专利名称：白花柽柳的类金属硫蛋白基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种白花柽柳的类金属硫蛋白(metallothionein-like protein)基因的cDNA序列的克隆；类金属硫蛋白基因是属于金属硫蛋白家族中的一类基因，是一种具有抗重金属胁迫和抗旱、耐盐的基因。因此，本发明的基因是一种抗逆基因，其具体用途是用于转基因提高植物的抗逆能力。
背景技术：
目前，应用转基因技术改良植物的抗性已经成为共识，同时已经有各种基因获得专利的报道。白花柽柳的抗旱、盐等能力极强，究其原因是由于其体内有一系列抗逆能力强的基因。因此，柽柳是进行抗逆基因克隆良好材料。
进行抗逆基因克隆的常用方法之一是首先通过差异显示、抑制性消减杂交、RT-PCR等技术获得目的基因的片段，然后根据所获得的已知基因序列，应用RACE方法或cDNA文库筛选方法获得全长基因。
目前，基因工程技术中，从抗逆植物的基因种类及数量非常有限，缺乏从高抗逆木本植物中克隆的基因；由于多数抗逆基因都是从非抗逆植物中克隆获得，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryzasativa)等植物中获得，非抗逆植物的抗盐相关基因显然不可能具有强的抗逆性；而且，绝大多数抗逆相关基因是来自于草本植物、微生物等，由于它们与木本植物间的遗传差异，这些基因在木本植物中未必能十分有效。
植物的类金属硫蛋白和金属硫蛋白除了参与生长发育、胚胎发生、果实发育等生理过程外，其最为重要的功能就是金属离子的结合功能和氧自由基清除功能。目前，人们已经对植物金属硫蛋白的这些功能进行了研究。如Foley等(1997)对蚕豆的两种金属硫蛋白基因的表达分析认为，金属硫蛋白作为金属离子的配体，具有稳定内环境中金属离子水平稳定的作用，并有效地运输和供给金属离子到需要的组织，从而说明植物金属硫蛋白基因具有参与金属离子的运输和供给的功能。类金属硫蛋白和金属硫蛋白基因能够螯合重金属离子，具有解除金属离子的毒害及维持细胞内环境稳定的作用。目前，金属硫蛋白和类金属硫蛋白等基因已经被转入到植物中来培育抗重金属植物，转基因植物具有抗镉、汞、砷、硒等元素的能力，同时，在植物体内类金属硫蛋白基因还具有远较GST强的氧自由基清除能力和抵抗抗氧化胁迫的作用。Mir等(2004)研究发现，类金属硫蛋白基因与氧化胁迫相关，Akashi等(2004)从野生西瓜里分离出金属硫蛋白家族基因CLMT2，发现其具有强的氧自由基清除能力等等，说明金属硫蛋白家族基因是植物体内重要的氧自由基清除剂之一。各种胁迫环境，如盐、旱、冷等都会导致植物体内氧自由基的生成，造成氧化胁迫，清除氧化胁迫是植物抗胁迫的重要途径之一。因此，类金属硫蛋白基因可能是用于培育抗逆转基因植物的优良基因。
1957年Margoshes和Vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新的蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白(英文为Metallothionein，简称MT)。人体内、动物、植物以及微生物均含MT，而且其理化特性基本一致。植物体内的类金属硫蛋白基因是一类重要功能基因，参与了许多生理过程，如生长发育、胚胎发生、小孢子发生、衰老、果实的发育、成熟和抗逆等过程。同时，由于它们富含半胱胺酸残基，具有强的活性氧清除能力，并具有重金属鏊合能力，是一种重要的抗逆基因。这种基因的克隆不仅可以有助于研究柽柳的一些重要生理功能，如胚胎发生、衰老、成熟和抗逆等，同时，作为一种重要的抗逆相关基因，其还可以用于科研与生产中，还可以通过转基因技术来培育抗逆植物新品种。
发明内容
本发明的目的是克隆出白花柽柳的一种类金属硫蛋白基因，首先通过消减文库获得了该基因的3’cDNA片段，然后通过RACE技术克隆出全长cDNA序列，该基因3’非编码区长度为262bp，5’非编码区长度为150bp，编码区长度为210bp，包含69个氨基酸，编码蛋白的分子量为7.32千道尔顿(KD)。类金属硫蛋白基因是属于金属硫蛋白家族中的一类基因，是一种具有抗重金属胁迫和抗旱、耐盐的基因。金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类低分子质量、富含巯基和金属的非酶类蛋白质，广泛存在于生物界，是生物体内的一种重要功能蛋白。因此，具体地说，本发明的基因是一种抗逆基因，其具体用途是用于转基因提高植物的抗逆能力。
本发明所述的白花柽柳类金属硫蛋白基因，其编码区序列为该基因主体，共210个碱基如下atgtcgggcaagtgcggaaattgcagctgtgctgacaagagccagtgcgtgcagaagagaaaccaatatgggttcgacctcatcgagacgcagacctatgctgagtcgactgttgtgatggatgatcccccaacagctgctgagaacggtggtcagtgcaagtgtggcgaccgctgcgcctgcgtcaactgcacttgtggcagtcactga其相应的编码氨基酸序列如下M S G K C G N C S C A D K S Q C V Q K R N Q Y G F D L I E T Q T Y A E S T V V M D D P PT A A E N G G Q C K C G D R C A C V N C T C G S H具体获得步骤为构建抑制性消减文库，对文库克隆的测序，然后对序列的生物信息学分析，获得了该基因的3’cDNA片段，然后通过RACE技术克隆出全长cDNA基因，该基因3’非编码区长度为262bp，5’非编码区长度为150bp，编码区长度为210bp，包含69个氨基酸。
本发明所述的白花柽柳类金属硫蛋白基因，通过用干旱处理(土壤相对含水率25％，48h)的白花柽柳材料作为实验方(tester)，无胁迫处理的柽柳作驱动方(driver)，构建干旱处理的柽柳抑制性消减cDNA文库，然后对文库克隆进行测序，获得了该基因的部分序列，经过Blastx分析显示，该序列3’端完整，5’不完整，应用5’RACE技术克隆出其全长cDNA序列。
序列分析表明，该基因含有高含量的半胱胺酸，半胱胺酸占总氨基酸的14.5％(10/65)，植物类金属硫蛋白基因具有强活性氧清除能力和重金属鏊合能力，是一类重要的抗逆基因，可以用来培育抗旱、盐、重金属等转基因植物。
本发明从抗逆能力极强的柽柳中克隆出来，与目前已经克隆获得的类金属硫蛋白(CAB85630，来自于Vitis vinifera)基因最高相似性为61％，相似性较低，是新的类金属硫蛋白基因。
参见附1为本发明基因序列具体实施方式
实施例通过构建抑制性消减cDNA文库，然后将文库克隆进行随机测序，并对测序结果进行BlastX分析，具体步骤为(1)构建抑制性消减文库。分别取干旱处理和对照材料的mRNA2μg，用5’TTTTGTACAAGCTT30N 3’为引物，应用cDNA synthesis Kit(宝生物工程(大连)有限公司)进行cDNA第一、第二链合成。分别将合成的双链cDNA用RsaI进行酶切，酶切产物进行纯化、沉淀，溶于5.5μL超纯水中，各取0.5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。干旱处理的cDNA作tester，对照cDNA作driver。取tester cDNA 1μL加入5μL水稀释，分别取2μL稀释液与Adaptor1和Adaptor2连接，连接体积为10μL，16℃连接48h，以保证连接效率。第一轮杂交，取Adaptor1和Adaptor2连接液各1.5μL于两个PCR管中，分别加入driver cDNA1.5μL，4×Hybridization Buffer 1μL混合，加入10μL石蜡油，98℃变性2min，68℃杂交8h。第二轮杂交，将1μLdriver cDNA加入2μL超纯水和1μL 4×Hybridization Buffer，98℃变性2min后，取1μL与Adaptor1和Adaptor2杂交液混合，68℃杂交16h，然后，向杂交液中加入200μL的Dilution buffer，68℃保持10min，将杂交液在-20℃保存。第一轮PCR，PCR体系为10×buffer 2μL，dNTP 200μmol/L，PCR primer1 0.5μmol/L，ExTaq 1.2U(宝生物工程(大连)有限公司)，杂交液2μL，加水至20μL。PCR条件为75℃6min补平杂交产物末端，然后94℃20s，66℃30s，72℃1.5min，27个循环。第二轮PCR，PCR反应体系为10×buffer 2μL，dNTP 200μmol/L，Nestedprimer1 0.5μmol/L，Nestedprimer2 0.5μmol/L，ExTaq 1.2U，第一轮PCR产物1μL，加水至20μL。PCR条件为94℃20s，68℃30s，72℃1.5min，16个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。向第二轮PCR产物中加入终浓度为50μmol/L的dATP及1UTaq酶，72℃30min，对PCR产物进行加尾，然后取1μL加尾后的PCR产物，与pMD18-T(宝生物工程(大连)有限公司)连接，连接体系为2×ligase buffer 5.2μL，PCR产物1μL，超纯水水4μL，反应体积10μL，16℃连接6h以上，将连接产物转入大肠杆菌Jm109中，转化步骤为取2μL连接反应产物，加入到大肠杆菌感受态中，温和混匀，冰上放置30min，42℃热休克90s，立即置于冰上，冷却1-2min后，每管加800μL SOC液体培养基，温和混匀，37℃225r/min振荡培养1h左右，使pMD 18-TVector抗氨苄青霉素的基因充分表达。取200μL转化菌液涂LB固体培养基(含AMP，IPTG，X-Gal)平板。，倒置在37℃温箱中过夜培养。通过蓝、白斑选择筛选阳性克隆；
(2)文库克隆的测序随机挑取阳性克隆于96孔深孔板，于37℃培养过夜后，采用碱裂解法提取质粒，用MADVN65型醋酸纤维滤板(Millipore)纯化质粒。使用PTC-200型PCR仪(MJ Research)对10μL测序反应体系进行PCR扩增，测序引物为RV-M引物。采用ET Terminator方法、使用MegaBACETMi000 DNA序列分析仪(Amersham Biosciences公司)对文库克隆进行测序。(3)序列的生物信息学分析，用BLASTX程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/blastx)对序列进行分析。(4)类金属硫蛋白基因序列的获得，通过消减文库获得了该基因的的3’cDNA片段，类金属硫蛋白基因序列如下＞序列15’TTTTTTTTTTTTTTTTAGCACATAATATATACTAGTATAGTATAAGTTCAACAGGCTGTATACAAGGCACACTTAGCTAGGCCATTAATATAACATGGCTGTAAAATTGTAGTAACAGAGAGAGATTATAAAAACACATGCAACGCCAGTTGATATAAGCAAGCAAGCTGGCGACGCAACTCTTATTGGATCACCATAGCATACTACTAGCTGCTCATTGGTATTAATTAATTAGCATAATATTTTTGTTGTTTCAGATCGATCTTTGCTGCTCAGTTTCAGTGACTGCCACAAGTGCAGTTGACGCAGGCGCAGCGGTCGCCACACTTGCACTGACCACCGTTCTCAGCAGCTGTTGGGGGATCATCCATCACAACAGTCGACTCAGCATAGGTCTGCGTCTCGATGAGGTCGAACCCA 3’对类金属硫蛋白(metallothionein-like protein)基因设计RACE引物5’CAGCGGTCGCCACACTTGCACTGACCACC 3’，然后按下列步骤进行基因克隆。
RNA的提取用CTAB法分离其RNA，具体步骤为取0.6ml CTAB提取液[2.5％(W/V)CTAB，硼砂0.025mol/L，NaCl 1.4mol/L，pH＝8.5，DEPC处理，1/10体积β巯基乙醇]加入到1.5ml离心管中；将柽柳组织液氮研磨后，加入离心管中，65℃温浴6min，置于冰上，加入等体积的Tris苯酚、氯仿混合物抽提；12000g离心5min，转移上清液到新离心管中。重复酚、仿抽提一次，等体积氯仿抽提一次；向上清液中加入等体积的LiCl(4mol/L)和1/2体积的无水乙醇，冰浴10min，12000g离心10min沉淀RNA，将制备的RNA用DNaseI(Promega公司)按其说明书方法消化可能存在的DNA，具体消化步骤为向PCR管其中依次加入4μL 10×Reaction buffer，4μL DTT(0.1mol/L)，DNaseI 10U，RNase抑制剂40U，然后加入20μg总RNA，加DEPC水补足40μL，37℃保温1h，加入100μL水，然后加入Tris苯酚100μL和氯仿100μL，用旋涡震荡器剧烈震荡1min；12000r/min离心5min，转移上清液到新离心管中，向上清中加入氯仿0.2mL，剧烈震荡1min，12000r/min离心5min，取上清液；向上清液中加入2.5倍体积的乙醇离心沉淀RNA，用75％的乙醇洗涤沉淀，将沉淀溶于适量的DEPC水，用非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，并用紫外分光光度计进行定量及纯度检测。
取纯化后的RNA用于反转录。
反转录用1μg总RNA进行反转录。反转录体系为总RNA1μg，反转录引物1umol/L，5’CDS引物1umol/L，dNTP 1000umol/L，反转录酶200U，DTT 1mmol/L，反应体系10Ul，42℃保温1h，用100uL的TE buffer稀释用于PCR。
类金属硫蛋白(metallothionein-like protein)基因RACE的PCR反应对类金属硫蛋白基因设计RACE引物5’CAGCGGTCGCCACACTTGCACTGACCACC3’，PCR体系为反转录产物0.025ug，5’RACE引物0.5umol/L，UPM引物0.5umol/L，dNTP 250umol/L，PCR buffer2Ul，taq 2U，用水补足20uL。PCR反应使用降落PCR(touchdown PCR)程序94℃预变性1min，94℃6sec，72℃3min 6个循环，94℃6sec，70℃12sec 72℃3min5个循环，94℃6sec，68℃12sec 72℃3min 30个循环，72℃保温7min。将RACE的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(见图1)，回收目的片段，将回收DNA片段与pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)连接，pMD 18-T Vector含有β半乳糖苷酶基因(LacZ)调控序列和头146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，但它并不破坏读框，也不影响功能。这种载体适用于可编码β半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性，但是它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。从而LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的半乳糖苷酶基因阴性的突变体之间实现互补，这种互补现象叫α互补。由α互补而产生的Lac+细菌易于识别，因为它们在呈色底物5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可识别可能带有重组质粒的菌落。
具体步骤为(1)连接连接体系为2×ligase buffer 5μL，PCR产物1μL，超纯水4μL，反应体积10μL，16℃连接6h以上；(2)大肠杆菌(JM109)感受态的制备将宿主菌(-70℃冰箱中保存)Jm109在LB琼脂培养基平板上划线，用封口膜封口，37℃倒置过夜培养。从平板中取出1个单克隆菌落，移至含有10mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，37℃190-200r/min振荡培养1.5h左右，再将菌液分装到100mL LB培养液中同条件继续培养2-3h，使细胞的浓度达到5×107个细胞/mL，此时，细菌的OD600一般在0.2-0.4之间，为对数生长期或对数生长前期。将培养物于冰上放置10min，使细菌代谢减缓，然后分装到两个50mL离心管中，4000r/min，4℃离心10min，收集菌体。弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余液体，然后加入10mL用冰预冷的0.1moL/L CaCl2致敏液悬浮细胞，置于冰上10min。然后4000r/min，4℃离心10min回收细胞，弃上清，每50mL的原培养物再加入2mL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，悬浮细胞。按每份200μL分装细胞，缓慢加入灭菌甘油至终浓度为30％，用移液枪吸打混匀，转到-70℃冰箱中贮存；(3)连接产物转化到感受态中在无菌条件下取2μL连接反应产物，加到从-70℃冰箱中取出的大肠杆菌感受态中，温和混匀，冰上放置30min(其间准备好42℃水浴箱，SOC液体培养基)，42℃热休克90s，放回冰上，冷却1-2min后，每管加800μL SOC液体培养基，温和混匀，37℃225r/min振荡培养1h左右，使pMD 18-T Vector抗氨苄青霉素的基因充分表达，即制备成了含有重组质粒转化的菌液；(4)涂平板配置含X-Gal、IPTG、Amp的琼脂培养基平板。其中，每100mL的LB固体培养基中分别加入400μL 1mol/L MgCl2、200μL X-Gal(20mg/mL)、100μL IPTG(24mg/mL)和120μL的Amp(50mg/mL)。取200μL转化菌液涂平板，待菌液被完全吸收后，用封口膜封好，倒置在37℃温箱中过夜培养。终止培养后，将平板置于4℃1-4h，使蓝色充分显现，带有β半乳糖苷酶活性蛋白的菌落中间呈现蓝色，无此酶活性的菌落为白色，该种菌落可能含有重组质粒；(5)提取质粒每板挑取适当大小白色菌落3-4个，分别置于5mL LB(含50mg/L的Amp)液体培养基中，37℃摇床培养。待OD值达到1.0以上时，提取质粒。质粒的提取步骤为，取1.5mL菌液于1.5mL Eppendorf管中，10000r/min离心4min，收集菌体；其弃上清，加溶液I 130μL，漩涡振荡器上振荡混匀1min左右，重悬菌体；加溶液II 260μL，轻柔颠倒离心管数次，混匀，冰上放置2-3min，直至管内液体呈粘稠状；加溶液III195μL，微震颠倒离心管数次，混匀，冰上放置3-5min，直至出现絮状白色沉淀，1000r/min离心4min；转移上清至另一离心管中，加等体积氯仿振荡混匀，1000r/min离心4min；小心吸取上清，并转移至另一离心管中，勿将蛋白质层吸出；重复氯仿抽提一次；向上清液中加2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，室温静止3-5min，12000r/min离心5min；弃上清，70％乙醇洗涤沉淀一次；加适量0.1×TE或去离子水溶解沉淀，取2μL进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；(6)插入片段的检测以质粒为模板，用pMD18-T两端的引物RV-M(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)和M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)进行PCR鉴定插入片段的大小，具体步骤为PCR体系去离子水15.3μL，10×PCR缓冲液2μL，dNTPs 20μM，RV-M引物(20uM)0.5μLM13-47引物(20uM)0.5μL，质粒模板1μL，Taq酶1U，反应体积20μL。混匀后稍离心，按以下程序进行严格PCR扩增94℃预变性2分钟，94℃变性40秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，重复30个循环，72℃延伸7分钟。取2μl此次PCR产物和2μL相应的二次PCR扩增的产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过比较两条带的相对位置，检测改质粒是否为含差异片段的重组质粒。并记录筛选保存的菌种。将插入片段与目的片段大小相符合的克隆进行测序。
全长基因的获得获得的PCR产物测序结果如下＞序列2AGCTGAGGTGACGAATGGATCAAGCTGCTCCTGCTGCCGTACCACTGGAAGTAGTTGAGAAACGGAACTCGGCCTCGTGCCGAATTCGGCACGAGGCCTCGTGCCGAATTCGGCACGAGGAGTTTITCACCTITCATCAACTAATTAACCATGTCGGGCAAGTGCGGAAATTGCAGCTGTGCTGACAAGAGCCAGTGCGTGCAGAAGAGAAACC
AATATGGGTTCGACCTCATCGAGACGCAGACCTATGCTGAGTCGACTGTTGTGATGGATGATCCCCCAACAGCTGCTGAGAACGGTGGTCAGTGCAAGTGTGGCGACCGCTG分别将它们与原序列(序列1)用blast2程序(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列拼接，获得了类金属硫蛋白和胁迫增强蛋白基因的完整基因，它们的序列如下AGCTGAGGTGACGAATGGATCAAGCTGCTCCTGCTGCCGTACCACTGGAAGTAGTTGAGAAACGGAACTCGGCCTCGTGCCGAATTCGGCACGAGGCCTCGTGCCGAATTCGGCACGAGGAGTTTTTCACCTTTCATCAACTAATTAACCATGTCGGGCAAGTGCGGAAATTGCAGCTGTGCTGACAAGAGCCAGTGCGTGCAGAAGAGAAACCAATATGGGTTCGACCTCATCGAGACGCAGACCTATGCTGAGTCGACTGTTGTGATGGATGATCCCCCAACAGCTGCTGAGAACGGTGGTCAGTGCAAGTGTGGCGACCGCTGCGCCTGCGTCAACTGCACTTGTGGCAGTCACTGAAACTGAGCAGCAAAGATCGATCTGAAACAACAAAAATATTATGCTAATTAATTAATACCAATGAGCAGCTAGTAGTATGCTATGGTGATCCAATAAGAGTTGCGTCGCCAGCTTGCTTGCTTATATCAACTGGCGTTGCATGTGTTTTTATAATCTCTCTCTGTTACTACAATTTTACAGCCATGTTATATTAATGGCCTAGCTAAGTGTGCCTTGTATACAGCCTGTTGAACTTATACTATACTAGTATATATTATGTGCTAAAAAAAAAAAAAAAA用ORF finder程序(www.ncbi.nlm.nih.gov)寻找其编码区，结果如下151 atgtcgggcaagtgcggaaattgcagctgtgctgacaagagccagM S G K C G N C S C A D K S Q196 tgcgtgcagaagagaaaccaatatgggttcgacctcatcgagacgC V Q K R N Q Y G F D L I E T241 cagacctatgctgagtcgactgttgtgatggatgatcccccaacaQ T Y A E S T V V M D D P P T286 gctgctgagaacggtggtcagtgcaagtgtggcgaccgctgcgccA A E N G G Q C K C G D R C A
331 tgcgtcaactgcacttgtggcagtcactga 360C V N C T C G S H *其编码的蛋白质序列M S G K C G N C S C A D K S Q C V Q K R N Q Y GF D L I E T Q T Y A E S T V V M D D P P T A A E NG G Q C K C G D R C A C V N C T C G S H *通过计算表明，该基因编码蛋白的半胱胺酸比例较高，含量占14.5％，具有典型的金属硫蛋白家族特征。对该序列进行蛋白家族分析，分别应用Pfam(http://pfam.wustl.edu/)程序的Protein search和DNA search进行基因的蛋白家族进行分析。其中，Protein search结果如下Seq-fro Seq-t HMM-fro HMM-t Scor AlignmeModel E-value Descriptionm o m o e ntMetallothio1.7e-0Metallothione1 66 184 19.7glocal26 inMetallothio_2domain 1 of 1，from 1 to 66score 19.7，E＝1.7e-06*->MSCCGGnCGCGSsCkCGsg..CC.ggCkmYpDlsesekktTtteTlVMS G+CG +C+C ++++C ++ +Dl e++ + ++ T+Vquery 1MS---GKCG---NCSCADKsqCVqKRNQYGFDLIETQ-TYAE-STVV39lGVAPekkhfegsemsevaaeesanG.CKCGsnCkCdPCnC<-*++ P+aae+ G+CKCG+ C C +C+Cquery40 MDDPPT------------AAEN--GGqCKCGDRCACVNCTC66DNA search结果如下#Protein ID DNA Str IDBitsEvalue---------------------------------------------------------------------------Protein Metallothio_2 DNA[+]UNKNOWN-QUERY45.63#AlignmentsAlignment 1 Score 37.40(Bits)
Metallothio_21MSCCGGNCGCGSSCKCGSGC-C--GGCKMYPDLSESEKKTTTTETLVLGMS G+CGC+C ++ C + +DL E++ + ++ T+V++MS---GKCG---NCSCADKSQCVQKRNQYGFDLIETQ-TYAE-STVVMDUNKNOWN-QUERY 151 at gatg atatggaactgcaaactgtgcagac atgg taggagtc gagg agggcaagagtaagaaagtattaca caca cctttagg cgca tccttcgcgcgggacatgccccggg cttg gttggtMetallothio_2 47 VAPEKKHFEGSEMSEVAAEESANG-CKCGSNCKCDPCNCP+AAE+ G CKCG+ C C +C+CDPPT------------AAEN--GGQCKCGDRCACVNCTCUNKNOWN-QUERY 274 gccaggga ggctatggctgtgatatacccccaa ggagaggaggcgtagcgtcaattgc ttgcgtccccccccctt以上Pfam结果表明，所获得的基因序列具有金属硫蛋白的保守结构域，为金属硫蛋白基因家族。
1AGC TGA GGT GAC GAA TGG ATC AAG CTG CTC CTG CTG CCG TAC CAC 4546 TGG AAG TAG TTG AGA AAC GGA ACT CGG CCT CGT GCC GAA TTC GGC 9091 ACG AGG CCT CGT GCC GAA TTC GGC ACG AGG AGT TTT TCA CCT TTC 135136 ATC AAC TAA TTA ACC ATG TCG GGC AAG TGC GGA AAT TGC AGC TGT 180M S G K C G N C S C10181 GCT GAC AAG AGC CAG TGC GTG CAG AAG AGA AAC CAA TAT GGG TTC 22511A D K S Q C V Q K R N Q Y G F25226 GAC CTC ATC GAG ACG CAG ACC TAT GCT GAG TCG ACT GTT GTG ATG 27026D L I E T Q T Y A E S T V V M40271 GAT GAT CCC CCA ACA GCT GCT GAG AAC GGT GGT CAG TGC AAG TGT 31541D D P P T A A E N G G Q C K C55316 GGC GAC CGC TGC GCC TGC GTC AAC TGC ACT TGT GGC AGT CAC TGA 36056G D R C A C V N C T C G S H *361 AAC TGA GCA GCA AAG ATC GAT CTG AAA CAA CAA AAA TAT TAT GCT 405406 AAT TAA TTA ATA CCA ATG AGC AGC TAG TAG TAT GCT ATG GTG ATC 450451 CAA TAA GAG TTG CGT CGC CAG CTT GCT TGC TTA TAT CAA CTG GCG 495496 TTG CAT GTG TTT TTA TAA TCT CTC TCT GTT ACT ACA ATT TTA CAG 540541 CCA TGT TAT ATT AAT GGC CTA GCT AAG TGT GCC TTG TAT ACA GCC 585586 TGT TGA ACT TAT ACT ATA CTA GTA TAT ATT ATG TGC TAA AAA AAA 630
权利要求
1.一种白花柽柳类金属硫蛋白基因，其特征在于其编码区序列为该基因主体，共210个碱基如下atgtcgggcaagtgcggaaattgcagctgtgctgacaagagccagtgcgtgcagaagagaaaccaatatgggttcgacctcatcgagacgcagacctatgctgagtcgactgttgtgatggatgatcccccaacagctgctgagaacggtggtcagtgcaagtgtggcgaccgctgcgcctgcgtcaactgcacttgtggcagtcactga其相应的编码氨基酸序列如下M S G K C G N C S C A D K S Q C V Q K R N Q Y G F D L I E T Q T Y A E S T V V M D D P PT A A E N G G Q C K C G D R C A C V N C T C G S H。
全文摘要
本发明涉及一种白花柽柳的类金属硫蛋白基因，通过消减文库获得了该基因的3’cDNA片段，然后通过RACE技术克隆出全长cDNA序列，该基因3’非编码区长度为262bp，5’非编码区长度为150bp，编码区长度为210bp，包含69个氨基酸，编码蛋白的分子量为7.32千道尔顿(KD)。类金属硫蛋白基因是属于金属硫蛋白家族中的一类基因，是一种具有抗重金属胁迫和抗旱、耐盐的基因。金属硫蛋白是一类低分子质量、富含巯基和金属的非酶类蛋白质，广泛存在于生物界，是生物体内的一种重要功能蛋白。因此，本发明的基因是一种抗逆基因，其具体用途是用于转基因提高植物的抗逆能力。
文档编号C07K14/415GK1827767SQ200610009150
公开日2006年9月6日 申请日期2006年2月15日 优先权日2006年2月15日
发明者张道远, 王玉成, 董玉芝 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所