。
15.权利要求14的抗体，其中所述抗体特异性结合氨基酸残基119-121。
16.权利要求13的抗体，其中所述抗体包括轻链和重链，所述轻链和重链分别含有SEQ ID NO1-3和SEQ ID NO4-6。
17.权利要求13的抗体，其中所述抗体在活化T细胞上与P-选择蛋白糖蛋白配体-1结合时，诱导活化的T细胞的死亡。
18.权利要求17的抗体，其中所述轻链和重链分别含有SEQ ID NO1-3和SEQ ID NO4-6。
19.诱导活化T细胞死亡的方法，包括使权利要求8的抗体与活化T细胞接触，其中所述抗体与活化T细胞的结合诱导所述活化T细胞的死亡。
20.诱导活化T细胞死亡的方法，包括使权利要求9的抗体与活化T细胞接触，其中所述抗体与活化T细胞的结合诱导所述活化T细胞的死亡。
21.诱导活化T细胞死亡的方法，包括使权利要求13的抗体与活化T细胞接触，其中所述抗体与活化T细胞的结合诱导所述活化T细胞的死亡。
22.在受试者中调节T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括鉴定患有与过度的T细胞介导的免疫应答相关病症或存在该风险的受试者，和向所述受试者施用有效量的权利要求8的抗体。
23.权利要求22的方法，其中所述病症是炎性疾病、自身免疫性疾病、变应性疾病或T细胞癌症。
24.权利要求23的方法，其中所述受试者已经接受了或预期接受同种异体或异种的移植。
25.在受试者中调节T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括鉴定患有与过度的T细胞介导的免疫应答相关病症或存在该风险的受试者，和向所述受试者施用有效量的权利要求9的抗体。
26.权利要求25的方法，其中所述病症是炎性疾病、自身免疫性疾病、变应性疾病或T细胞癌症。
27.权利要求26的方法，其中所述受试者已经接受了或预期接受同种异体或异种的移植。
28.在受试者中调节T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括鉴定患有与过度的T细胞介导的免疫应答相关病症或存在该风险的受试者，和向所述受试者施用有效量的权利要求13的抗体。
29.权利要求28的方法，其中所述病症是炎性疾病、自身免疫性疾病、变应性疾病或T细胞癌症。
30.权利要求29的方法，其中所述受试者已经接受了或预期接受同种异体或异种的移植。
31.分离的核酸，其包含编码权利要求1的免疫球蛋白链的序列。
32.分离的核酸，其包含编码权利要求3的免疫球蛋白链的序列。
33.包含权利要求31的核酸的载体。
34.包含权利要求32的核酸的载体。
35.宿主细胞，其包含编码SEQ ID NO1-3、SEQ ID NO4-6、SEQ IDNO7-9、SEQ ID NO10-12、SEQ ID NO13-15或SEQ ID NO16-18的核酸。
36.权利要求35的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
37.权利要求36的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是杂交瘤细胞。
38.宿主细胞，包含编码SEQ ID NO19、20、21、22、23、24、25或26的核酸。
39.权利要求38的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
40.权利要求39的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是杂交瘤细胞。
全文摘要
免疫球蛋白链或抗体，其具有与P－选择蛋白糖蛋白配体－1结合的抗体的轻链或重链互补决定区。还公开了编码免疫球蛋白链的核酸、具有核酸的载体和宿主细胞，以及诱导活化T细胞死亡的方法和在受试者中调节T细胞介导的免疫应答的方法。
文档编号C07K16/28GK1984680SQ200580023307
公开日2007年6月20日 申请日期2005年5月10日 优先权日2004年5月10日
发明者林荣华, 张重男, 陈佩君, 黄久珍 申请人:台医生物科技股份有限公司