通过天然化学连接的蛋白质的合成的制作方法

专利名称：通过天然化学连接的蛋白质的合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于通过一个酰胺键将两个寡肽头尾相连地进行化学连接的方法和中间体。更具体地讲，本发明涉及用于化学连接寡肽的方法和中间体，其中第一寡肽的未氧化N-末端的半胱氨酸与第二寡肽的C-末端硫酯发生缩合而生成一种β-氨基硫酯中间体，该中间体自发地进行分子内重排以形成一个酰胺键和连接产物。
政府的权利本文中所公开的发明得到国立卫生研究院的基金号为R01 GM48897-01、P01 GM 48870-03以及GM 50969-01部分的支持。美国政府可以具有本发明的某些权利。
背景技术：
蛋白质可以经化学合成、在无细胞体系中经核糖体合成或者在细胞中经核糖体合成。在以上每个领域中的进步都显著地增加了获得许多蛋白质的机会，但是也刺激了对进一步改进的需求。
蛋白质的多种多样的特性都归因于其多肽链的精确折叠的三维结构。蛋白质的三维结构决定了其功能特性。但是目前仅从蛋白质的三维结构难于预测和/或完全解释其生物学特性。可以通过系统地改变分子的共价结构并且把效果和被折叠的结构与生物学功能相关联，更好的了解蛋白质的结构如何决定其生物学特性。因此对于合成蛋白质及其类似物的改进的合成技术而言存在着日益增长的需求。
从以重组DNA为基础的分子生物学得到的技术可以用于便利蛋白质在遗传工程微生物中的表达。例如采用由M.Smith所公开的定点诱变(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1994)vol.33，p 1214)能够以对系统研究有用的量制备出许多修饰的蛋白质，例如C.Eigenbrot和A.Kossiakoff，生物技术中当前观点(1992)vol.3，p 333。改进方法的使用增加了可以在表达系统中插入的氨基酸的范围并且有可能会显著地拓宽蛋白质共价结构的生物合成修饰的用途(C.J.Noren等人，科学(1989)vol.244，p 182(1989)；J.A.Ellman等人，科学(1992)vol.255，p197)。但是，似乎存在一些对核糖体蛋白质合成本质所固有的局限(V.W.Cornish等人，美国国家科学院院报(1994)vol.91，p 2910)。
蛋白质的化学合成也有助于探索蛋白质结构与功能之间的关系。分步的固相合成已经使得可以从头制备小的蛋白质(T.W.Muir等人，生物技术中当前观点(1993)vol.4，p 420)。也有几个采用分步地固相合成整个蛋白质来探索生物学功能的分子基础的实例(M.Miller等人，科学(1989)vol.246，p 1149；A.Wlodawer等人，科学(1989)vol.245，p 616；L.H.Huang等人，生物化学(1991)vol.30，p 7402；以及KRajarathnam等人，科学(1994)vol.264，p 90)。
在一些特珠的实例中，为了研究蛋白质的结构/功能关系也可以使用通过肽片段的构象参与的再连接半合成(R.E.Offord，“蛋白质工程的化学方法”，蛋白质设计与新疗法和疫苗的开发，J.B.Hook，G.Poste，Eds.，(Plenum出版社，纽约，1990)pp.253-282；C.J.A.Wallace等人，生物化学杂志(1992)vol.267，p 3852)。半合成方法的一个重要的发展在于使用酶连接克隆的或者合成的肽链段(L.Abrahmsen等人，生物化学杂志(1991)vol.30，p 4151；T.K Chang等人，美国国家科学院院报(1994)正在印刷)。尽管上述方法已成功地用于合成蛋白质以及蛋白质类似物，但是T.W.Muir等人报道说在更广泛地应用有机化学的工具研究蛋白质方面存在日益增长的兴趣(生物技术中当前观点(1993)vol.4，p 420)。
Stephen Kent等人近来把未保护的肽链段的化学连接作为一种改进的路线而引入蛋白质的全合成中(M.Schnlzer等人，科学(1992)vol.3256，p 221)。化学连接涉及未保护的肽的化学选择性反应，从而在连接位点处得到具有一个非天然骨架结构的产物。使用未保护的肽回避了传统的化学合成固有的困难，即导致许多合成中间体的溶解度受到限制的保护基团的复杂组合，例如K.Akaji等人，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)(1985)vol.33，p 184。与之相比，化学连接技术可以使我们很好地利用常规制备、纯化并且表征具有50或者更多个残基长的未保护的肽的能力。采用优化的分步固相方法，在适当的产率以及高纯度下制备达到60个残基的肽是常规可达到的。在优选的实例中，可以制备具有80+残基的肽(M.Schnolzer等人，Int.J.Pept.Prot.Res.(1992)vol.40，p 180-193)。
以上化学连接方法的主要方面在于使用一种化学选择性反应通过在连接位点处生成一种非天然的(即非-肽)骨架结构来特异并且明确地连接肽。现在已经可以容易地制备一种宽范围的修饰骨架的蛋白质，其中包括蛋白质功能域的类似物，例如连接的10F3，纤连蛋白的整联蛋白-结合组件95个残基(M.Williams等人，J.Am.Chem.Soc.(1994)正在印刷)。HIV-1蛋白酶中活瓣(flap)-底物氢键的催化作用已通过经化学连接作用而化学合成该蛋白质的99个残基亚单位的同源二聚体加以阐明(M.Baca等人，美国国家科学院院报(1993)vol.90，p 11638)。也已证明化学连接对于常规、可重复地合成许多高纯度且完全具有生物学活性的蛋白质而言是有益的(20)(R.C.deLisleMilton等人，“通过化学连接未保护的肽链段合成蛋白质镜像酶分子，D-& L-HIV蛋白酶类似物”，蛋白质化学技术IV，学术出版社，纽约，pp.257-267(1992))。
化学连接也可以用于直接生产具有独特拓扑结构的蛋白质-样分子，例如四股螺旋的支架装配的合成蛋白质(MW 6647Da)(P.E.Dawson等人，J.Am.Chem.Soc.(1993)vol.115，p 7263)；均相多价的人造蛋白质(MW 19，916Da)(K.Rose，J.Am.Chem.Soc.(1994)vol.3116，p 30)；多链整联蛋白受体的胞质功能域的人造新蛋白(neoprotein)仿制物(MW 14，194Da)(T.W.Muir等人，生物化学(1994)vol.33，pp 7701-7708)；以及肽的dendrimer(MW24，205Da)(C.Rao等人，J.Am.Chem.Soc.(1994)vol.116，p6975)。通过该技术可以得到的蛋白质的范围受到合成肽的链段大小的限制。
如果有人已经直接合成得到了大小可高达一般的蛋白质功能域的天然骨架的肽链，则会产生有益的进步(A.L.Berman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1994)vol.91，p 4044)。然后采用化学连接可以把这些功能域串接在一起以便于在通常的形式下探索蛋白质的世界。
在由L.E.Canne等人已公开的未保护肽的会聚化学连接作用(在蛋白质协会的年会上提出，圣地亚哥，1994年7月)的基础上，已经建立了一种用于蛋白质全合成的模式策略。通过化学连接50-70个残基的链段来制备蛋白质的功能域(组件)；然后把这些功能域串接在一起以得到靶蛋白。此处需要互相匹配的连接化学过程功能域内部的连接最好应生成一个稳定的类似于肽的键；功能域外部的连接将容忍在连接位点处形成的结构的特性较宽范围的变化。
蛋白质的直接全化学合成表明实现了有机化学的一个重要目标。这不仅振奋人心地增加了通过常规的合成途径便可能不受限制地改变蛋白质共价结构的可能性，而且也为探索如折叠、稳定性、催化活性、键以及生物学作用这些特性的结构基础提供了新的推动力。
人们需要的是一种把在结合位点处形成天然肽键和未保护肽的化学选择性反应的优点相结合的天然化学连接技术。这种第二代连接化学将会显著地增加通过全化学合成可直接得到的天然骨架的多肽的大小。该技术可以有益地应用于宽范围的包括中等大小的蛋白质的合成目标，并且可以直接得到蛋白质功能性结构式域。天然化学连接是蛋白质全化学合成的常规模式方法的基石。而且，该方法与化学合成的肽和从其他来源得到的肽链段的用途是一致的。

发明内容
本发明一方面的目的在于天然化学连接的方法。天然化学连接方法促进了蛋白质以及大的寡肽的化学合成。“天然化学连接”的原理示于图1中。第一步为一个未保护的合成的肽-α-硫酯和另一个含有一个N-末端半胱氨酸残基的未保护肽链段的化学选择性反应，从而得到一个作为起始的共价产物的硫酯连接的中间体。在反应条件不改变的情况下，该中间体进行自发的迅速的分子内反应，从而在连接位点处形成一个天然的肽键。无需进行进一步的操作便能够以想要的最终形式得到目标全长的多肽产物。由天然化学连接方法所提供的常规的合成途径大大地拓展了蛋白质分子的共价结构变化的范围。
本发明的一个实例给出了一种用于把第一寡肽和第二寡肽头尾相连地进行连接以生成一种寡肽产物的方法。在一种含有催化的硫醇的反应溶液中混合第一和第二寡肽。该催化的硫醇(thiol)可以是一种非共轭硫醇(mercap Tan)或者是一种共轭硫醇(thiol)。优选的催化的硫醇包括苯甲基硫醇，苯硫酚，1-硫代-2-硝基苯酚，2-硫代-苯甲酸，2-硫代-吡啶，4-硫代-2-吡啶羧酸以及4-硫代-2-硝基-吡啶。第一寡肽包括一个C-末端硫酯。第二寡肽包括一个具有一个未氧化的巯基侧链的N-末端半胱氨酸。然后，N-末端半胱氨酸的未氧化的巯基侧链和C-末端的硫酯进行缩合，从而生成一种通过一个β-氨基硫酯键连接第一和第二寡肽的中间体寡肽。随后该中间体寡肽的β-氨基硫酯键进行分子内重排，从而生成一种通过酰胺键连接第一和第二寡肽的寡肽产物。
本发明另一方面的目的在于一种寡肽中间体，该中间体包括一段具有一个C-末端硫酯的第一寡肽链段，一段具有一个N-未端半胱氨酸的第二寡肽链段和一个连接C-末端硫酯和N-末端半胱氨酸的β-氨基硫酯键合单元。该β-氨基硫酯键合单元自发地进行分子内重排，从而形成一个头尾相连地连接第一和第二寡肽链段的酰胺键。
本发明另一方面的目的在于一种用于生产具有一个C-末端硫酯的寡肽的方法。在反应条件下，该方法将一种具有一个接头的树脂和一种具有一个叔丁氧羰基-氨基酸琥珀酰亚胺酯的未氧化的硫醇混合，从而生成一种叔丁氧羰基-氨基硫酯-树脂。然后通过分步的固相肽合成把一个寡肽装配到叔丁氧羰基-氨基硫酯-树脂上。当该寡肽是完整的肽时，采用HF裂解该叔丁氧羰基-氨基硫酯-树脂，从而生成一种具有一个C-末端硫醇的寡肽。然后把该C-末端硫醇转化成具有一个C-末端硫酯的寡肽。
图1的寡肽硫酯(α-COSR部分)可以容易地从一个相应的寡肽硫醇(-αCOSH)得到，而该寡肽硫醇是在硫酯树脂上经高度优化的分步SPPS制备的。硫酯树脂通过参考本文中引入的L.E.Canne等人的方法(Tetrahedron Letters(1995)vol.36，pp.1217-1220)进行制备。Canne的方法使用了由Blake和Yamashiro公开的硫酯树脂(J.Blake，Int.J.Pept.Protein Res.(1981)vol.17，p 273；D.Yamashiro等人，Int.J.Pept.Protein Res.(1988)vol.31，p 322)。通过常规的方法裂解、纯化并且表征肽产物(M.Schnolzer等人，Int.J.Pept ProteinRes.(1992)vol.40，pp 180-193)。
Yamashiro的方法采用二芳基二硫化物活化一个在经保护的寡肽上的硫代羧基以得到酰基二硫化物(Yamashiro等人，Int.J.PeptideProtein Res.(1992)vol.31，pp 322-334)。这些C-末端-肽-酰基-二硫化物是具有高度反应活性的亲电子中间体，该中间体与一个位于第二肽的N-末端上的α-氨基发生反应并且随后与之偶合以形成天然肽键。据报道当使用2，2’-二吡啶基二硫化物作为硫代羧基的活化剂时，以45％的偶合产率得到所需的α-IB-92产物。据报道，在用于α-IB-92的一个3-链段合成的起始树脂的基础上整个反应产率为8％，而一个2-链段合成的产率为11％。
由于二芳基二硫键具有高度反应性，所以Yamashiro方法需要对存在于肽分子中的氨基酸残基进行广泛的保护和去保护。举例来说，由于赖氨酸具有反应性的胺官能团，所以把赖氨酸基团保护为一个柠康酰(citraconyl)衍生物。此外，使用一个Msc基或者叔丁氧羰基来保护存在于该分子中的任一末端的胺官能团。
本文中所指的发明无需使用任意的用于偶合两个寡肽的保护基，这是由于使用了一种较低反应性(从而更具化学选择性)的硫酯亲电子试剂来代替酰基二硫化物部分(Yamashiro的方法)。在分子间的偶合步骤中，该硫酯亲电子试剂需要更多的亲核的巯基部分，而不是一个游离的胺。在半胱氨酸残基中可以找到这种亲核的巯基部分。由于氨基和羟基官能团对硫酯亲电子试剂相对呈惰性，所以使用半胱氨酸的巯基部分可以实现两个未保护寡肽的选择性偶合。位于肽2的半胱氨酸上的巯基首先和肽1的硫酯发生反应并且生成一种偶合的硫酯中间体。与此同时，该偶合的硫酯中间体与一个来自半胱氨酸的游离的α-氨基部分发生反应并且自发地进行重排以形成一个天然的肽键。由于减少了不想要的副反应，因此通过减少保护和去保护步骤而提高了产率(图1)。
该硫酯部分是从一种在配备有硫酯树脂接头的氨甲基树脂的载体上经优化的分步固相肽合成得到的前体硫代酸来制备的。随后于0℃下、在液态HF中在1小时内制成前体硫代酸(Yamashiro等人，Int.J.Pept.Protein Res.(1988)vol.31，pp 322)。
Blake(Blake等人，美国国家科学院院报(1981)vol.78，4055)和Yamahsiro(Yamashiro等人，Int.J.Pept.Protein Res.(1988)vol.31，pp 322)已经报道了一种用于通过使用分步固相肽合成来合成硫酯接头的方法。但是该方法不合乎要求，因为这种方法需要用硫化氢把叔丁氧羰基-氨基酸琥珀酰亚胺酯转化成相应的叔丁氧羰基-氨基硫代酸。本文中报道的一种改进的方法直接使用叔丁氧羰基-氨基酸琥珀酰亚胺酯并从而避免了硫化氢气体带来的不便和危险(Kent等人，Tetrahedron Lett.(1995)vol.36，p 1217)。
在该方法中(图2)，从氯化物2和硫脲的反应(Yamashiro等人，Int.J.Pept.Protein Res.(1988)vol.31，p 322)、随后在含水的介质中水解得到的thiouronium盐来制得硫醇3。硫醇3是一种常用的中间体，该物质可以和宽范围的可通过商业途径得到的叔丁氧羰基-氨基酸琥珀酰亚胺酯反应以生成所需的可以方便地以二环己基胺盐(DCHA)分离的硫酯接头1。
采用小的肽进行模型研究以探究该天然化学连接方法。为了协助探索反应机理，把肽Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-α-COSBzl和Ac-Cys反应。所得到的连接产物的精确的质量经电动喷雾质谱测定法测定并且与作为连接产物的硫酯连接的肽相符，其中该连接产物是通过位于肽的α-硫酯部分上的Ac-Cys侧链的亲核反应制得的。在pH为6.8时(pH小于6时，该反应进行得非常缓慢，这表明牵涉到半胱氨酸侧链的离子化的硫醇盐)迅速进行Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-α-COSBzl和H-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(含有一个未封闭的α-NH2官能团)的反应并且得到预期质量的单一产物。该产物对亲核试剂缺乏敏感性并且具有生成二硫化物连接的二聚肽的能力，而这正明确地表明在连接位点处形成了一个天然的酰胺键。上述研究和图1中所示的机理相符，其中由于迅速发生重排以形成一个稳定的肽键，所以不能以一种独立的中间体现测到起始的硫酯连接产物。对于在起始的化学选择性连接反应中形成的硫酯而言，易于进行的分子内反应是由α-NH2部分偏爱的几何排列引起的。在由Brenner阐明的原理(M.Brenner，肽。欧洲第八届肽研讨会的论文集H.C.Beyerman，Eds.(北部荷兰，阿姆斯特丹，1967)pp.1-7)的基础上使用这种用于肽键形成的“熵活化”。用于肽键形成的“熵活化”的原理近来已更多地为D.S.Kemp等人(有机化学杂志(1993)vol.58，p 2216)和C.-F.Liu等人(J.Am.Chem.Soc.(1994)vol.116，p4149)所接受。
通过天然化学连接方法已经合成了几种模型肽。上述模型肽的成功合成证实该天然化学连接作用一般可应用于含有通常在蛋白质中发现的所有官能团的肽。即使内部游离的半胱氨酸残基可以存在于反应链段的任一链段中。内部的半胱氨酸残基可以和肽-α-硫酯组分进行酯交换；但由于不能发生重排得到酰胺键，所以该反应毫无用处；所生成的硫酯易于转换并且保留一个该反应体系具有生产能力的部分。正如本文所公开的，天然化学连接反应限制于在一个N-末端半胱氨酸残基上的反应。重要的是防止该半胱氨酸的侧链硫醇氧化生成一种二硫化物连接的二聚体，因为这在连接反应中是未反应的。在不影响连接反应的情况下，使用与硫酯离去基团对应的过量的硫醇来保持该半胱氨酸残基呈还原态。该氨基-末端肽链段必须经化学合成进行制备，以便使该链段用所需的α-COSR官能团装配。而且为了优化连接反应，上述组分应具有一个不受阻碍的(即非β-分枝的)C-末端氨基酸。诸如脲或者盐酸胍这样的加溶剂不影响连接反应并且可以用于增加肽链段的浓度，从而提高反应速率。
进一步的模型反应表明使用更好的硫酯离去基团会引起更快的连接反应。我们将此现察结果应用于肽的天然化学连接反应，其中肽来自于如图5所示的人细胞因子受体(R.D’Audrea等人，血液(1994)vol.83，p 2802)的胞外功能域。使用与还原态的Elman’s试剂对应的5-硫代-2-硝基苯甲酸(-SNB)离去基团得到了快速且产率高的反应。如下结合图5所述，观测到肽链段之间的反应在不到5分钟内已经基本完成并得到在连接位点处具有一个天然肽键的50个残基的产物。因此通过使用一个具有合适调整(tuned)特性的硫酯离去基团可以实现快速的天然化学连接反应。
天然化学连接方法在蛋白质分子全合成中的应用可以通过制备人的白介素8(IL-8)加以说明(M.Baggiolini等人，FEBS Lett.(1989)vol.307，p 97；I.Clark-Lewis等人，生物化学杂志(1994)vol.269，p 16075(1994)；I.Clark-Lewis等人，生物化学(1991)vol.30，p3128；以及K.Rajarathnam等人，(1994)生物化学(1994)vol.29，p1689)。这种72个氨基酸的多肽链含有四个半胱氨酸残基，其中四个半胱氨酸残基形成了两个在天然蛋白质分子中发挥重要功能的二硫桥。IL-8的全合成显示在图7中。上述两个未保护的合成的肽链段完全反应，从而无需进一步的化学控制(9)便可以得到还原态的全长的多肽链。这种成功的连接反应特别有意义，因为33-残基和39-残基的IL-8链段中的每一链段都含有两个半胱氨酸残基并且它们总共包括在蛋白质中所发现的20种遗传编码的氨基酸中的18种氨基酸。如前所述把纯化的产物折叠并氧化以得到质量小于最初的连接产物确切为4道尔顿且表明形成了两个二硫键的IL-8。这种折叠产物的性质与以前研究过的标准IL-8样品的性质相同。在用于嗜中性白细胞弹性蛋白酶释放分析中的滴定结果表明折叠且连接的[Ala33]IL-8和由常规合成得到的相应分子的效价(ED50＝0.3nM)以及最大响应之间难以区分并且与天然序列的IL-8相同。该结果显然证实在连接位点处形成了一个肽键，这是因为必然已经发生了硫酯-至-酰胺的重排从而得到了形成天然二硫键的游离的Cys34侧链(参看图7)。
蛋白质通常是通过采用基于分子生物学的重组DNA方法在经遗传改造的微生物中表达来进行研究的。如定点诱变这样的方法已经重要地影响着以对系统研究有用的量来制备大量修饰蛋白质的能力。改进的方法已经扩大了在表达系统中可插入的氨基酸的范围并且确保显著地扩大了蛋白质共价结构的生物合成修饰作用的用途。但是，似乎存在核糖体的蛋白质合成本质所固有的局限。
Wieland公开了一种使用硫酯中间体来合成二肽的方法(Wieland等人，Liebigs Ann.Chem.(1953)vol.580，p 159)。Wieland采用了S-甘氨酰-(或者其它未分枝的氨酰基-)苯硫酚和半胱氨酸的反应。因此，半胱氨酸残基上的巯基首先和S-甘氨酰-苯硫酚的硫酯反应并生成一种偶合的硫酯中间体。与此同时，该偶合的硫酯中间体与来自半胱氨酸的游离的α-氨基部分反应并自发地进行重排以形成天然肽键。
Wieland方法的限制在于所用分子的大小(仅为单个-氨基酸偶合到半胱氨酸上)并且该限制起源于用于合成硫酯的方法。为了生成硫酯，Wieland的方法需要活化作为混合酐、酰基氯或者硫代酸的末端羧酸。如果有一个酸性部分存在于如天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)这样的氨基酸残基中的话，就会出现问题。在这种情况下Wieland得到了一个不想要的副反应，从而需要采用一种复杂的保护基策略，尤其在合成寡肽时这种情况更为突出。
由于寡肽-硫酯部分是从一种前体硫代酸得到的，所以本文中所述的发明省去了对复杂的保护基策略的需要。该前体硫代酸(肽-α-COSH)通过一种在装配有硫酯树脂接头的氨甲基树脂载体上的标准分步固相肽合成进行合成。在0℃下、于液态HF中从接头/树脂中几乎定量地(99％)裂解该前体硫代酸1小时。
硫酯肽(肽-α-COSR)可以通过两种常规的方式进行合成(1)粗的冷冻干燥的硫代酸肽(肽-α-COSH)和Ellman’s试剂(5，5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸，可以从Aldrich公司得到)在pH 5.5(2.0当量)、溶于100mM醋酸钠缓冲溶液的6M胍中的反应。这样便得到了SNB-硫酯肽(肽-α-COSNB)，随后经反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化该产物。
(2)粗的冷冻干燥的硫代酸肽(肽-α-COSH)和苄基溴在pH 4.0、6M胍和100mM醋酸钠缓冲溶液中的反应。然后通过RPHPLC纯化苄基硫酯(肽-α-COSBn)。
上述条件使得可以生成一种装配有活化硫酯的来保护的寡肽。接下来与含有一个末端半胱氨酸残基的第二肽的反应使得可以容易地和天然肽键的形成进行偶合并且可以制得具有100或者更多个氨基酸残基的肽链(图1)。
在有利的情况下，化学合成已对探索蛋白质结构和功能之间的关系作出了重要的贡献。分步的固相合成已经可以从头制备小的蛋白质(14)并且已有几个利用该蛋白质全合成方法来探索生物学功能的分子基础的突出实例。在一些具体的实例中把化学用于蛋白质研究的其它方法为通过肽片段的构象-参与的再连接反应而进行的半合成。半合成方法的一个重要的发展在于使用了克隆的或者合成的肽链段的酶连接反应。尽管目前这些方法具有严重的局限性，但是对利用有机化学工具进行蛋白质研究的更为广泛的应用仍存在着持续的浓厚兴趣。
天然化学连接反应明确地提供了这种可能性。该反应把在连接位点处形成天然肽键以及未保护的肽的化学选择性反应的优点相结合。这种第二代连接化学显著增加了直接可从全化学合成得到的天然骨架的多肽的大小。该反应可以有益地用于一个宽范围的包括中等大小的蛋白质的合成目标并且可以直接获得具有蛋白质功能的功能域。天然化学连接反应是蛋白质全化学合成的常规模式方法的基石。而且该方法和使用化学合成的肽以及从其它来源得到的肽链段是相容的。
蛋白质直接的全化学合成表明实现了有机化学的一个重要目标。它使得通过常规的合成途径不受限制地改变蛋白质的共价结构成为可能并且也为探索诸如折叠、稳定性、催化活性、键合和生物学作用这些性质的结构基础提供了新的推动力。
在另一个实例中，羧基-末端的肽链段或者蛋白质组件可以通过标准的recDNA方式加以表达；假定该产物含有一个N-末端半胱氨酸残基，则采用本文所述的天然化学连接反应该产物便可以与合成的氨基-末端的肽-α-COSR发生反应，从而得到一种部分蛋白质来自于化学合成而部分来自于核糖体合成的产物。
详细描述肽-α-硫代酸的生成一种用于生成和利用在肽-α-硫代酸的固相合成中使用的硫酯树脂接头的常用方法如下(Kent等人，Tetrahedron Lett.(1995)vol.36，p 1217)4-(α-巯苄基)苯氧乙酸，二环己基胺(3)(图2)。把采用Yamashiro等人(Int.J.Pept.Protein Res.(1988)vol.31，pp 322-334)规定的条件所生成的2的混合物(7.5克，27mmol)、硫脲(2.3克，30mmol)以及乙醇(100ml)加热至回流(采用Koenig等人在有机化学杂志(1958)vol.23，pp 1525-1530中报道的条件)。4小时后，所示通过TLC(90∶5∶5的氯仿∶甲醇∶乙酸)已基本完成了向thiouronium盐的转化。加入10N NaOH(30ml)并且持续回流2-3小时。冷却至室温后，将该反应混合物在真空中浓缩至大约为最初体积的一半，用浓HCl酸化(至pH2.0)并用醋酸乙酯提取(4×30ml)。合并的醋酸乙酯提取物用饱和NaCl洗涤(1×30ml)并在MgSO4上进行干燥。在真空中除去挥发性成分。把得到的油分溶于醋酸乙酯(100ml)中并滤去任何不溶的成分。在搅拌下向滤液中加入DCHA(二环己基胺-可以从Aldrich公司得到)(6.0ml，30mmol)。在几分钟内，白色固体开始沉淀。加入二乙醚(150ml)并在-20℃下冷却悬浮液几小时。所得到的白色固体经过滤、用二乙醚洗涤并且在真空下干燥从而得到3(10.3克，23mmol，84％)1H NMR(CDCl3)δ7.30(m，7H)，6.82(d，2H，J＝8.7Hz)，5.39(br s，1H)，4.40(s，2H)，2.81(m，2H)，2.23(br s，1H，ex D2O)，1.88-1.02(comp m，20H)；FAB MS(铯离子)对[C27H37NO3S，H+]计算为456.2572，实测值为456.2572.Anal.对[C27H37NO3S]计算值为C，71.17；H，8.18；N，3.07；S，7.04.实测值为C，71.11；H，8.41；N，3.08；S，7.09.
叔丁氧羰基-氨基硫酯接头(1)，二环己基胺盐的常规合成(图2).在室温下搅拌3的混合物(3.67mmol)，Boc-Ala-OSu(可以从Novabiochem公司得到)(3.68mmol)，DIEA(二异丙基乙胺-5.74mmol)，二甲基甲酰胺(35ml)和二氯甲烷(4ml)。几小时后，最初的白色悬浮物完全溶解，从而得到一种澄清无色的溶液。24小时后，把该反应混合物倒入1N HCl(150ml)中并用醋酸乙酯提取(4×35ml)。合并的醋酸乙酯提取物采用1N HCl(2×30ml)，H2O(1×30ml)，饱和NaCl(1×30ml)洗涤并在MgSO4上进行干燥。真空除去挥发性成分。得到的油分经急骤层析(925∶50∶25的氯仿∶甲醇∶醋酸)纯化以得到一种沾染有醋酸的油分。为除去残存的醋酸，把该油分溶于氯仿(40ml)，用0.1N HCl(7×10ml)、饱和NaCl(1×10ml)洗涤并在MgSO4上进行干燥。真空除去挥发性成分从而得到作为一种油分的1。把该油分溶于加入了二环己基胺(1当量)的二乙醚(10ml)中。在搅拌下加入己烷(100ml)，从而从任何未反应的二环己基胺中分离出作为粘稠油品的1的二环己基胺盐。从该油分中滗去溶剂并将油分溶于CH2Cl2(30-40ml)中。得到的溶液在真空中进行浓缩，从而得到呈白色泡沫状固体的二环己基胺盐1(图2)。
在树脂上进行连接和合成的实例如下在9ml二氯甲烷中将4-[α-(Boc-Ala-S)苄基]苯氧乙酸(0.80mmol)加入到1.00g克的氨甲基-树脂(0.40mmol)中，采用溶于二氯甲烷的1.33ml 0.6M的DCCI(二环己基碳化二亚胺)在0℃下处理15分钟并在24℃下处理30分钟。然后使上述产物处于标准的固相肽合成的条件下(Kent等人，Tetrahedron Letters(1995)vol.36，p 1217；J.Blake，Int.J.Pept.protein Res.(1981)vol.17，p 273)。一旦合成了所需的肽链，便在0℃下、于8ml液态HF(0.8ml苯甲醚)中处理该肽树脂(最初大约装填45μmol)1小时。在用氮气蒸发后，用醋酸乙酯洗涤残余物。随后于0℃下在水中(大约15ml)搅拌该固体，同时用固体碳酸氢铵调节其pH至6.0。过滤和冷冻干燥得到了粗的硫代酸产物，该产物可以经分离HPLC以每批30mg进行进一步的纯化。
制备硫代酸末端的肽链段α-COSR硫酯肽可以通过两种常规的方式进行合成(1)粗的冷冻干燥的硫代酸肽和Ellman’s试剂(5，5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸，可以从Aldrich公司得到)在pH5.5(2.0当量)、溶于100mM醋酸钠缓冲溶液的6M胍中的反应。这样便得到了SNB-硫酯肽，随后经反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化该产物。
(2)粗的冷冻干燥的硫代酸肽和苄基溴在pH 4.0、6M胍和100mM醋酸钠缓冲溶液中的反应。然后通过RPHPLC纯化苄基硫酯。
上述条件使得可以生成一种装配有活化硫酯的未保护的寡肽。接下来与含有一个末端半胱氨酸残基的第二肽的反应使得可以容易地和天然肽键的形成进行偶合并且可以制得具有100或者更多个氨基酸残基的肽链(图1)。


图1显示“天然化学连接”的原理。
图2显示二环己基胺盐的常规合成。
图3表明在1小时后及25℃下的反应对pH依赖的关系曲线。
图4显示经HPLC观察到的反应结果。
图5表示在不同pH值下向纯化的IL-3 Msc(46-76)αCOSNB中加入IL-3[Cys 77](77-95)的结果。
图6通过HPLC表明反应的进程。
图7显示IL-8的全合成。
图8为肽链段的HPLC谱图。
图9为由天然化学连接作用合成的HIV-1 K41蛋白酶的表征。
图10为芽孢杆菌RNA酶反应产物的反相HPLC图谱。
具体实施例方式
实施例1模型肽Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSH(序列号1)是通过在氨甲基树脂上经优化的分步固相肽合成进行制备的。硫酯树脂接头则通过采纳Kent等人(Tetrehedron Letters，(1995)vol.36，p 1217)；J.Blake(Int.J.Pept.Protein Res.(1981)vol.17，p 273)以及D.Yamashiro和C.H.Li(ibid.(1988)vol.31，p 322)的综合方案加以制备。一旦合成了所需的肽链，便在0℃下、于8ml液态HF(0.8ml苯甲醚)中处理该肽树脂(最初大约装填45μmol)1小时。在用氮气蒸发后，用醋酸乙酯洗涤残余物。随后于0℃下在水中(大约15ml)搅拌该固体，同时用固体碳酸氢铵调节其pH至6.0。过滤和冷冻干燥得到了粗的硫代酸产物，该产物可以经制备型HPLC以每批30mg进行进一步纯化。
随后通过化学合成从硫代酸片段制备硫酯末端的肽链段，从而用所需的α-COSR官能团来装配该链段，其中R为如苄基这样的烷基、5-硫代-2-硝基苯甲酸(-SNB)、苯硫酚等。使用更好的硫酯离去基团会引起更快的连接反应。因此，该模型肽Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSH(序列号1)通过与溶于6.0M盐酸胍、pH为4.6的醋酸钠缓冲溶液中的苄基溴(15当量)反应首先转化为硫代苄酯，从而生成Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn(序列号3)。在标准的反相高效液相色谱(HPLC)条件下，使用大约20-45％的乙腈以每分钟1％的量来纯化得到的肽并在214nm处进行监测。
对于肽H-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(序列号3)而言，如M.Schnolzer，P.Alewood，D.Alewood和S.B.H.Kent所述(Int.J.Pept.Protein Res.(1992)vol.40，180)固相方法可以在良好的产率和高纯度下制备出最高可达60个残基的肽。
首先为了探索上述反应的机理，将肽Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn(Bn，苄基；序列号3)与Ac-Cys(含有一个保护了的α-NH2官能团-可以从Novabiochem公司买到)反应。所得到的连接产物Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOS-CHaC(NHAc)CO2H(序列号4)的精确的质量经电动喷雾质谱测定法测定并且与作为连接产物的硫酯连接的肽相符，其中该连接产物是通过位于肽的α-硫酯部分上的Ac-Cys侧链的亲核反应制得的。
最后，在pH为6.8时(pH小于6.0时该反应进行得非常缓慢，这表明涉及在pH为6.8时半胱氨酸侧链的离子化的硫醇盐；图3)迅速进行Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn(序列号3)和Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(序列号2，含有一个开放的α-NH2官能团)的反应并得到预期质量的单一产物。在25℃下，在pH为6.8、6.0和4.7的0.1M磷酸缓冲溶液中肽Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn和Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser进行反应。1小时后，该反应已如下进行当pH为6.8时，连接产物Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(序列号5)占95％以上；当pH为6.0时，该连接产物约占10％；并且当pH为4.7时，该连接产物约占1.0％。作为由HPLC所观测到的结果，图3表明在1小时后及25℃下的反应对pH依赖的关系曲线。该产物对亲核试剂缺乏敏感性并且具有生成二硫化物连接的二聚肽的能力，而这正明确地表明在连接位点处形成了一个天然的酰胺键。
另外在未公开的模型中采用了45℃下、在pH为6.8的0.2M磷酸缓冲溶液中连接采用了2-硫代乙酸衍生物Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SCH2COOH(序列号6---从硫代酸Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SH(序列号1)与溶于二氯甲烷的2-溴乙酸的反应制得)和Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(序列号2)。1小时后，经HPLC观察到该反应已进行了80％(图4)。从连接的Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (序列号5)和未反应的Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser中分离出氧化产物，这表明存在一种游离的硫醇连接产物。
该天然化学连接作用一般可应用于含有通常在蛋白质中发现的所有官能团的肽。甚至于内部游离的半胱氨酸残基可以存在于反应链段的任一链段中。内部的半胱氨酸残基可以和肽-α-硫酯组分进行酯交换；但由于不能发生重排得到酰胺键，所以该反应毫无用处；所生成的硫酯易于转换并且保留了一个该反应体系具有生产能力的部分。
该天然化学连接方法限定为在一个氨基-末端半胱氨酸残基上的反应。为了防止该半胱氨酸的侧链硫醇氧化生成一种二硫化物连接的二聚体，在不影响连接反应的情况下，使用了与硫酯离去基团对应的过量硫醇来保持该半胱氨酸残基呈还原态。此外，向该偶合反应混合物中加入少量的低分子量的硫醇(如苄硫醇或者苯硫酚)来维持还原性环境。
硫醇的加入提高了硫酯的反应性，特别是如果与以前生成的硫酯相比，加入的硫醇是一种更好的离去基团时作用更为明显。一个观察到的实例为通过向反应中加入苯硫酚使得苄酯转化为苯酯的情况。该反应的产率和速率均显著增加。例如采用苄硫醇经7小时后，芽孢杆菌RNA酶的反应产率为25％，而苯硫酚对同一反应混合物的处理使得反应产率达到90％。
向连接混合物中加入硫醇也能保持该反应混合物呈还原态。这样便防止了具有反应性的N-末端半胱氨酸残基的氧化并且当存在内部的半胱氨酸残基时，该硫醇减少了分子内二硫键的形成。此外，还原性环境增加了硫酯链段的稳定性(在pH7.5时，该连接反应可以过夜进行少量水解或不水解)。
实施例2通过一个肽链段的合成来说明快速的天然化学连接反应，其中该链段对应于来自人IL-3受体β-亚单位(参考R.D’Andrea等人，血液(1994)vol.83，p 2802)的外部功能域的第46至95位残基。
通过采用在8M脲、pH为4.0的50mM醋酸铵缓冲溶液中的5，5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)[10当量(eq)]进行处理，可以把粗合成的IL-3 Msc(46-76)αCOSH转化成5-硫代-2-硝基苯甲酸酯(-COSNB)[Msc，采用1.1当量(eq.)的2-(甲磺酰基)乙基4-硝基苯基碳酸酯、1.1当量的二异丙基乙胺和.5M的二甲基甲酰胺把2(甲基-磺酰基)-乙氧基-羰基(Fluka #69227)保护基安排在N-末端上]。人们发现这种含有硫酯的物质在pH小于6.0时完全稳定，且该物质易于在标准的反相HPLC条件下使用大约20-45％的乙腈以每分钟1％的量进行纯化并在214nm处进行监测。
正如图5所示，通过在所指出的pH值下向纯化的IL-3 Msc(46-76)αCOSNB中加入IL-3[Cys 77](77-95)(由标准的固相方法(Kent等人，Int.J.Pept.Protein Res.(1992)vol.40，180)制备)来启动该连接反应并通过UV监测该反应[被取代的芳基硫醇盐离去基团在412nm处具有一个特有的紫外吸收(εTNB，412nm＝13，700dm3mol-1cm-1)]。在pH为7.0时，上述反应基本上在5分钟内完成。当在pH5.0下把Msc(46-76)αCOSNB暴露到摩尔数过量10倍的Leu-脑啡肽(氨基-末端残基，酪氨酸)中时，现察不到反应。上述对照实验证实了在连接反应的位点处绝对需要一个氨基-末端的半胱氨酸残基(图5)。
于23℃下，在8M脲、pH为5.0的50mM醋酸铵缓冲溶液中反应纯化的IL-3[Cys 77](77-95)(0.98mM)和IL-3(46-76)αCOSNB(0.9mM)(由分析型HPLC 9C18反相柱进行监测，以每分钟0.7％的量加入22.5至45％的乙腈；214nm)。1小时后，在pH9.0下把该连接溶液暴露于还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)中，随后将pH升高至13.0以除去Msc保护基(通过还原具有与上述肽产物共同洗脱趋向的苯硫酚和苄硫醇二硫化物，人们发现采用TCEP进行处理有助于纯化和分析产物)。图6通过HPLC表明该反应的进程；它显示了起始肽至粗产物的转化(图6)。经电动喷雾质谱测定法测定，50个残基的产物具有预期的分子量[实测值，5747.0道尔顿；计算值(平均的同位素组合物)，5747.4道尔顿]。在高pH、还原条件下，上述连接产物是稳定的并且形成了一个分子内的二硫键。这些观测结果与在连接位点处存在一个天然肽键是相符的。
类似的方法也需要除去保护基(J.Blake等人，Int.J.Pept.Protein Res.(1981)vol.17，p 273；Kemp等人，有机化学杂志(1993)vol.58，p 2216；Liu等人，J.Am.Chem.Soc.(1994)vol.116，4149)或将中间体转化为最终形式，或者两个步骤均采用。但从前却没有一种方法可以使未保护的肽链段发生化学反应，从而直接生成一种天然骨架的最终产物。
实施例3通过采用如Kent等人(Int.J.Pept.Protein Res.(1992)vol.40，180)所述的优化的分步固相方法可以制备出IL-8(34-72)链段(序列号9)并且在合适的产率和高纯度下生产出60-80个残基的肽。肽-αCOSH是在具有一个硫酯接头的氨甲基树脂上经优化的分步固相肽合成进行制备的。硫酯接头则通过采纳J.Blake(Int.J.Pept.Protein Res.(1981)vol.17，p 273)以及D.Yamashiro和C.H.Li(ibid.vol.31，p 322(1988))的综合方案加以制备。随后上述产物按照标准的反相HPLC条件进行纯化并采用包括电动喷雾质谱测定法在内的标准方法加以表征。
通过与溶于6M盐酸胍、pH为4.6的100mM醋酸钠缓冲溶液中的苄基溴(15当量)反应，便可以把粗合成的链段IL-8(1-33)αCOSH(序列号7)转化为硫代苄酯。在标准的反相HPLC条件下纯化该反应混合物并生成了硫代苄酯IL-8(1-33)αCOSBn(序列号8)(图7)。
于23℃下、在含有苄硫醇(5ml)的条件下在0.5ml的6.0M盐酸胍、pH为7.6的磷酸盐缓冲溶液中反应链段IL-8(1-33)αCOSBn(序列号8)(5.0mg，1.3μmol)和IL-8(34-72)(序列号9)(4.8mg，1.1mmol)。经适当的反应时间(48至72小时)之后，得到连接反应的产率大约为60％。该产物通过如上所述的标准的反相HPLC进行纯化并采用电动喷雾质谱测定法加以表征。
图8B，显示了在合成的肽链段IL-8(1-33)αCOSBzl和IL-8(34-72)的反应之前分析HPLC谱图(C18反相；以每分钟1％的量加入25-45％的乙腈；在214nm下进行监测)。
在图8C中显示了完全呈还原态的纯化的连接产物IL-8(1-72)(SH)4(序列号10)的分析HPLC谱图(C18反相；以每分钟1％的量加入25-45％的乙腈；在214nm下进行监测)。(插图)电动喷雾质谱(原始数据显示为一种单一的电前(charge)状态)观测到的分子量为8319.8道尔顿；计算分子量为(平均的同位素组合物)8319.8道尔顿。
如图8D所示，经HPLC纯化后表明纯化的1-72连接产物的空气氧化生成了折叠的[Ala33]IL-8分子。与还原肽相比，折叠的二硫化物交联的天然蛋白质一般更易于洗脱(参见Lewis等人，FEB Lett.(1989)vol.307，p 97；Lewis等人，生物化学杂志(1989)vol.269，p16075；Lewis等人，生物化学(1991)vol.30，3128)。
折叠和氧化条件0.2mg/ml的多肽、1M盐酸胍、pH为8.5的tris缓冲溶液，并于室温下在空气中用力搅拌(插图)。氧化并折叠的合成IL-8的电动喷雾质谱测定法(原始数据显示为一种单一的加料状态)。观测到的分子量为8315.6道尔顿；计算分子量为(平均的同位素组合物)8315.8道尔顿(图8)。
实施例4HIV-1 K41蛋白酶(未公开条件)连接反应可以通过几种方式进行。一种用于涉及(5-硫代-2-硝基苯甲酸)SNB硫酯的连接反应的优化方法为在同一反应容器中称量两种呈固体的肽，即HIV(1-40)-COSNB(序列号11，该物质是在本文中所指出的标准条件下生成的)和HIV(41-99)(序列号12，该物质是在本文中所指出的标准条件下生成的)的重量并加入含有6.0M盐酸胍的pH为6.5的100mM醋酸钠(大约每种肽的浓度为7-13mg/ml)。
5分钟后加入约2.0％的硫醇。现已使用了两种硫醇催化剂，即苄硫醇(就地生成苄硫酯；序列号13)和苯硫酚(原位生成苯硫酯；序列号14)。在HIV PR的连接反应中，与苄硫醇反应生成HIV-1K41蛋白酶(序列号15)的产率在40小时内高于60％，而与苯硫酚在10小内时所得产率高于80％。
通过还原趋向于与肽产物共同洗脱的苯硫酚和苄硫醇二硫化物，人们发现随后采用TCEP进行处理有助于纯化和分析产物。该产物通过如上所述的标准的反相HPLC进行纯化并采用电动喷雾质谱测定法加以表征(图9)。
实施例5芽孢杆菌RNA酶(未公开条件)在同一反应容器中称量两种呈固体的肽，即芽孢杆菌RNA酶(1-48)-SNB(序列号16，该物质是在本文中所指出的标准条件下生成的)和芽孢杆菌RNA酶(49-110)(序列号17，该物质是在本文中所指出的标准条件下生成的)并且将它们溶于pH7.5的缓冲溶液中(6M胍、100mM磷酸盐)。在溶解肽之后立即加入2％的苄硫醇(就地生成苄硫酯；序列号18)或者4％的苯硫酚(就地生成苯硫酯；序列号19)。7小时后，在生成芽孢杆菌RNA酶(1-110)(序列号20)的过程中苄硫醇的反应进行了25％而苯硫酚的反应进行了90％以上。该产物由如上所述的标准的反相HPLC进行纯化(图10)。
硫醇的加入提高了硫酯的反应性，特别是如果与以前生成的硫酯相比，加入的硫醇是一种更好的离去基团时作用更为明显。一个该结论的实例为通过向反应中加入苯硫酚使得苄酯转化为苯酯的情况。该反应的产率和速率均显著增加。例如采用苄硫醇经7小时后，芽孢杆菌RNA酶的反应产率为25％，而苯硫酚对同一反应混合物的处理使得生成芽孢杆菌RNA酶(1-110)(序列号20)的产率达到90％。
向连接混合物中加入硫醇也能保持该反应混合物呈还原态。这样便防止了具有反应性的N-末端半胱氨酸残基的氧化并且当存在内部的半胱氨酸残基时，硫醇减少了分子内二硫键的形成。此外，还原性环境增加了硫酯链段的稳定性(在pH7.5时，该连接反应可以采用极少量的水解或者无需水解过夜进行)。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名斯克瑞普斯研究院(B)街道10666北脱瑞松树路220号投信口TPC8(C)城市La Jolla(D)州CA(E)国家美国(F)邮政编码(ZIP)92037(G)电话619-554-2937(H)传真619-554-6312(ii)发明名称通过天然化学连接的蛋白质的合成(iii)序列数20(iv)计算机可读形式(A)存储媒体类型软磁盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(EPO)(v)目前申请数据(A)申请号PCT/US(B)申请日1995年5月4日(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位(location)5
(D)其它信息/标记＝COSH/注释＝“其中COSH为硫代酸”(xi)序列描述SEQ ID NO1Leu Tyr Arg Ala Gly1 5(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Cys Arg Ala Glu Tyr Ser1 5(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位5(D)其它信息/标记＝COSBn/注释＝“其中COSBn为苄硫酯”(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Tyr Arg Ala Gly1 5(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征
(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位5(D)其它信息/标记＝X/注释＝“其中X为N-乙酰基-半胱氨酸-硫酯”(xi)序列描述SEQ ID NO4Leu Tyr Arg Ala Gly1 5(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Leu Tyr Arg Ala Gly Cys Arg Ala Glu Tyr Ser1 5 10(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点
(B)定位5(D)其它信息/标记＝SCH2COOH/注释＝“其中SCH2COOH为2-硫代醋酸”(xi)序列描述SEQ ID NO6Leu Tyr Arg Ala Gly1 5(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度33个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位33(D)其它信息/标记＝COSH/注释＝“其中COSH为硫代酸”(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位1(D)其它信息/标记＝Msc/注释＝“其中Msc为2-甲基-磺酰基-乙氧基-羰基”(xi)序列描述SEQ ID NO7Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro1 5 10 15Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro20 25 30Ala(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)长度33个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位33(D)其它信息/标记＝COSBn/注释＝“其中COSBn为苄硫酯”(xi)序列描述SEQ ID NO8Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro1 5 10 15Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro20 25 30Ala(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)长度39个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu1 5 10 15Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe20 25 30Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser35(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)长度72个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位72(D)其它信息/标记＝SH4(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro1 5 10 15Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro20 25 30Ala Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu35 40 45Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys50 55 60Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser65 70(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)长度40个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位40(D)其它信息/标记＝COSNB/注释＝“其中COSNB为5-硫代-2-硝基苯甲酸酯”(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位27
(D)其它信息/标记＝Xaa/注释＝“其中Xaa为2-氨基丁酸”(xi)序列描述SEQ ID NO11Pro Gln Ile Thr Leu Trp Lys Arg Pro Leu Val Thr Ile Arg Ile Gly15 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val20 2530Ile Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly3540(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)长度59个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位27(D)其它信息/标记＝Xaa/注释＝“其中Xaa为2-氨基丁酸”(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位55(D)其它信息/标记＝Xaa/注释＝“其中Xaa为2-氨基丁酸”(xi)序列描述SEQ ID NO12
Cys Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val1 5 10 15Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Pro Val Glu Ile Xaa Gly His Lys Ala Ile20 25 30Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn35 40 45Leu Leu Thr Gln Ile Gly Xaa Thr Leu Asn Phe50 55(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度40个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位40(D)其它信息/标记＝COSBn/注释＝“其中COSBn为？？”(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位40(D)其它信息/标记＝COSBn/注释＝“其中COSBn为苄硫酯”(xi)序列描述SEQ ID NO13Pro Gln Ile Thr Leu Trp Lys Arg Pro Leu Val Thr Ile Arg Ile Gly15 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val20 2530Ile Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly3540(2)SEQ ID NO14信息
(i)序列特征(A)长度40个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位40(D)其它信息/标记＝COSPh/注释＝“其中COSPh为苯硫酯”(xi)序列描述SEQ ID NO14Pro Gln Ile Thr Leu Trp Lys Arg Pro Leu Val Thr Ile Arg Ile Gly15 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val20 25(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)长度99个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位67(D)其它信息/标记＝Xaa/注释＝“其中Xaa为氨基丁酸”(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点
(B)定位95(D)其它信息/标记＝Xaa/注释＝“其中Xaa为2-氨基丁酸”(xi)序列描述SEQ ID NO15Pro Gln Ile Thr Leu Trp Lys Arg Pro Leu Val Thr Ile Arg Ile Gly15 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val20 25 30Ile Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Cys Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly3540 45Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Pro Val50 55 60Glu Ile Xaa Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr65 70 75 80Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Xaa Thr85 90 95Leu Asn Phe(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)长度48个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位48(D)其它信息/标记＝COSNB/注释＝“其中COSNB为5-硫代-2-硝基苯甲酸酯”(xi)序列描述SEQ ID NO16
Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln Thr1 5 10 15Tyr His Lys Leu Pro Asn Asp Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln Ala20 25 30Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro Gly35 40 45(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)长度62个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17Cys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu Pro1 5 10 15Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr Ser20 25 30Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu Ile35 40 45Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg50 55 60(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)长度48个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征
(A)名称/要点修饰的位点(B)定位48(D)其它信息/标记＝COSBn/注释＝“其中COSBn为苄硫酯”(xi)序列描述SEQ ID NO18Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln Thr1 5 10 15Tyr His Lys Leu Pro Asn Asp Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln Ala20 25 30Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro Gly35 40 45(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)长度48个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/要点修饰的位点(B)定位48(D)其它信息/标记＝COSPh/注释＝“其中COSPh为苯硫酯”(xi)序列描述SEQ ID NO19(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO19Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln Thr1 5 10 15Tyr His Lys Leu Pro Asn Asp Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln Ala20 25 30Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro Gly35 40 45
(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)长度110个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln Thr1 5 10 15Tyr His Lys Leu Pro Asn Asp Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln Ala20 25 30Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro Gly35 40 45Cys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu Pro50 55 60Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr Ser65 70 75 80Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu Ile85 90 95Tyr Lys Thr Thr Asn His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg100 105 110
权利要求
1.一种寡肽中间体，它包括具有C-末端硫酯的第一寡肽链段；具有N-末端半胱氨酸的第二寡肽链段；以及连接该C-末端硫酯和该N-末端半胱氨酸的β-氨基硫酯键合单元，所说的β-氨基硫酯键合单元自发地进行分子内重排，从而生成头尾相连地连接所说第一和第二寡肽链段的酰胺键。
2.一种用于生产具有C-末端硫酯的寡肽的方法，该方法包括以下步骤步骤A提供具有未氧化的硫醇的接头的树脂；步骤B提供叔丁氧羰基-氨基酸琥珀酰亚胺酯；然后步骤C在用于生产叔丁氧羰基-氨基硫酯-树脂的反应条件下，混合所说步骤A的树脂和所说步骤B的叔丁氧羰基-氨基酸琥珀酰亚胺酯；然后步骤D通过分步的固相肽合成把一种寡肽装配到该叔丁氧羰基-氨基硫酯-树脂上；然后步骤E为了生产具有C-末端硫醇的寡肽，用HS裂解所说步骤D的叔丁氧羰基-氨基硫酯-树脂；并且然后步骤F把所说步骤E的具有C-末端硫醇的寡肽转化为具有C-末端硫酯的寡肽。
全文摘要
具有天然肽骨架的中等大小的蛋白质通过天然的化学连接方法进行生产。天然的化学连接作用采用了一种由两个未保护的肽链段的化学选择性反应，从而生成一种过渡态的硫酯连接的中间体。然后该过渡态的硫酯连接的中间体自发地进行重排，从而生成在连接位点处具有一个天然肽键的全长的连接产物。该全长连接产物在化学上与由无细胞合成所生产的蛋白质相同。全长的连接产物可以重折叠和/或氧化，从而生成天然的含有二硫化物的蛋白质分子。该天然化学连接技术可以用于化学合成全长的蛋白质。
文档编号C07K1/02GK1810837SQ20061000884
公开日2006年8月2日 申请日期1995年5月4日 优先权日1995年5月4日
发明者S·B·H·肯特, T·W·牧伊尔, P·E·道森 申请人:斯克里普斯研究学院