专利名称：重组日本七鳃鳗口腔腺分泌l-250蛋白抗凝血功效的制作方法
技术领域：
日本七鳃鳗口腔腺分泌具组胺释放因子活性的TCTP模体蛋白一L-250的基因克隆与表达属于生物技 术领域。涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆，与其对应的蛋白质氨基酸序列及其 在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及L-250蛋白作为组胺释放因子，剌激嗜碱性粒细胞释放组胺。组胺能 增强血管内皮细胞表面表达凝血酶调节素TM, —方面它能与凝血酶结合，降低凝血酶活性；另一方面能 够活化蛋白C，从而触发抗凝血级联反应。这提示，L-250蛋白的组胺释放因子活性在抗凝及心脑血管疾 病治疗方面具有潜在的应用价值。
背景技术：
日本七鳃鳗a。附/7e^ayaj5o"!'ca)系圆口纲(Cycpostomata)、七鳃鳗目(Petromyzoniformes)、七鳃鳗 科(Petromyzontidae)、七鳃鳗属"W/je"tero")。在进化上因连接着脊椎与无脊椎动物而具有极高的研究 价值。在海水中营半寄生生活，以其特有的口吸盘吸附在其他鱼类躯体上，靠吸食其血肉生存，并使宿主 流血不止，提示在其口腔腺中存在某种抗凝机制。
血管内壁主要存在两种抗凝机制，分别为蛋白酶类凝血抑制机制和蛋白酶抑制剂类抑制机制。在蛋白 酶类凝血抑制机制中，蛋白C起主要作用。蛋白C (PC)为丝氨酸蛋白酶，是由肝脏分泌的一种生理性抗 凝剂，它以酶原形式存在于血浆中，PC在自然状态下是无活性的，经凝血酶的激活，可成为活化的蛋白C (APC)。 APC通过使已活化的VI1I因子、V因子等凝血因子灭活，从而抑制凝血过程。然而，凝血酶对PC 的激活是相当慢的、凝血酶只有与存在于内皮细胞膜表面的血栓调节蛋白，又叫做凝血酶调节素(TM) 形成复合物后，才能有效地激活PC。 TM是内皮细胞膜上的凝血酶受体之一，与凝血酶结合，会降低凝血 酶活性，并加强凝血酶激活蛋白C的作用。因此，TM是使凝血酶由促凝转向抗凝的重要的血管内凝血抑 制成份。
翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)又叫做组胺释放因子，被认为在慢 性过敏性疾病中起重要作用。该家族蛋白具有2个特征结构域，即 TCTP-1([IFAEHGAHGAS]-N-[PAK〗-S-[GTA〗-E-[GDEV]-[PAGEQV]-[DEQGAV〗和TCTP-2 ([FLIV]-x(4)-[FLVH〗-[FY]-[MIVCT]-G-E-x(4,7)-[DENP]-[GAST]-x-[LIVM]-[GAVI〗-x(3HFYWQ])，这2个区域在不同物种间具有高度的序列同源性。1995年MacDonald等首次发现了这一蛋白家族的细胞外生物学
功能，通过对过敏病人体液中和遗传过敏症儿童淋巴细胞中存在的Ig-E依赖性组胺释放因子进行氨基酸末 端序列分析，发现组胺释放因子与小鼠和人的翻译控制肿瘤蛋白具有同源性，TCTP能够刺激人嗜碱性粒 细胞释放组胺，人血吸虫和疟原虫等多种寄生虫可分泌TCTP至宿主血液中，刺激宿主细胞释放组胺，从 而影响宿主免疫应答。此外，组胺还能够引起血管扩张效应，增强局部血流；使血管内皮细胞表面凝血酶 调节素TM的表达增高，它一方面能与凝血酶结合，降低其活性；另一方面能够活化蛋白C，活化的蛋白 C能够阻碍凝血因子Xa与血小板的结合，并刺激纤溶酶原激活物的释放而促进纤维蛋白溶解，还能在其 辅因子蛋白S的作用下灭活凝血因子Va和Vffla，这三条通路最终都能够引起抗凝血反应的发生。本发明旨 次发现了存在于日本七鳃鳗口腔腺中的TCTP模体蛋白新基因，并将其命名为L-250，而且本项目的日本 七鳃鳗口腔腺中TCTP模体蛋白-L250具有组胺释放因子活性，能够刺激嗜碱性粒细胞释放组胺，从而引 发一系列抗凝血级联反应的发生，提示L250蛋白将在临床抗凝治疗方面具有应用价值。
发明内容
本项发明在日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中发现了 L-250蛋白的开放阅读框，经对其mRNA全长的 进行钓取、测序、及cDNA克隆，对其重组蛋白在大肠杆菌中进行高效诱导表达。L-250重组蛋白生物学 活性涉及作为组胺释放因子，刺激嗜碱性粒细胞释放组胺。
本发明涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大 肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其刺激嗜碱性粒细胞释放组胺的生物学活性，以及抗凝血方面的应用。
本发明从日本七鳃鳗口腔腺中分离提取mRNA，利用前期构建的cDNA文库、EST库中获得的生物学 信息及mRNA全长钓取的测序结果选取开放阅读框设计引物,采用RT-PCR方法获得了 L-250蛋白的cDNA 及其序列，本发明还提供了 L-250蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达的蛋白及其序列，L-250蛋白具有组 胺释放因子的生物学活性，在临床上抗凝血方面有巨大的应用潜能。
L-250蛋白cDNA序列以其推导的蛋白质氨基酸序列如下
L-250蛋白cDNA序列519 bp，其蛋白质由172个氨基酸组成，含有一个TCTP模体，蛋白分子量为 22,408 kDa。
atg atc atctacaag gac ateetc acc ggg gac gag atgttcteg45
Met lie lieTyr Lys Asp lieLeu Thr Gly Asp Glu MetPheSer
gac ate tacate aag gagacg gcg gac ggc gec tgcttcgag90
Asp lie TyrLyslie Lys GluThr Ala Asp Gly Ala CysPheGlu
gtg gaa ggcatg gtg tecegg gtg gaa ggc gac ategac135
Val Glu GlyThrMet Val SerArg Val Glu Gly Asp lieAsp Aspgcg gtctttggcgg3gettcggcaggggg3g33tttgat180
Ala ValPheGlyGlyAsnAlaSerAlaGluGlyGlyGluPheAsp
tcg tcggagtcgtctacagtgtecggcgtggacategtgetc225
Ser SerGluSerSerThrValSerGlyValAsplieValLeuAsn
C3C ￡1犯ctgcagaccagettc鄉gagtacattgec270
His LysLeuGinGluThrSerPheSerLysGluLysTyrlieAla
tac ategectacattctgatggag315
Tyr lieLysAlaTyrMetLysThrlieLysGluAsnLeuMetGlu
aaa cacccggag卿gtgg幼cccttcatgactgetgetgec360
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卿gtt33agtcttaaagcaattc卿gatttccagtttttc405
Lys ValLysAspValLeuLysGinPheLysAspPheGinPhePhe
aca ggtgagageatg紛ccccgacggcatggtcgetcttctt450
Thr GlyGluSerMetGinProAspGlyMetValAlaLeuLeuGin
ttc cgcgaggacggaateacgccctacatgcttttcttc肪ggat495
Phe ArgGluAspGlylieThrProTyrMetLeuPhePheLysAsp
ggc ctgattgagaaatgc519
Gly LeuGlulieGluLysCys
L-250蛋白刺激嗜碱性粒细胞释放组胺生物学活性如下:
本发明采用大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3评价L-250蛋白释放组胺的能力，釆用r-biopharm公 司的酶免疫测定试剂盒检测培养液上清中组胺的浓度。将1 X 105 RBL-2H3细胞于邻孔板中孵育，直至细胞 汇合，L-250以不同的浓度梯度(0.3,4.8，10 pg/ml)，加至96孔板中孵育，不加蛋白的板孔作为对照，收集上 清，采用r-biopharm公司的酶免疫测定试剂盒检测培养液上清中组胺的浓度。测定的基础是抗原抗体反应。 结果显示，当L-250浓度为0.3 ^g/ml时，细胞培养液中组胺的量是对照组的2.2倍，之后随着L-250浓度 的增强，组胺的量也随之增大，说明L-250蛋白能够刺激RLB-2H3细胞释放组胺，并且在痕量下就可起 作用。L250蛋白的组胺释放因子活性，使其具有潜在的抗凝药用价值。
图I、本发明实验流程 图2、 pET23b质粒图谱
图3、重组pET23b-L251双酶切鉴定
图4、 L-250纯化蛋白SDS-PAGE
图5、 L-250蛋白剌激RBL-2H3细胞释放组胺实验结果
具体实施例方式
1. 总RNA的提取采用G旧COBRL的Trizol试剂。具体如下
(1) 取日本七鳃鳗口腔腺迅速置于液氮中研磨；
(2) 称取0.2 g腺体组织及分泌物，加lml Trizol试剂制备匀浆，4'C孵育5 min;
(3) 加0.2ml氯仿，盖紧盖后用力振摇15sec，然后置于冰上5 min;
(4) 4°C, 12000g，离心15min;
(5) 将上层水相移入另一离心管，加0.5ml异丙醇，并在冰上孵育10min;
(6) 4°C, 12000g，离心15min;
(7) 弃上清，在沉淀(含RNA)中加lml75。/。乙醇洗涤，旋涡混匀；
(8) 4°C， lOOOOg，离心5min，得到RNA沉淀；
(
9) 空气干燥后，用适量TE或无RNase水溶解备用。
2. 以自行设计的引物进行RT-PCR扩增，以获得日本七鳃鳗口腔腺L-250蛋白的cDNA;按以下条件进行 反转录反应42°C 20min, 99°C 5 min， 5'C 5 min
引物序列如下-
Pl- 5， -XXcatatgatcatctacaaggacatcctc-3，
P2: 5， -XXaagcttgcatttctcaatttccaggcc-3，
3. 将获取的目的cDNA与pET23b载体相连接，转化入克隆菌DH5 a后进行阳性转化子的筛选鉴定；为 产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET-23b(+)作为基因克隆的载体，克隆具体操作如下
(1) 目的基因的回收与测序目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit进行；对回收 DNA进行测序，此项工作由宝生物工程(大连)有限公司完成；
(2) 质粒的提取采用宝生物的质粒提取试剂盒进行；
(3) 目的基因DNA片段与载体pET23b的连接由于所设计的引物分别带有M/e I和III酶切位 点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b 的连接成为可能；
(4) 将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E.coZ/BL21中；
(5) 阳性转化子的筛选鉴定利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定。
4. 对阳性重组子进行终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为28'C,低温过夜诱导。
5. 对表达的重组蛋白进行组氨酸亲和层析纯化。
(1) 7000g离心15min收集菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每100ml的原培养液加4 ml冰冷的 1 X Binding Buffer的比例重悬细胞；
(2) 将上述样品置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；
(3) 4°C， 14000g，离心20min以去除细胞碎片；
(4) 上清以0.45um的滤膜过滤；
(5) 吸去His.BindColumn上室的贮液，并打开下面管口；
(6) 用10 ml 1 X Binding Buffer对柱子进行平衡；
(7) 将过滤好的上清液上样；
(8) 用10 ml 1 X Binding Buffer洗柱；
(9) 用10 ml 1 X Wash Buffer洗柱；
(10) 用5 ml IXEluteBuffer洗脱目的蛋白。
6. 重组蛋白剌激嗜碱性粒细胞释放组胺活性鉴定采用大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3评价重组蛋白 的组胺释放能力，采用r-biopharm公司的酶免疫测定试剂盒检测培养液上清中组胺的浓度。具体如下
(1) 1X1()S个RBL-2H3细胞于96孔板中孵育，直至细胞汇合；
(2) 将重组蛋白以不同的浓度梯度，分别为0.3， 4.8, 10ug/ml加至板中孵育，以不加任何蛋白的板孔 作为对照；
(3) 收集细胞培养液上清，并将其稀释10倍；
(4) 取100ul标准，质控及样品加至酰化板中，之后向板孔中加25ul酰化试剂；
(5) 加200ul酰化缓冲液至酰化板中，轻轻摇板并混合均匀，室温孵育15min;
(6) 取25"1酰化的标准，质控及样品到包被有组胺的微孔中；
(7) 力卩100ul组胺抗体到每一微孔中，混匀，室温孵育40min;
(8) 倒出孔中液体，用250y l洗涤缓冲液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复两次上述操作；
(9) 加IOO"I酶标记物到每一微孔中，充分混合并在室温下孵育20min;
(10) 洗板。重复(8)的操作；
(11) 加100ul底物/发色剂到每一微孔中，充分混合，室温暗处孵育15min;
(12) 加100ul反应终止液到每一微孔中，轻轻混合后于450nm处测定吸光值。
7. 使用r-biopharm公司专用的RIDA SOFT Win计算软件对结果进行评估。
权利要求
1.一条来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物具组胺释放因子活性的TCTP模体蛋白的cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列，特将此蛋白命名为L-250，其特征在于cDNA序列519bp长，其蛋白质由172个氨基酸组成，含有一个TCTP模体，蛋白分子量为22,408kDa，其cDNA序列推导的蛋白质氨基酸序列为M I I Y K D I L T G D E M F SD I Y K I K E T A D G A C F EV E G T M V S R V E G D I D DA V F G G N A S A E G G E F DS S E S S T V S G V D I V L NH K L Q E T S F S K E K Y I AY I K A Y M K T I K E N L M EK H P E K V E P F M T A A A KK V K D V L K Q F K D F Q F FT G E S M N P D G M V A L L NF R E D G I T P Y M L F F K DG L E I E K C *
2. 编码根据权利要求1所述的日本七鳃鳗口腔腺L-250蛋白的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如下1 atgatcatctacaaggacatcctcaccggggacgagatgttctcg 46 gacatctacaagatcaaggagacggcggacggcgcctgcttcgag 91 gtgggcacgatggtgtcccgggtgggcgtcgacgac 136 gcggtctttggcggaaacgcttcggcggggggatUgat 181 tcgtcggagtcgtctacagtgtccggcgtggacatcgtgctcaac 226 cacaaactgcaggagaccagcttcagcaaggagaagtacEittgcc 271 tacatcaaggcctacatgaagacgattaaggagaacctgatggag 319 aaaceicccggagaaggtggaacccttcatgactgctgctgccaag 361 aaggttaaagatgtcttaaagcaattcaaggatttccagtttttc 406 acaggtgagagcatgaaccccgacggcatggtcgctcttcttaac 451 ttccgcgaggacggaatcacgccctacatgcttttcttcaaggat 496 ggcctggaaattgagaaatgctaa 519
4. 一种重组质粒，其特征在于它含有权利要求2或3的基因。
5. 根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于所述基因连接于pET23b载体上。
6. —种基因工程菌，其特征在于它被根据权利要求4或5所述的重组质粒转化。
7. 根据权利6要求所述的基因工程菌，其特征在于其宿主细胞为E.coliBL21。
8. 根据权利1要求所述的日本七鳃鳗口腔腺L-250蛋白组胺释放因子活性在抗凝血方面的应 用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其中所述用于抗凝血方面的药物为抗凝药物。
全文摘要
日本七鳃鳗口腔腺分泌具组胺释放因子活性的TCTP模体蛋白-L-250的基因克隆与表达属于生物技术领域。涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆，与其对应的蛋白质氨基酸序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及L-250蛋白作为组胺释放因子，刺激嗜碱性粒细胞释放组胺。组胺能增强血管内皮细胞表面表达凝血酶调节素TM，一方面它能与凝血酶结合，降低凝血酶活性；另一方面能够活化蛋白C，从而触发抗凝血级联反应。这提示，L-250蛋白的组胺释放因子活性在抗凝及心脑血管疾病治疗方面具有潜在的应用价值。
文档编号C07K14/46GK101195656SQ20061013468
公开日2008年6月11日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年12月8日
发明者毓 吴, 晶 孙, 李庆伟, 王继红, 洁 白 申请人:辽宁师范大学