专利名称：分离纯化绿僵菌素的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离纯化的方法，特别涉及一种分离纯化绿僵菌素的方法。
背景技术：
绿僵菌素(destruxin)是真菌毒素，是一类环缩羧肽类化合物，主要由绿僵菌(Metarhizium)产生，其它真菌如壳座孢(Aschersonia)、链格孢(Altemaria)、单端孢(Trichothecium)及盘蛇孢(Ophiosphaerella)等也能形成不同种类的绿僵菌素。绿僵菌素有杀虫、抗病毒和抗癌等生物活性，经济价值很高。自从1961年，Kodaira首次分离出绿僵菌素A和B至今，35种绿僵菌素已经被分析鉴定。从Kodaira(1961)、Susuki(1970)到Pail等(1981)都是采用传统经典方法分离绿僵菌素。其方法第一步是萃取，将绿僵菌的发酵液离心或过滤去渣，然后调节其pH值到酸性，按其体积比溶剂∶发酵液＝1∶1的比例加入乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等溶剂萃取，将该过程重复多次，然后分离有机相和水相分离，保留有机相并通过旋转蒸发器或真空干燥器浓缩干燥，获得绿僵菌素的粗提物。第二步是层析，采用硅胶柱层析或氧化铝柱层析，用苯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷等溶剂，以不同浓度配比梯度洗脱，最后从不同馏份中可分离到不同的绿僵菌素，其中主要是绿僵菌素A、B和E，因为它们的含量较高，约占总绿僵菌素的85％左右。研究发展至今，虽然鉴定出多种绿僵菌素，但大多集中在结构分析和物理化学性质判定上，至于分离制备方法则仍然局限在繁杂的流程之中，整个过程需要使用大量的高毒溶剂，持续很长时间，制备成本非常高。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法克服了常规方法的上述问题，应用此种方法可以达到快速、环保、节省和高效分离纯化绿僵菌素的目的。
在达到上述目的中，根据本发明提供的一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法包括下列步骤(1)真菌发酵液经过离心或真空抽滤去除固体残渣，所得发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份通过旋转蒸发器浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。
吸附法预处理发酵液是通过吸附法除去发酵液中的杂质。真菌发酵液的组成非常复杂，从残余的培养基、菌组织，到蛋白质、色素和各种各样的代谢物质等。绿僵菌素的极性较低，且光吸收峰在波长200～220nm之间，当其溶于有机溶剂时呈无色透明液体，因此发酵液中吸收峰大于280nm的物质都可视为杂质，它们实际上是使发酵液颜色加深的物质。我们发现，利用吸附法预处理发酵液，能达到理想的去杂效果。其吸附法预处理发酵液的步骤是在下列条件下进行用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度15～35℃；振荡转速100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。而较好的吸附预处理条件是用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；吸附剂为高岭土或硅藻土；吸附剂用量吸附剂重量/发酵液体积＝2％；在24℃下，150转/分振荡吸附处理1小时。然后离心除去吸附剂。
由于超声波是一种纵波，它在液体中的传播会造成液体的压力变化而产生无数的微小真空泡，当这些真空泡受压爆破时，会形成强大的冲击，称为空穴效应，从而使萃取体系中分子增加碰撞机会，达到促进萃取效果的作用。因此，利用超声波促进萃取，能够减少溶剂用量、缩短萃取时间和降低萃取体系的温度以便减少目标物的损失。其超声波促进萃取绿僵菌素的条件是用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液∶乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率30～50kHz；温度-5～40℃；萃取时间0.5～2小时；而较好的条件是用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；超声波频率40 kHz；温度-5～10℃；萃取时间1小时。
经过萃取后浓缩而成的绿僵菌素粗提物是一个混合体系，既含各种绿僵菌素，又含许多杂质。因此，该粗提物直接采用制备色谱分离纯化绿僵菌素时，由于杂质含量高，耗时很长。减压层析可以进一步除去杂质和分离不同的绿僵菌素组分，经减压层析后再用制备色谱，则不光缩短了时间，提高了效率，也减少了溶剂用量，降低了制备成本。减压层析装置由砂芯漏斗、玻璃抽滤瓶和真空泵组合而成。其减压层析条件是硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积。
经过减压层析所得浓缩物进一步在制备色谱仪上分离纯化。其色谱分离纯化在以下条件下进行反相色谱柱；用以下体积比乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；柱温0～35℃；检测波长200～220nm；而较好的检测波长215nm，柱温4℃。收集各馏份后，浓缩干燥，再作HPLC分析，与标准对照，确定绿僵菌素种类。
在本说明书中所用的“真菌发酵液”一词是指从主要由绿僵菌(Metarhizium)产生，或其它真菌如壳座孢(Aschersonia)、链格孢(Alternaria)、单端孢(Trichothecium)及盘蛇孢(Ophiosphaerella)等获得的包括不同种类的绿僵菌素的液体。
使用本发明的分离纯化绿僵菌素的方法的有益效果是由于在萃取过程中采用了超声波促进萃取，从而省去了常规方法萃取过程需重复多次的繁杂，即节省了时间，又减少了溶剂用量，降低了制备成本；在层析过程中采用减压层析，即避免了使用苯等有毒溶剂，又为下一步骤制备色谱分离纯化除去了大量杂质，从而为制备色谱分离纯化省去了大量时间，也减少了溶剂用量，降低成本，达到了快速、环保、节省和高效分离纯化绿僵菌素的目的。
图1表示分离纯化绿僵菌素的方法流程图；图2表示吸附法预处理发酵液流程图；图3表示超声波促进萃取流程图；图4表示减压层析流程图；图5表示减压层析装置示意图；图6表示减压层析后制备色谱分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱；图7表示超声波促进萃取后制备色谱分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱。
1.砂芯漏斗2.样品层(其上盖滤纸)3.硅胶H层4.磨口套接或密封胶塞5.真空泵接口6.玻璃抽滤瓶具体实施方式
用本发明的分离纯化绿僵菌素的方法基本流程是如图1所示，(1)吸附法预处理发酵液真菌发酵液经过离心或真空抽滤去除固体残渣，所得发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)超声波促进萃取在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)减压层析对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份通过旋转蒸发器浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱分离纯化制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。
下列实施例将进一步说明本发明，但本发明不仅限于实施例。
实施例1将从金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)产生的液体经发酵后，用5000～8000转/分的离心机离心10～15分钟，去渣；或真空抽滤去渣；用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0，用高岭土或硅藻土作吸附剂，并按吸附剂重量/发酵液体积＝2％加入到发酵液中，在24℃下，150转/分振荡吸附处现1小时；然后用5000～8000转/分的离心机离心10～15分钟，去除吸附剂，保留发酵液，如图2所示；用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0，萃取溶剂为以下体积比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；用频率为40kHz的超声波在温度-5～10℃的范围中萃取1小时，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩，得到绿僵菌素粗提物，对绿僵菌素A和B的萃取效率达到95％以上，流程如图3所示；然后减压层析硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积，得馏分1或馏分2，然后用旋转蒸发器浓缩馏分去除溶剂，从馏分1中得到绿僵菌素A和B粗提物，或从馏分2中得到绿僵菌素C、D和E粗提物，对绿僵菌素A和B的回收率达到95％以上，其流程如图4所示，装置如图5所示。将各馏份浓缩干燥，再溶解并过滤后制备色谱分离纯化反相色谱柱；用以下体积比乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；并用215nm波长紫外光在柱温4℃检测绿僵菌素。各馏份浓缩干燥，再作HPLC分析，与标准对照，确定绿僵菌素种类。
实施例2按所述的相同步骤重复进行实施例1，但是吸附法预处理发酵液、超声波促进萃取、制备色谱分离纯化过程的条件分别改为(1)吸附法预处理发酵液的条件用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度15～35℃；振荡转速100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。
(2)超声波促进萃取的条件用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率30～50kHz；温度-5～40℃；萃取时间03～2小时。
(3)制备色谱分离纯化的条件反相色谱柱；用以下体积比乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；柱温0～35℃；检测波长200～220nm对比例1按实施例1所述的相同条件重复进行实施例1，但省去其中间(3)减压层析这一步骤，而直接将超声波促进萃取后得到的绿僵菌素粗提物，用高效液相色谱仪中进一步分离纯化。在HPLC图谱中，实施例1减压层析后制备色谱分离纯化，其测定绿僵菌素A在用时8分钟左右时测定峰面积达到最大值，绿僵菌素B在用时12分钟左右时测定峰面积达到最大值。而本实施例超声波促进萃取后制备色谱分离纯化中，其测定绿僵菌素A在用时50分钟左右时测定峰面积达到最大值，绿僵菌素B在用时60分钟左右时测定峰面积达到最大值，其具体分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱情况如图6、图7所示。
权利要求
1.一种分离纯化绿僵菌素的方法，该方法包括下列步骤(1)将真菌发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。
2.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(1)中吸附法的条件是用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度15～35℃；振荡转速100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。
3.按照权利要求2的方法，其中所述步骤(1)中吸附法的条件是用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；吸附剂为高岭土或硅藻上；吸附剂用量吸附剂重量/发酵液体积＝2％；在24℃下，150转/分振荡吸附处理1小时。
4.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(2)中用超声波促进萃取的条件是用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率30～50kHz；温度-5～40℃；萃取时间0.5～2小时。
5.按照权利要求4的方法，其中所述步骤(2)中用超声波促进萃取的条件是用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；超声波频率40kHz；温度-5～10℃；萃取时间1小时。
6.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(3)中减压层析的条件是硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积。
7.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(4)中制备色谱的条件是反相色谱柱；用以下体积比乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；柱温0～35℃；检测波长200～220nm。
8.按照权利要求7的方法，其中所述步骤(4)中制备色谱的条件是柱温4℃；检测波长215nm。
9.按照权利要求1的方法，其中所述真菌来自半知菌亚门丝孢纲，其种类包括绿僵菌、壳座孢、链格孢、单端孢及盘蛇孢。
全文摘要
本发明提供了一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法包括下列步骤(1)将真菌发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。此种方法可以快速、环保、节省和高效地分离纯化绿僵菌素，具有良好的社会经济价值。
文档编号C07K14/37GK101016331SQ200610132318
公开日2007年8月15日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者胡琼波, 任顺祥 申请人:华南农业大学