人源抗破伤风毒素单克隆抗体的制备和应用的制作方法

专利名称：人源抗破伤风毒素单克隆抗体的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及,'人源的抗破伤风毒素单克隆抗体的制备和应用；是申请曰为2003年1.2月30日，专利申请号为2003101221874的分案申请。二、 背景技术俗称的破伤风是一种由破伤风杆菌感染所引起的常见而且死亡率很高的 疾病。破伤风杆菌广泛地存在于土壤，灰尘，铁锈等处，很容易随着创伤， 如一般性外伤，妇女生产婴儿时的创伤等等感染人体。当人被破伤风杆菌感 染之后，在七天左右的潜伏期内，细菌在人体内大量繁殖并释放毒素。破伤 风毒素通过破坏人体神经细胞而对人造成致命的伤害。死亡率高达90%以上。 毒素一旦结合到神经细胞上，立即引发剧烈的神经症状，病人痛苦不堪，很 快死去。当病人被确诊为感染破伤风杆菌后，由于此时体内已有大量细菌和 毒素，使用抗菌素已来不及拯救病人生命，唯一有效的治疗方法是使用抗破 伤风毒素的抗体。抗破伤风毒素的抗体通与毒素进行中和反应而使毒素失活， 消除。虽然注射破伤风疫苗可以完全预防上述情况发生。但由于没有接种疫 苗或免疫效应过期从而导致破伤风杆菌感染的情况依然非常普遍。目前我国用于临床的抗破伤风毒素的抗体均为动物抗血清(主要为马的 抗破伤风毒素抗血清)。动物的抗血清作为人体的异物抗原，经常会引起人体 过敏反应。严重过敏者为患者总数的大约20%-30%。更为严重的是，越来越多 的动物的病毒经过变异开始感染人类，象疯牛症那样的情况一旦发生在马身 上，其后果不堪设想。因而这种产品亟待淘汰，而由人源的经过纯化的无病 毒等杂质污染抗体来取代。利用基因重组技术制备人源的抗破伤风毒素单克 隆抗体应是最理想的选择，因为这将从根本上克服市场现有抗血清的严重过 敏反应的困扰以及可能的由病毒污染造成的危害。利用传统的细胞融合技术制作人源抗体非常困难，因为常用的杂交瘤技 术在人-人杂交瘤技术尚无重大突破。其原因一方面是因为找不到理想的作为 融合用的人肿瘤细胞，现有的人-人杂交瘤也很不稳定，产生的抗体甚至不够 做检测用。另一方面人的细胞内有很多被抑制的致病病毒， 一旦被激活这些 病毒可以重新活跃而复制，从而对抗体产品产生污染，使用很不安全。如果 碰到很稀少的抗体，分离到这些抗体的浆细胞的机率就很小，因为能形成稳定杂交瘤的只是占所有生产抗体浆细胞的很少一部分，丢失很严重。这些因 素适得能用杂交瘤技术找到抗体的细胞株很难实现。另外一种制作抗体的方法是利用基因工程技术。基因工程抗体又称重组抗体，它是在充分认识抗体IgG基因结构与功能的基础上，应用DNA重组技 术在基因水平上对抗体分子进行拼接组装成的抗体.基因工程抗体既保留了 天然抗体的特异性和生物学活性,更可以通过工业化生产技术达到无限量纯 化的产品，具有广泛的应用价值。迄今世界上已成功构建多种基因工程抗体，包括几种基本类型，即人鼠 嵌合抗体(chimeric antibody,即将人IgG区与鼠的抗体可变区相连接，从 而在同一抗体分子中含有不同种属来源的抗体片段)，改型抗体(reshaping antibody)亦称为人源化抗体(humanized antibody,即为进一步减少融合抗 体中鼠源抗体引起的免疫反应，将融合抗体中鼠源可变区结构进一步改造)； 人源抗体(human antibody,即人类自身产生的抗体)等。其中人源抗体由 于是100%来自人的基因，不含有任何外来基因，因而给人应用不会造成过敏 反应，最适合于临床应用。抗体可变区其中只有部分序列具有抗体可变区的抗原结合特征，而其中 的大部分氨基酸序列不具有抗原结合特征。抗体可变区序列内分为骨架区 (framework region, FR)禾口互补决定区(complementary determining region, CDR，轻链氨基酸序列第24-34， 50-56， 89-97，重链第31-37， 50-65, 95-102)。 其中只有CDR区与抗原结合。其余的为支架结构，该部分的氨基酸序列的改 变仍可保留抗体与原有抗原的结合能力。根据这一原理人们构建人-鼠嵌合抗 体或CDR移植抗体(CDR-graf ted Ab)。该技术就是将鼠源抗体的CDR序列部 分移植并取代人源抗体相应的CDR序列，由此改造出的抗体尽管其氨基酸序 列大量变更，但仍旧保留与原有抗原相互作用的功能。利用基因工程技术生产人鼠融合抗体和人源化抗体(humanized antibody)的技术成熟，产品已市场化。迄今用于临床的多为鼠源性单克隆抗 体，但其可能对人引起的超敏反应严重地限制了它在临床的应用。利用基因 工程制备和生产完全的人源抗体(亦即全部为人基因)是世界上一项新兴技术 和产业。技术的关键在于如何获得能表达抗体肽链的基因片段。目前获得能 表达抗体肽链的基因片段使用的一种办法是从人体血液中将生产所需抗体的 B淋巴细胞挑选出来，代表技术如抗体库法(phage antibody library)。该法 是将人的体细胞基因中的全部抗体基因克隆在噬菌体外壳蛋白基因的上游， 使抗体蛋白片段与外壳蛋白的融合产物同时表达在噬菌体颗粒的表面。因而，只需利用固定化的抗原，就可以从抗体库中筛选出表面带有特异抗体片段的 呈示噬菌体克隆。但此法最大的缺点是其筛选的抗体对抗原的亲和力不高， 直接应用的临床价值不大。这是因为从人的体细胞的抗体基因库选出的抗体 都是初始的抗体，未曾经过与抗原接触而引发的基因突变，与抗原结合竞争 等自然筛选淘汰过程。另一种获得人源抗体基因片段的方法是改造小鼠的基 因，使其产生人源的抗体。还有人将人外周血白细胞与探针标记的抗原混合， 从而将其中生产抗体的浆细胞挑选出来，再从中获得抗体基因。抗体工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达。它 包括外源基因的克隆，转录，转译，加工，及表达产物的分离纯化等过程。 基因工程的表达系统可以分为原核和真核表达系统。完整抗体蛋白因是糖基 化蛋白质，只能用真核表达系统进行表达。真核表达系统包括酵母，植物， 昆虫和哺乳动物系统，其中哺乳动物系统表达系统最适合人源抗体的表达， 因为该系统保证表达的蛋白质的糖基化与人的完全一致。这点对抗体的临床 应用很重要，因为不正确糖基化的抗体缺乏一些应有的生物功能(如补体激 活，体内半衰期)，并可造成过敏反应。最近， 一些新技术陆续出台，希望能 通过酵母基因改造使其进行哺乳动物般糖基化。如果只表达抗体的可变区部 分，还可用原核系统，比如细菌来表达。利用哺乳动物系统表达可以在细胞水平进行，比如用人的骨髓瘤细胞， 亦可通过转基因动物进行。后者将抗体基因转入动物的卵细胞，使克隆出的 动物能够自动地表达克隆的抗体，并从奶或其它分泌物中大量地分泌出来。 该法避免了大规模培养细胞的工业化投资，具有很大的经济前景。近年来陆续已有几篇有关发明和制备人源抗破伤风毒素单克隆抗体的报 道。但这些抗体有的虽能与破伤风毒素结合，但不能中和毒素的毒性；有的 可以中和毒素的毒性，但效价不高。因而至今都没有真正具备商业开发价值 的人源抗破伤风毒素单克隆抗体。能够找到并能进行大规模生产的高效中和 破伤风毒素人源抗单克隆抗体仍是人们追求的方向。抗体中和毒素的效价越 高，其临床应用的价值越大。只有高效并能中和毒素的抗体才具有市场开发 的价值。抗体中和毒素的能力显然是由其化学结构决定的。遗憾的是至今人 们都不清楚什么样的结构可赋予抗体高效价。因而寻找高效抗体依然是可遇 而不可求的随机过程，其结果是不可预见的。高效抗体的筛选有赖于能否获得大量有关的资源。目前报道过的所有筛选抗破伤风毒素抗体的方法都只能获取生产抗体浆细胞的其中一部分，甚至 一小部分，因而筛选出高效价抗体克隆的几率很小。必须找到更好的方法， 以获得全部的生产抗体的浆细胞，从而提高筛选出高效价抗体克隆的几率。 三、发明内容本发明的主要目的在于克服现有产品存在的上述缺点，而提供一种人源 的抗破伤风毒素单克隆抗体的制备和应用，其基于目前我国所使用的用于临 床的抗破伤风毒素的抗体均为动物抗血清(主要为马抗破伤风毒素抗血清)， 动物的抗血清作为人体的异物抗原，经常会引起人体过敏反应，更为严重的 是，越来越多的动物的病毒经过变异开始感染人类，因而这种产品亟待淘汰， 而由人源的经过纯化的无病毒等杂质污染抗体来取代。 本发明的目的是由以下技术方案实现的。本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于，其为人源抗体，包 括抗体可变区，该抗体包括或不包括抗体的恒定区，该抗体具有中和破伤风毒 素的能力，编码该抗体可变区的序列如序列表1的氨基酸序列2和4所示。本发明编码权利要求1所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的可变区的氨基酸序列的核酸序列，其特征在于，该核酸序列如序列表1中的序列6 和8所示。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于，抗体可变区的氨基 酸序列包括所述序列或该序列的同系物或修饰物；其同系物为该抗体可变区 的氨基酸序列其同系性达到所述氨基酸序列的80%或以上，其所改变的产物仍 旧保留中和破伤风毒素的能力。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于，所述同系物和修饰 物还包括对该抗体蛋白质翻录合成后的修饰，使表达的抗体蛋白具有中和破 伤风毒素的能力，修饰以达到增强治疗或预防效应、提高在体外的稳定性或 对体内蛋白酶的抵御能力。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于对所述的氨基酸序列 进行改变、缺失或添加一个或几个氨基酸，而仍保留其中和破伤风毒素的能 力。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B,其特征在于，所述抗体的恒定区 是人源免疫球蛋白重链或轻链的恒定区中的任何一种；该重链恒定区是人源 IgG 、 IgM、 IgA、 IgE或IgD的恒定区，或包括有绞链区的重链恒定区或重链恒定区中的任何片段；所述轻链恒定区片段是人体免疫球蛋白轻链的K或 入的恒定区。本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的制备方法，其特征在于，其包 括利用基因重组技术的方法或化学合成的方法来制备和生产；其中，利用基 因重组技术的方法来制备，包括A、抗体基因的克隆与序列分析；B、抗体 基因表达载体的构建；C、在一个合适的系统或宿主中，将抗体基因表达D、 大量培养和扩增抗体表达宿主；E、对表达的抗体分离纯化F、对表达抗体 的定性和定量分析。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的制备方法，其特征在于，所述 抗体基因的表达载体是质粒载体或病毒载体、动物转基因的载体或者通用载 体；所述抗体基因载体转入一个合适的系统或宿主中加以表达，其中合适的 系统或宿主包括动物或植物的细胞，细胞株、细菌或酵母；该动物是转基因 动物。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的制备方法，其特征在于，还包 括检测抗体蛋白质或基因核酸的序列。本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体B在制备预防破伤风细菌感染药品中的应用以及在制备破伤风细菌感染的诊断制剂中的应用。本发明的技术内容包括以下方面本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其特征在于，其为人源抗体，包 括抗体可变区，该抗体包括或不包括抗体的恒定区，该抗体具有中和破伤风 毒素的能力，抗体可变区的基因和蛋白质序列如序列表1所示。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其特征在于，所述抗体可变区的 基因和蛋白质序列包括序列表1所示的同系物或修饰物；同系物为抗体可变 区的蛋白序列其同系性达到上述序列的60%或以上、70%或以上、80%或以上； 修饰物为对人源抗体氨基酸或它们的核酸序列通过取代、增加或截短进行改 变的产物仍旧保留人源抗体表达抗体蛋白具有中和破伤风毒素的能力。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其特征在于，所述同系物和修饰 物还包括对抗体蛋白质翻录合成后的修饰，使表达的抗体蛋白仍具有中和破 伤风毒素的能力，以达到增强治疗或预防效应、提高在体外的稳定性或对体 内蛋白酶的抵御能力。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区是人源免疫球蛋白重链或轻链的恒定区中的任何一种；该重链恒定区是人源IgG， IgM, IgA， IgE， IgD的恒定区，以及包括有绞链区(hinge region)的 重链恒定区或重链恒定区中的任何片段；所述轻链恒定区片段是人体免疫球蛋白轻链的K或A的恒定区。本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其包括 利用基因重组技术的方法和化学合成的方法来制备和生产；其中，利用基因 重组技术的方法来制备，包括A、抗体基因的克隆与序列分析；B、抗体基 因表达载体的构建；C、在一个合适的系统或宿主中，将抗体基因表达D、 大量培养和扩增抗体表达宿主；E、对表达的抗体分离纯化F、对表达抗体 的定性和定量分析。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗 体基因的表达载体是质粒载体、病毒载体、动物转基因的载体或者通用载体。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗 体基因载体可转入一个合适的系统或宿主中加以表达，适合的表达体系包括 动物和植物的细胞，细胞株、细菌或酵母；该动物也可以是转基因动物。前述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体的方法，其特征在于，还包括A、 检测抗体蛋白质或基因核酸的序列；B、检测抗体在试验动物体内对注射的破 伤风毒素具有抑制其毒性的功能。本发明的人源抗破伤风毒素单克隆抗体在制备预防破伤风细菌感染药品 中的应用。本发明的人源抗破伤风毒素单克隆抗体在制备破伤风细菌感染的诊断制 剂中的应用。本发明的有益效果是本发明提供了几种新的利用基因重组技术制造出的人源抗破伤风毒素单 克隆抗体，其基因和蛋白质序列与现有报道的不相同，该抗体的特点是具有 很高的中和破伤风毒素的能力。通过小白鼠试验证明，上述抗体可保护动物 抵御破伤风毒素的攻击。此外，抗体作为药物与国内现有的抗体比较，还具 有以下优点1、不会诱发明显的过敏反应目前国内使用的是马血清抗体，容易诱 发严重过敏反应。而此抗体是利用基因重组技术制造的人源抗体(百分之百的 人基因)，因而从理论上讲不会诱发明M过敏反应。2、 有很高的效价这些抗体具有远比过去报道高得多的中和毒素的能 力。用小白鼠体内试验证明本发明的抗体可完全保护小鼠抵御致死剂量的破 伤风毒素的攻击。3、 可以无限量地生产。4、 长效确保体内维持有效的药物浓度。5、 可以做到产品无动物病毒污染此抗体的生产过程可以采用世界上 最先进的无血清细胞培养技术生产，其生产流程中可以采取不使用任何动物制剂，因而产品避免了动物或人的病毒的污染。震惊世界的疯牛病,SARS等动物传染性疾病肆虐欧洲及世界各地的事实，使人们清醒地看到，使用动物血 清的生物制剂存在着巨大的污染隐忠，甚至严重威胁人类的健康，而本产品 在此方面具有优势。四、 附图和附表说明表1为本发明筛选分泌抗破伤风毒素抗体的人源浆细胞的部分总结。表2为本发明碘125标记的抗破伤风毒素抗体和人源免疫球蛋白IgGl在兔子体内的半寿期。表3为本发明基因重组抗破伤风毒素抗体对动物体内保护试验结果。

图1为本发明克隆若干人源抗破伤风毒素抗体可变区cDNA片段凝胶电泳图。图2为本发明构建的人源抗破伤风毒素抗体轻链的表达载体示意图。 图3为本发明构建的人源抗破伤风毒素抗体重链的表达载体示意图。 图4为本发明基因重组人源抗破伤风毒素抗体重链和轻链cDNA片段凝胶电泳图。图5为CH0细胞上清中所表达分泌的基因重组抗破伤风毒素抗体测定实验结果。图6为本发明单一及混合抗体对动物的保护作用图。五具体实施方式
本发明涉及几种新的人源抗破伤风毒素单克隆抗体，包括由这些新抗体 的基因和蛋白序列、生物功能、测定方法、生产制造这些抗体的方法，以及 利用这些抗体制备治疗破伤风杆菌感染的药物和用于制备诊断破伤风细菌感 染的制剂。本发明中应用的一些用语的确切定义1、 抗原能引起动物体内产生特异免疫反应的物质。2、 人源抗体人体合成出的抗体.人源抗体共分为IgG， IgA， IgM， IgD, IgE5大类。其中IgG又分为IgGl,IgG2， IgG3， IgG4亚类，它们的重链被相应 地命名为IgG 1, IgG 2， IgG 3， IgG 4。轻链则有K或A两个型。各种 不同类型的抗体的基因和蛋白质序列是不同的(详见下)。3、 抗体的基本结构(一)四肽链结构各类抗体的基本结构都是四条肽链的对称结构，包括二条相同的重链和二条相同的轻链。两条重链之间和两条轻链之间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。抗体的重链由400多个 氨基酸组成。根据重链抗原性的不同可将其分为5类，由它们组成的抗体分 别称为IgM， IgG， IgD, IgA， IgE.抗体的轻链各含有200多个氨基酸，轻链 有K或A两个型。(二)恒定区和可变区在抗体轻链和重链肽链的N端(含 有大约107-130个氨基酸残基)为抗体的可变区，分别称为重链的可变区和 轻链的可变区。这个区的氨基酸排列顺序随抗体特异性不同而有所变化，故 称可变区(即V区)。在多肽的C端，这个区的氨基酸数量和排列顺序等都比 较稳定，故称为恒定区(即C区)。所以，不同抗体的恒定区序列和结构彼此 之间区别不大，但其可变区的序列和结构区别很大。抗体的可变区是决定抗体特异性的部位。(三)抗体的绞链区抗体的重链的一个可转动的区域(即hinge区域)。5、 同源抗体源于同一种属动物的抗体，比如应用于人的抗体如若是由 其它人产生的抗体称为同源抗体。人对同源抗体不产生明显的免疫反应。如 果用于人的抗体是由不同种属动物产生的则称为不同源或异源抗体。由于不 同种属动物产生的抗体其抗原特征很不相同，因而人对异源抗体会产生明显 的免疫反应。6、 抗体的特异性 一种抗原与其所诱发产生的抗体之间的关系犹如钥匙与锁的关系，是相互针对的，特异的。7、 抗体与抗原结合的亲和力抗原与抗体抗原与抗体之间的亲合力是指 特异抗体与其所针对的抗原结合的紧密程度，亲合力越大表示结合的越紧密。8、 抗体和破伤风毒素的中和反应破伤风毒素的不同部位都可诱发产生 抗体。只有那些针对毒素的特殊重要部位产生的抗体，才可以通过与该部位 的结合而消除(亦即中和掉)毒素的功能。中和效价是指能中和固定量的毒 素所需抗体的数量。所需的抗体量越少，该抗体中和效价越高。抗体中和毒素的效价取决于抗体与毒素结合的紧密程度，是由抗体的化学结构决定的。9、 浆细胞浆细胞是激活的B细胞，能生产分泌抗体。每个浆细胞只能 生产针对一种抗原的抗体。10、 破伤风毒素破伤风毒素是破伤风杆菌释放的毒素，是一种分子量为150,000 Da大小的蛋白质，其病理作用是破坏人体神经细胞而对人造成致 命的伤害。11、 蛋白融合将两个不同蛋白质的基因片断相连接，其表达产物是一条由两个不同蛋白质彼此之间以肽键相连接的单链蛋白质。12、 免疫排斥反应动物对输入体内的其它不同种属动物的组织，器官或物质产生的免疫反应，甚至导致该组织器官或物质坏死。本发明提供了几种新的人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其特征在于，这些抗体是100%的人源抗体，它们的可变区的基因和蛋白质序列是新的，其结构包括抗体的可变区，(包括或不包括恒定区)，该抗体具有中和破伤风毒素 的能力，其中，可变区的基因和蛋白质序列如序列表1以及序列表1的同系 物和修饰物组成，其中恒定区是人源免疫球蛋白重链或轻链的恒定区中任何一种。本发明还提供了获取绝大部分生产抗体的浆细胞资源的方法，从而提高 筛选出高效价抗体克隆的几率，该方法的特征是利用浆细胞表面受体进行分 离获取。本发明还提供了制备和生产这几种人源抗破伤风毒素单克隆抗体的方 法，其中包括利用基因重组技术生产制造的方法。利用基因重组技术生产制造的方法主要技术包括(1)抗体基因的克隆与序列分析；(2)抗体基因表达 载体的构建。(3)在一个合适的系统或宿主中，将抗体基因表达；(4)大量 扩增表达抗体的宿主系统；(5)对表达的抗体分离纯化(6)对表达抗体的定性和定量分析。上述利用基因重组技术的方法来制备和生产人源抗破伤风毒素单克隆抗 体的方法，其中抗体基因的表达载体可利用质粒载体、病毒载体或其它通用 的载体，也可是动物转基因的载体。上述利用基因重组技术的方法来制备和生产人源抗破伤风毒素单克隆抗 体的方法，其中抗体基因载体可转入一个合适的系统中加以表达，其中适合 的表达体系包括动物和植物的细胞、细胞株或酵母、细菌，表达体系也可以是转基因动物。本发明提供了对上述人源抗破伤风毒素单克隆抗体的测试方法为，1、 检测抗体蛋白质或基因核酸的序列；2、同时检测抗体在动物体内对破伤风毒 素具有保护作用。本发明提供了上述这些人源抗破伤风毒素单克隆抗体在制备用于治疗破 伤风细菌感染的药物的应用，该抗体可用于制备预防破伤风细菌感染药物， 上述抗体可被单独或与其它成分一起制备各种剂型药物，或与其它药物一起 制备成混合药物或混合治疗制剂。本发明提供了上述这些人源抗破伤风毒素单克隆抗体在制备诊断破伤 风细菌感染的制剂的应用。本发明技术方案的简述本发明是由下述主要技术步骤实现的(1)筛 选出人的能生产分泌效价很高的抗破伤风毒素抗体的浆细胞；(2)从这些细 胞完整调出该抗体的可变区序列；(3)构建抗体基因适当的表达载体；(4) 将抗体基因载体放到适当的系统或宿主内表达出来，并选出稳定表达抗体的 克隆；(5)收集并纯化抗体；(6)通过体外和体内实验进一步筛选出那些能 高效中和破伤风毒素的抗体克隆；(7)大量扩增表达抗体的宿主；(8)纯化 制备抗体；(9)利用生产出的抗体制备用于治疗破伤风杆菌感染的药物和制 剂；(10)抗体用于体内证明其对动物对于破伤风毒素的保护作用。有关本发明的详细说明本发明提供了几种人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其特征在于这些抗体 是人源抗体，其结构包括抗体的可变区和恒定区，其可变区的基因和蛋白质 序列与现有报道的不相同，该抗体具有中和破伤风毒素的能力。上述的几种新的人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其抗体可变区的基因和蛋白质序列是由序列表1以及序列表1的同系物和修饰物组成；同系物指抗 体可变区的蛋白序列，其同系性达到上述序列的60%或以上、70%或以上、80% 或以上；修饰物指这种修饰包括对序列表1的氨基酸或它们的核酸序列通过 取代，增加或截短加以改变，但改变的产物仍旧保留该抗体的主要特征，即 表达的抗体蛋白具有中和破伤风毒素的能力。此外，同系物和修饰物还指那 些对抗体序列改变和修饰的目的是为了达到增强治疗或预防效应；或是为了 提高产品在体外的稳定性或对体内蛋白酶的抵御能力；或对专利抗体蛋白质 在翻录合成后所做的修饰，由这些变化衍生出的产物只要保留有本发明抗体的主要特征，也即表达的抗体蛋白仍具有中和破伤风毒素的能力，应属本发 明的范围。上述的几种新的人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其结构包括抗体的可变 区或抗体的恒定区，这些抗体可变区的基因和蛋白质序列是由序列表1以及 序列农1的同系物和修饰物组成，而这些抗体的恒定区可以是人源免疫球蛋 白重链或轻链的恒定区中任何--种，即可变区片段可与不同的人体免疫球蛋白重链恒定区或轻链的恒定区融合。这里重链恒定区所指的是人源IgG， IgM， IgA， IgE, IgD;这其中的IgG包括IgGl，IgG2， IgG3，IgG4;其中轻链的恒定区片段包括人体免疫球蛋白轻链的K或入的恒定区。这里重链恒定区所指的 是包含有绞链区(hinge region)以及CH1， CH2和CH3区域或其中的任何片段。对本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体的改变和修饰，如下的各种改变 和修饰应当包括在本发明之内。基本上说，如果对上述抗体的改变和修饰是为了达到增强治疗或预防效 应；或是为了提高产品在体外的稳定性(对体内蛋白酶的抵御能力)；或对本 发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体的蛋白质在翻录合成后所做的修饰，如改 变糖化或磷酸化成分，由这些变化衍生出的产物只要保留有本人源抗破伤风 毒素单克隆抗体的主要特征，亦即表达的抗体蛋白具有中和破伤风毒素的能 力，既应当包括在本发明之内。这种修饰包括对本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体的氨基酸或它们的 核酸序列通过取代，增加或截短来加以改变，但改变的产物仍旧保留本发明 人源抗破伤风毒素单克隆抗体的主要特征，比如亮氨酸可被异亮氨酸或颉氨 酸取代，酸性氨基酸之间(或碱性氨基酸之间，中性氨基酸之间，极性氨基 酸之间或非极性氨基酸之间，芳香性氨基酸之间)等等可相互取代。 一般认 为，只要改变后的产物与本发明的各种抗体的序列，尤其是可变区序列有80% 或以上相同，同时具有中和破伤风毒素的能力，就应属于本发明范围之内。另外，本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体蛋白质或它们的核酸序列亦 可在其侧链化学基团上加上其它化合物而保留本发明人源抗破伤风毒素单克 隆抗体的主要特征，如盐基，从而增加其可溶性；或同位素，如钴60，碘125， 硫35等等，或荧光物，或它们的核酸序列嵌合杂交，如毒素片段，以达到杀 伤靶细胞的作用。这些都是普遍运用的保留本发明人源抗破伤风毒素单克隆抗体主要特征的方法。本发明的上述人源抗破伤风毒素抗体的另外特征是它们可以在体内中和 破伤风毒素，这种中和破伤风毒素的能力远比过去报道的性能高得多，其可 在体内和体外高效地中和破伤风毒素。本发明实施案例提供了有关的试验结果用小白鼠试验证明，上述抗体可保护动物抵御破伤风毒素的攻击，具有 很高的效价。如果将两种不同的抗体混合使用，其中中和破伤风毒素的剂量 比单独使用一种抗体会进一步明显减少，治疗效果显著提高。本发明的人源抗破伤风毒素抗体是通过下述几个主要技术步骤实现的 (1)筛选出人源生产分泌抗破伤风毒素抗体的浆细胞；(2)从这些细胞完整 调出该抗体的可变区序列；(3)构建抗体基因适当的表达载体；(4)将抗体 基因载体放到适当的宿主内表达出来，并选出稳定表达抗体的克隆；(5)通 过体外和体内实验进一步筛选出那些能高效中和破伤风毒素的抗体克隆。 (6)测定这些抗体的核酸或蛋白序列。首先，本发明筛选获得产生并分泌抗破伤风毒素的B淋巴浆细胞是通过 下述独创方法而实现的首先从一新近用破伤风疫苗免疫的健康捐血者获得 外周血。经常规的方法分离出外周血中的主要B-淋巴细胞组份，比如通过密 度离心方法。分泌抗体的浆细胞由于表面带有某些特有的蛋白质，利用与这 些蛋白特异结合的方法可将这些浆细胞分离出来。比如浆细胞表面带有趋化 因子受体CXCR3。利用与CXCR3特异结合的配体IP-10通过细胞诱导移动实验 方法将浆细胞分离出。将浆细胞稀释并放到96孔板(平均每孔1-2个细胞) 对每个细胞扩增培养。浆细胞培养过程需要加入一些特殊的生长因子，比如 经同位素射线照射过的EL-4-B5细胞作为营养细胞，淋巴介素IL-2等。经过 若千天的培养，收集细胞的上清液。通过检测(比方用酶联免疫方法检测) 上清中有无与破伤风毒素的特异结合的抗体，筛选出一些能分泌抗破伤风毒 素抗体的浆细胞克隆。本发明使用的通过浆细胞表面受体获取产生抗体细胞 的方法相比过去曾经报道过的所有方法具有明显的长处，因为，理论上本发 明的方法可使我们获得儿乎全部的生产抗体的浆细胞，从而使筛选出高效价 抗体克隆的几率大大提高；而其他的方法，比如细胞融合法，都只能获取生 产抗体的浆细胞的其中一部分，甚至一小部分，所以这些方法使筛选出高效 价抗体克隆的几率明显减少。将抗破伤风毒素抗体的基因从这些浆细胞克隆复制出来可以利用多种不同的方法。比方本实施案例1中描述的方法，或其它灵敏的方法，将上述筛选出的浆细胞的信使RNA提取出来，经逆转录生化反应将全部信使RNA转变 成cDNA;利用设计的特殊引物(比如实施例2所述)将各个样本中抗体的重 链或轻链的可变区经灵敏的PCR方法(比方雀巢式PCR)分别克隆出来。当然， 也可将整个抗体的轻链和重链，亦即包括可变区和衡定区的整个基因片段克 隆出来，测定克隆的基因序列。本发明提供了如何制备上述人源抗破伤风毒素抗体的办法，包括化学合 成方法和基因重组方法。其中，化学合成方法可以是将抗体蛋白质先分作几 个片段分别进行合成，然后，再按其序列前后将这些片段相互连接起来。其 中蛋白质合成可以用固相或液相合成两种主要技术方法，这两种技术的具体 方法与一般目前通用技术方法相同，在此不再描述。利用基因重组技术生产 制造上述抗体的方法主要技术包括(1)抗体基因表达载体的构建；(2)在一 个合适的系统或宿主中，将抗体基因表达；(3)对表达系统或宿主的大规模 扩增；(4)对表达抗体的纯化分离；(5)对表达抗体的定性和定量分析。本发明构建上述抗破伤风毒素抗体基因的表达载体具体是通过下述方法 实现的首先选择适合表达人源抗体的表达载体。由于抗体是糖基化蛋白质， 真核细胞表达载体应是比较合适的，比如哺乳动物表达载体和酵母细胞表达 载体都很合适。表达抗破伤风毒素抗体基因的载体可用质粒载体，如实施例3 所示的抗体重链hCgl载体和抗体轻链hCK载体，它们都是哺乳动物细胞表达 的质粒载体，分别表达人源抗体重链的和轻链的恒定区。也可是病毒载体， 植物表达载体，酵母表达载体或其它通用的载体，或是转基因动物所用的载 体。载体中可带有各种调控基因片段，比如启动子(如CMV启动子)，和增强 子(如EU增强子)等等。为了筛选方便，载体还可装进针对不同抗菌素的阻 抗基因，如此抗Neomycin和抗Puromycin的基因。载体中还可加入其它的基 因片段，只要这些基因所达到的目的是有关本发明人源抗破伤风毒素单克隆 抗体的基因的表达，都应属于本发明的范畴。将克隆的抗体重链和轻链的可 变区基因用特定的限制性内切酶切下，'并将重链和轻链的可变区基因分别接 到表达载体中，与抗体的恒定区片段连接。如果克隆的是整个抗体的基因片 段(包括可变区和恒定区的整个基因片段)，则将这整个基因片段克隆到一个 适当的表达载体中。本发明还提供了为表达上述抗破伤风毒素抗体基因所必需的系统或宿主。上述构建好的表达载体通过电击法或其它方法被导入合适的宿主中进行 表达。抗体是糖基化蛋白质，故最好采用真核表达系统进行表达。比如，哺 乳动物表达系统就很适合人源抗体的表达，因为该系统保证表达的蛋白质的 糖基化与人的完全一致。另外通过基因改造的酵母系统(该酵母系统进行哺 乳动物般糖基化)也很合适进行表达。利用哺乳动物系统表达可以在细胞水平进行，比如常用的有CHO细胞，HEK293细胞，C0S细胞，NS/0或HELA细胞， 还可是昆虫细胞，如Rf9细胞，或者是酵母细胞，尤其是经基因改造后能进 行哺乳动物相同的糖基化的酵母等等。亦可通过转基因动物进行。后者将抗 体基因专入动物的卵细胞，使克隆出的动物能够自动地表达克隆的抗体，并 从奶或其它分泌物中大量地分泌出来。该法避免了大规模培养细胞的工业化 投资，具有很大的经济前景。比方本发明实施例4中采用的CH0细胞作为表 达上述抗破伤风毒素抗体基因所必需的宿主。它的长处是利用CHO表达生 产蛋白制剂是目前世界上最成熟和受欢迎的办法。大工业化生产工艺己成熟；CHO细胞可在无血清培养液中生长传代。这使得整个生产过程无需使用任何动 物制剂，从而避免了病毒污染；用CHO细胞生产蛋白质工艺己得到国际认可。 若干种用此方法生产出的蛋白制剂已完全达到临床合格标准。选出能稳定表 达分泌抗体，而且这些抗体能中和破伤风毒素的宿主细胞。经过初步筛选后， 进一步可通过检测载体的抗菌素阻抗基因的表达，或检测分泌抗体的能力。 具体方法见本文，举例如本发明实施案例4。本发明提供了如何将前述的抗破伤风毒素抗体基因以分泌蛋白形式生 产表达的方法，比如在蛋白基因的氨基末端加上先导序列，使表达的产物分 泌到培养细胞以外的上清液中。先导序列在蛋白质分泌过程中被截掉。序列 表1给出了一些先导序列的例子。如果是利用转基因动物来表达，则载体构 建可将抗体以分泌蛋白方式分泌到动物的排泄物，如乳汁中。本发明进一步提供了如何生产上述人源抗破伤风毒素抗体的方法，包括 了以基因重组，发酵技术为生产手段生产抗破伤风毒素单克隆抗体的方法。该方法是通过下述技术实现的原则上，上述制备人源抗破伤风毒素抗体的 方法，如利用哺乳动物细胞表达系统如CHO细胞，酵母宿主或表达系统，都可通过大规模来培养这些宿主达到批量生产抗体的目的。比方利用哺乳动物 细胞来生产抗体，可以利用滚筒式培养瓶，或纤维管式培养瓶，或发酵罐式 增加细胞培养规模.每项技术都有成熟工艺，也有成功产品为例，具体所用的设备及发酵工艺如一般通用方法，在此不做进一步说明。具体方法举例如 本发明实施案例6。本发明还提供了如何提高抗体产品产量的办法。目前有若干种不同的提 高基因表达水平的方法。举例如下如本发明实施例中使用的将Dhfr (dihydrofolate reductase)基因转入宿主细胞，利用提高Dhfr酶底物MTX (methotrexate)的办法筛选出高表达细胞株，以供生产使用。本发明列举 的实施例显示生产分泌出的抗体产量可达3毫克/109细胞每天分泌到1升培养 上清。通过进一步的筛选还可使产量提高更多。本发明的抗体基因还可通过转基因技术利用动物来表达生产。转基因动 物可以达到很高的表达水平，生产成本低。本发明进一步提供了如何将生产分泌的人源抗破伤风毒素单克隆抗体产物分离纯化的方法，具体是通过下述方法实现的许多种方法都可将抗体产品分离纯化。比如实施例7所采用的亲合层析分离方法。亲合层析可利用各 种不同的能与表达抗体特异结合的物质，比如实施例7中使用蛋白质A，将其 偶连到载体支撑物上。蛋白质A通过与抗体特异结合，达到理想的分离纯化 结果。除了蛋白质A还有其它一些能与抗体特异结合的蛋白质或模拟化合物 作亲合层析。除了亲合层析分离方法还有其它种方法可用来分离抗体产品，比 如灌注层析技术等等，在此不加详述，具体方法可参考有关资料。本发明还提供了分泌人源抗破伤风毒素单克隆抗体的鉴定和筛选方法， 通过体外和体内实验进一步筛选出那些能中和破伤风毒素，并能在体内对破 伤风毒素起保护作用的抗体及其表达宿主克隆。该项技术可通过下述方法实现抗破伤风毒素抗体可根据其化学结构特征和生物功能特征来利用各种方法进行鉴定。比方用酶联反应(ELISA)方法和同位素标记抗体竞争实验方法 (RIA)可以检测抗体本身的化学特征..利用与破伤风毒素的免疫中和反应(抗 原抗体中和反应)实验，或对注射破伤风毒素的动物保护实验等等方法可以 检定抗体的功能特征，以及中和毒素能力的大小。具体举例说，将转入抗体基 因表达载体的细胞培养并收集培养上清液。通过上述方法中来分析鉴定转基 因的细胞是否合成并分泌抗体。挑选出那些能够分泌抗体，而且该抗体可以中 和破伤风毒素的细胞株。这些细胞株很可能发生具有医用价值。这些鉴定方 法还可用来对生产的抗体质量和效价进行检定。上述许多方法，如ELISA，RIA， 抗原抗体中和反应实验都是常规应用的实验方法，在此无须详述，具体操作可参考如免疫学方法类书刊杂志或本发明的实施案例4和9。破伤风毒素动物 体内保护实验具体方法举例如本发明的实施例9。本发明的人源抗破伤风毒素抗体的应用该人源抗破伤风毒素抗体由于 能够高效中和破伤风毒素，可应用于制作治疗破伤风杆菌感染的各类药物和 药物组合物，以及用于制备诊断破伤风杆菌感染的各种制剂或制剂组合物，具体见实施例9所述。其中用于制备治疗破伤风杆菌感染的各类药物和药物组合物本发明的人源抗破伤风毒素抗体，由于能够高效地中和破伤风毒素， 可用来制备药物和药物组合物来治疗破伤风杆菌感染所造成的致命伤害。具 体举例见本发明的实施例9。本发明包括上述人源抗破伤风毒素抗体可被制备 成不同的药物剂型，单独或与其它成分一起。比如(但不限于)作为药品的 剂型可以是注射药品，口服药品或局部用药(包括直肠给药，或喷雾给药的剂型如鼻部喷雾或口吸喷雾等)的各种剂型。比方实施案例9是作为溶液静 脉给药的例子。本发明还包括上述的人源抗破伤风毒素抗体被制备成与其它 药物或方法一起的联合治疗制剂或技术。比方(但不限于)本发明的抗体可 与其它治疗感染药物一起使用，达到不仅抑制破伤风毒素，还杀死感染病源 的效果。本发明的人源抗破伤风毒素抗体作为药物有很多优势，其中包括1、由 于该抗体是人源抗体，不会引起明显的过敏反应；2、由于该抗体在体内的半 寿期很长，能够很好地维持药品有效浓度；3、由于其具有很高的中和破伤风 毒素的能力，因而用量少，治疗效果显著；4、可以通过采用无动物源污染的 生产工艺，从而大大减低由病毒污染造成的危害。以上优点显然大大地提高 了本发明的人源抗破伤风毒素抗体作为药物的临床应用价值。本发明的人源抗破伤风毒素抗体可用于制备诊断破伤风杆菌感染的各种 制剂或制剂组合物。比方(但不限于)将抗体同位素标记后用于破伤风杆菌 感染的诊断。本发明还包括上述的人源抗破伤风毒素抗体被单独或成与其它 药物，制剂或方法一起制备的联合诊断制剂或技术。实施例1:获得和筛选产生分泌抗破伤风毒素抗体的人源浆细胞。从一新近用破伤风疫苗免疫的20岁男姓健康捐血者获得100毫升的外周 血。该捐血者无任何慢性病史，捐血时无任何疾病症状，15天之前接受破伤 风疫苗免疫，除此而外在过去的一年中未注射任何其它疫苗。将该全血经EDTA 处理，并通过Ficoll的密度梯度半小时离心，3000转/分钟。将Ficoll中间层吸出，从而获得血液白细胞。将白细胞悬浮液放到细胞培养瓶于37度保温1小时，以除去粘附在塑料表面的单核细胞。将抗CD19抗体偶联的磁珠 (Dynabeads)与清洗过的未粘附的白细胞混合(20个磁珠/lX10"细胞/毫升) 并在4('C在旋转器中保温30分钟。利用磁场力将磁珠分离。将磁珠上的B淋 巴细胞按照Dynal产品提供的方法分离下来。将所有的B细胞悬浮到300微 升培养液里，加到tmnswell膜板(Bacton & Dicson)的上孔里。该孔膜的 下面加上趋化因子，比如IP-10。经保温3小时收集由上孔移动到下孔的浆细 胞。将收集到的浆细胞稀释并放到96孔板(平均每孔卜2个细胞)对每个细 胞扩增培养。经过10天的培养，收集细胞的上清液。通过酶联免疫方法检测 上清中有无分泌的抗破伤风毒素的抗体。酶联免疫反应法简述如下将破伤 风毒素(北京生物制品所)过夜吸附到酶联反应板上。与含有牛乳蛋白的缓 冲液保温以除去了非特异结合。之后，.将上述收集的细胞培养上清液加到酶 联反应板上，共同保温2小时。清洗后加酶标二抗(鼠抗人IgG抗体)并保 温2小时。清洗除去未游离的二抗，加入酶底物对结合的酶标二抗显色。酶 标显色的结果表示上清标本中抗破伤风毒素抗体的含量。利用此法筛选出一 些能分泌抗破伤风毒素抗体的浆细胞克隆总结如表1。从200个克隆中共发现 23个浆细胞分泌抗破伤风毒素抗体。其中两个克隆产生的抗体与毒素结合的 效价特别高(也即结合的浓度很低)。实施例2:克隆人源抗破伤风毒素抗体可变区基因片段。 首先将实施例1筛选出的浆细胞克隆的细胞用含有NP-40， RNA酶抑制剂 的溶解液在4"C溶解10-30分钟。将细胞溶解液与含有逆转录酶的缓冲液混合。 通过逆转录生化反应将每个克隆的mRNA分别转变成cDNA库。具体如下逆 转录反应的条件为65"C3分钟，缓慢降温至22"C，保温3分钟。加入新鲜的 含有逆转录酶的缓冲液。38"C保温100分钟。之后，65"C保温以使逆转录反 应终止。设计一组引物如下所示，以克隆抗体的轻链和重链。VH引物包括GGG AAT TCC CAT GC;A CTG GAC CTG GAGGG AAT TCA TGG ACA TAC TTT GTT CCA CCCA AGC TTG CTC YTG GAG SAG GGY GCC AGG GGG AAVK恒定区引物包括TTA GGA TCC ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TCC AGC TTC ATC AGA TGG CGG GAA GATV引物包括ATG GCC TGG GTC TCC TTC TAC CTA ATG GCC TGG ATG ATG CTT CTC CTCGAG TCA TTC TCG ACT GCT AGC CAC AGT ACG TAG GAC GGT SAS CTT GGT CC 利用上述引物和dNTP混合物将各样品中抗体的重链或轻链连带前导序列 复制出来。5'-末端及3'-末端分别接上限制性内切酶切点。PCR条件如下 94 "C 1分钟，50 "C 2分钟，72 °C 2分钟，共5个循环，之后72 "C 4分钟； 接下来94 nC 1分钟，55 °C 1分钟，72 °C 2分钟，35个循环，最后72 "C 4分 钟。利用设计的另一组引物可以把抗体轻链和重链的可变区克隆出来。图1 显示的是克隆出的若干个人源抗破伤风毒素抗体可变区的DNA片段(PCR产物) 的凝胶电泳图。复制出的重链和轻链的可变区大小约为440bp。复制出的抗体 重链和轻链大小约为1400bp。将抗体的重链和轻链的基因分别接到pCR2. 1质粒载体(INV工TROGEN)DNA 中。利用抗菌素Ampicillin筛选出克隆成功的菌株。制备该菌株的质粒载体。 测定该质粒载体中克隆的基因序列。序列表l显示的包括抗体B和抗体D重链可变区序列和轻链可变区序列。实施例3:构建人源抗破伤风毒素抗体的表达载体。图2和图3为抗体重链载体hCgl和抗体轻链载体hCK示意图。在这两个 载体中我们选择以CMV为启动子，以EU为增强子。载体的大小约为7000bp。 在这两个载体中，抗体IgG重链的恒定区IgGJ和轻链的恒定区k的cDNA已 分别接到载体CMV为启动子的F游。将上述实施例1所克隆出并接在pCR2. 1 质粒载体的抗体重链和轻链的可变区基因片段用特定的限制性内切酶切下， 并分离纯化。将重链和轻链的可变区基因分别接到两个不同的表达载体中 轻链的可变区基因接到抗体轻链载体hCK中，与其带有的人源抗体轻链的k 恒定区基因片段的5 '末端相连；重链的可变区基因接到抗体重链载体hCgl 中，与其带有的人源抗体重链的IgGJ恒定区基因片段的5 '端相连。不同的 细胞克隆出的抗体被分别命名为QA (即轻链A)和ZA (即重链A) ; QB和 ZB; QD和ZD,等等。图4显示的是基因重组的人源抗破伤风毒素抗体重链和 轻链cDNA片段的凝胶电泳图。实施例4 :人源抗破伤风毒素抗体基因在真核细胞CHO里的表达。 具体方法如下将接好的人源抗破伤风毒素抗体重链基因载体和抗体轻 链基因载体，比如载体QD和载体ZD的cDNA线性化后，用电击法转入CHO细胞内。由于抗体重链载体hCgl带有抗Gentamycin的基因，所以用Gentamycin (G418)来筛选抗体重链的表达；由于抗体轻链载体hCK带有抗Puromycin的 基因，所以用Puromycin来筛选抗体轻链的表达；经过用G418(l毫克/毫升)， 和Purimycin (2. 5微克/毫升)3-4周的筛选，筛选出同时对Puromycin及 Gentamycin都不敏感的细胞株，冷冻收藏.该细胞株为稳定表达细胞克隆。这 些细胞克隆有可能生产完整的抗体。为确认这一点，还需要作进一步检测， 如实施案例5。实施例5 :鉴定基因重组并表达分泌的抗体是由重链和轻链组成的完整 抗体。将上述细胞株B和D培养两周后，分别收集各自的细胞培养上清。通过 ELISA方法鉴定转基因的细胞是否合成并分泌抗体。具体说来，将收集的培 养上清液与制备好的鼠抗人IgG 1抗体和鼠抗人y1-重链抗体利用酶联反应作 检测试验。图5显示克隆D和B的基因己被插入CH0细胞(仓鼠细胞)基因 并成功表达，合成的抗体蛋白已分泌到培养液中，因而可以与抗人体IgG抗 体呈剂量依赖的结合竞争。另外，通过凝胶电泳和SDS-page试验证实，分泌 抗体的分子量在不还原的条件下为75kDa，在还原的条件下显示两条带，其分 子量分别为50kDa和23kDa (结果为显示)，说明了分泌的抗体是具有轻链和 重链的完整体。实施例6 :利用无血清培养液制备生产基因重组的人源抗破伤风毒素抗体。为了获得高产细胞株，我们将Dhfr基因转导到表达抗体的CHO细胞。利 用提高培养液中MTX的办法筛选出高表达细胞株。将CH0细胞克隆D和B在 含有5%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。每3天更换一次培养液。在此过 程中逐渐将RPMI1640培养液用INV工TROGEN的无血清培养液取代，并将小牛 血清的浓度减至1_2%。此后将该CH0细胞克隆D和B在2升滚筒式培养瓶中 用无血清培养液在37('C分别大量培养。其间不断部分更换培养液，并将细胞 浓度维持在大约0.5-lX107毫升。收集培养上清液，将其作超滤浓縮，然后4 "C短期保存；或将其冷冻干燥，于-20"C长期保存。实施例7:分离纯化表达生产的人源抗破伤风毒素抗体。 将实施例6中收集的CH0B和CHOD细胞培养上清液经超滤浓缩后(过滤 分子大小为IO， 000 Da)。将该抗体浓縮液通过蛋白质A制备的亲和柱层吸方法进行纯化。首先将CL-4B-Protein A (Pharmacia)缓慢装进层析柱，并用 PH7.0的磷酸(Tris)缓冲液平衡。将该抗体浓縮液缓慢加到层析柱里，室温 下保温10分钟以使抗体与之结合。用pH3. 0的0. 1M甘氨酸(Glycine)缓 冲液将抗体洗脱下来(洗脱速度100-150厘米/小时)。之后再用pH2. 0的0. 1M Glycine缓冲液将抗体进一步洗脱。通过抗人体IgG的ELISA方法测定，从 300毫升上清中得到100毫克人源抗体。经分离纯化测定，CHOB和CHOD细 胞生产分泌抗体的产量为每1X10"细胞每天分泌20微克。因为该克隆细胞对 Puromycin和Neomycin都不敏感，说明表达的蛋白是由重链和轻链嵌合蛋白 组成的完整抗体。实施例8:抗破伤风毒素抗体在动物体内的药代动力实验。 50微克纯化并用碘125标记的抗破伤风毒素的抗体，或人源免疫球蛋白 IgGl (Sigma)由左耳静脉分别打入体重2公斤的兔子体内。每隔1小时从兔 子的右耳静脉取5毫升血。从第二天开始，改为每隔1-2天抽从后者取一次 样。通过测定同位素检测血液中人的免疫球蛋白重链的含量。如下面表2所示，r。标记的抗破伤风毒素的抗体蛋白和人源的免疫球蛋白igGi的半寿期相同，都大约为110小时。由于已知人源免疫球蛋白IgGl在人体内的半衰期为 21天，因而本发明的抗破伤风毒素的抗体蛋白其体内半衰期应与人源免疫球 蛋白IgGl相似，应是目前临床所用的马的抗血清的半衰期很多倍。 实施例9 :人源抗破伤风毒素抗体对动物的保护作用试验。 将蛋白质A亲和层析分离纯化的抗体B和D粗制备物对动物进行保护作 用的试验，并与目前临床唯一使用的药品抗破伤风牛血清制剂的疗效进行比 较。举例如下将破伤风毒素标抗(目前临床使用的药品即抗破伤风毒素的 马血清制剂)4.5IU/ml(由北京生物制品所检定)和破伤风毒素(武汉生物制 品研究所)分别溶于硼砂缓冲液。取试验小白鼠若干，每组三只，共5组。 将未经纯化的上述细胞D分泌的上清液冷冻干燥物溶于蒸溜水。以不同浓度 (0.1 mg/kg-10 mg/kg，蛋白质/体重)的含有人源抗破伤风毒素抗体的细胞 B和D分泌上清与固定量的破伤风毒素混合。作为对照，将0.5IU/ml的破伤 风毒素标抗D与同样剂量的破伤风毒素混合。将各混合物在37 T结合1小时 之后，分别给小鼠肌肉注射(0.4ml/只)。每天上午，下午各观察一次，记录 小鼠发病与死亡情况。结果(表3)显示，目前临床使用的药品即抗破伤风毒 素的马血清制剂(破伤风毒素标抗)治疗组在69小时之后动物全部死亡。而以本发明的人源抗破伤风毒素抗体治疗的动物在治疗剂量为0.4 mg/kg体重 或以上时全部正常，不发病。本发明的人源抗破伤风毒素抗体百分之百地保 护动物防御致死量的破伤风毒素的攻击。重复试验得到相同的结果。初步实 验还显示如果将抗体B和D混合注射，其中和同等量破伤风毒素所需剂量比 单纯使用一种抗体所需剂量减少3-10倍，重复实验得到相同结果。初步实验还显示，本发明的基因重组的人源抗破伤风毒素抗体的效价相 当高，实验结果显示抗体粗制品的中和毒素的效价己相当于31,000 IU/克蛋 白质粗制备物。本试验使用的抗体是利用含有牛血清培养液生产的，并只经 过蛋白质粗制备物中含有大量的非特意免疫球蛋白。所以本发明的人源抗破 伤风毒素抗体真实的中和效价应是31， 000 IU/克的至少若干倍，效价相当高。 图表说明表l:筛选分泌抗破伤风毒素抗体的人源浆细胞的部分总结克隆名称与抗体重链反应结果与破伤风毒素抗原 反应结果选做基因重组抗体 的克隆1A3+++1C8+++1H5+~ ——一2B3+++2D6+++2E3+——2G5++——表2:碘'"标记的抗破伤风毒素抗体和人源免疫球蛋白IgGl在兔子体内的半寿期注射蛋白质名称在兔血浆中的半寿期(小时)人源抗破伤风毒素抗体110人源免疫球蛋白IgGl110人源趋化因子蛋白质0.25表3:基因重组抗破伤风毒素抗体对动物体内保护试验结果 破伤风标抗4.5IU/毫升，北京生物制品检定所 破伤风毒素2001年6月，武汉生物制品研究所试验动物普通小鼠约16克/只 (试验一)发病与死亡情况-正常 +++:发病程度由轻到重表示为+， ++， +++， ++++; :死亡条件在通带中幅度响应单调减小。
11. 一种用于抽取数字信号处理系统的取样信号的抽取滤波装置，包括CIC抽取滤波器，用于抽取滤波取样信号以下变频取样信号；内插二次多项式滤波器，用于单调增大CIC抽取滤波器的输出以补偿 由CIC抽取滤波器引起的通带下降；多级半带滤波器，包括至少一个用于1/2抽取从内插二次多项式滤波器 输出的信号的改进型半带滤波器，所述多级半带滤波器抽取从内插二次多项 式滤波器输出的信号以下变频该信号；和可编程FIR滤波器，用于补偿从多级半带滤波器输出的信号的通带下降。
12. 如权利要求11所述的抽取滤波装置，其中，所述CIC抽取滤波器包括积分器，用于以1/(l-Z")L积分取样频率； 抽取器，用于以抽取因子M抽取积分器的输出；和 梳状滤波器，用于以(1-Z'，梳状滤波抽取器的输出； 其中，所述CIC抽取滤波器具有如下给出的系统函数/f(Z):(丄H ,)丄 細卜Z-'这里，M是整数抽取因子，和作为差分延迟的R是正整数。
13. 如权利要求11所述的抽取滤波装置，其中，所述内插二次多项式 滤波器具有如下定义的系统函数= 1_ (i + CZ-' + Z-")这里，I是正整数，和c是实数，它是随着抽取率而变化的滤波系数。
14. 如权利要求11所述的抽取滤波装置，其中，所述改进型半带滤波 器具有如下给出的技术指标通带f€
阻带f€
脉动对于通带和阻带分别为5,和52, 5,>>S2 条件在通带中幅度响应单调减小。
15. 如权利要求ll所述的抽取滤波装置，其中，所述多级半带滤波器图3为本发明构建的人源抗破伤风毒素抗体重链的表达载体示意图。图中CMV为启动子，EU为增强子。载体的大小约为7000bp. VH为重链的可变区， CH为重链的恒定区，Nhe I和xho工所标之处为该限制性内切酶的切点， Ampiciliin和Neomycin为该抗菌素阻抗基因。图4为本发明基因重组的人源抗破伤风毒素抗体重链和轻链cDNA片段的 凝胶电泳图。显示的是的两个人源抗破伤风毒素抗体轻链和轻链的cDNA片段(PCR产物)的凝胶电泳图。复制出的重链和轻链大小分别为1. 4kb和0. 7kb。 图中所示从左到右依此为(1) 100bp分子标准物，(2)B抗体重链cDNA片段，(:3)D抗体重链cDNA片段，U)B抗伴轻链cDNA片段，(5)D抗体轻链cDNA 片段，(6)质粒载体。图5为本发明CH0B和CH0D细胞上清中所表达分泌的基因重组抗破伤风 毒素抗体的测定实验结果。将收集的细胞CH0B和CH0D培养上清液加到酶联 反应板上，与制备好的鼠抗人IgG 1抗体作结合试验。酶标显色的结果表示 上清标本中人源抗体的含量。显示的是克隆抗体D (圆形)和B (三角形)基 因转导的CH0细胞(仓鼠细胞)所表达的人源抗体蛋白已分泌到培养液中， 因而可以与抗人体IgG抗体呈剂量依赖的结合竞争。图6为比较单一抗体对动物的保护作用图。给每组小鼠(每组2支)肌 肉注射同样致死剂量的破伤风毒素，隔夜后分别给小鼠腹腔注射抗体D(125ng/只)或不同剂量的抗体D的混合物(1: l重量比)。图中显示的是能 够保护动物不致死所用的抗体剂量。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而己，并非对本发明作任何形式上 的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。序列表1:本发明的人源抗破伤风毒素抗体重链和轻链可变区的核酸及氨基酸序列〈110〉龚小迪〈120〉人源抗破伤风毒素单克隆抗体〈160〉 S〈210〉 1 '〈211〉 143〈212〉 PRT〈213〉人(human)<220>〈221〉 V-region <222>〈223〉人源抗破伤风毒素单克隆抗体D的轻链可变区蛋白质的氨基酸序列(PS. QD) 〈400> 1Met Asp Arg Gly A la Leu A la His Leu Leu (;ly Leu Leu L eu L eu Tip 1 5 10 15I， Arg Gly A la Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30Leu Ser Ala Ser V al G丄y Asp Arg VaL Thr ll.e lhr Cys Arg Ala Ser 35 40必Gin 〖le I le Gly Ser Tyr Leu Asn Tip Tyr Gin Gin lys Pro Gly Lys 50 55 60A la Pro Lys Leu Leu I le His Thr Ala S er S er Leu Gin Ser Gly V al 65 70 75 80Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr L eu T hr 85 90 95lie S er S er L eu Gin Arg Glu Asp I le A丄a T hr Ty.r Tyr Cys Gin Gin 100 105 110Ser Tyr S er Gly L eu Arg Trp T hr Phe Gly Gin Gly Thr Lys L eu Glu 1]5 120 125lie Lys Arg T hr Val Ala Ala Pro Ser V al Hie I le Phe Pro Pro 130 135 140 143〈210〉 1〈211〉 142〈212〉 PRT〈213〉人(human) ' <220〉〈221〉 V-region <222>〈223〉人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的轻链可变区蛋白质的氨基酸序列(PS. QB) <400〉 2^et Asp ^et Glu Phe Leu Val Gin L_eu Leu Phe Val Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15Leu Pro Asp lie Thr Gly Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr20 25 30 'Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser35 40 45Gin Ser lie Ser Ser Asn Leu Aia Trp Tyr Gin G丄n Lys Pro Gly Gin 50 55 60Thr Pro Arg Leu Leu lie Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Asn Gly lie 65 70 754 80Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110Tyr Asn Asn Gly Ser Gly Ala Phe Gly Gin Gly Thr Ser Trp Arg Ser 115 120 125Asn Glu Leu Trp Leu His His Leu Ser Ser Ser Ser Arg His 130 135 140 142〈210〉 3〈211〉 147〈212〉 PRT〈213〉人(human) 〈220〉〈221〉 V-region <222〉〈223〉人源抗破伤风毒素单克隆抗体D的重链可变区蛋白质的氨基酸序列(PS. ZD) <400> 3Met Glu Leu Gly Leu Ser T'rp Val Phe Arg Ala Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45Ser Arg Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60Glu Trp Val Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr —li—e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95Thr Leu Phe Val Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110Tyr Tyr Cys A丄a Arg Asp Gly Ser ^eL VaL Arg Gly Asp Gly Arg Asp115 120 125Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro 147〈210〉 4〈211〉 148〈212〉 PRT〈213〉人(h咖an) <220〉<22i〉 V-region <222〉〈223〉人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的重链可变区蛋白质的氨基酸序列(PS. ZB) <400> 4Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15Val Gin Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Asn Leu Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45Asn lie Tyr Ala lie Ser A印Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60Glu Trp pt Giy Gly Val lie Pro lie His Gly Ala Vai His Tyr Ala 65 70 75 80Gin Lys Phe Gin Asp Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95Thr Ala Tyr Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala 100 105 110Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Thr Thr Lys Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Thr 115 120 125Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro 148〈210〉 5〈211〉 430〈212〉 CDS〈213〉人(human) <220><22i〉 V-region <222><223>人源抗破伤风毒素单克隆抗体D的轻链可变l^核酸序列(NS. QD) <400> 5Atggacaggggggccctggcgcaccttctg ggtctcctgc tactctggctccg鄉tgcc60agatgtgacatccagatgacccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt鄉,c卿120gtcaccettcacttgccgggcaagtcagatc attggcagtt attta犯ttg gtatcagcag180犯accagggaaagcccctaagctcctgatc cataccgcat ccagtttgca卿tggggtc240ccaccasggttcagtggcagtggatctggg acag&tttca ctcttaccatcagcagtctg300caacgtg肌gatattgcaacttactactgt c犯cagagtt acagtggcctcaggtggacg360ttcggcc犯ggg3CC犯g'Ctggagatc狐i cgaactgtgg ctgcaccatctgtcttcatc420ttcccgccat430〈210〉 3 〈21i〉 426 〈212〉 CDS 〈213〉人(human) <220〉<22i〉 V-region <222><223>人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的轻链可变区核酸序列(NS.QB)〈400〉 6/Uggacatggagttcclggt gcagcttctcttcgtcctgctactctggctcccagatatc60sctgg卿gatagtgatgac gcagtctccagcc(iccctgtctgtgtctcc120gccaccctctcctgcagggc cagtc卿gtattagcagcaacttagcctggtatcagcag180aagcctggccagactcccag gclcctcatctttggtgcatccacc鄉gc240ccagccaggttcfigtggcag tg'g'gtatggg a,c卿gttcacgctcaccattagcsgcctg300csgtctg犯gattttgcagt Uattactgtataatgggtc cggggcgUcggcc鄉ggaccagctggag atc肌Eicg肌ctgtggctgcaccatctgtxttcatcttcc420cgccat426〈210〉 7 〈211〉 442 〈212〉 CDS 〈213〉人(human) <22()〉<22i〉 V-region<222〉<223>人源抗破伤风毒素单克隆抗体D的重链可变区核酸序列(NS. ZD)<400〉7Mggagcttgggctgagctgggtttttcgcgctgctctttccagtgtcag60gtgcagctggtggagtctggggg鄉tgtggtccagcctgg'g鄉tccctgagactctcc120tgtgUggctctggattcsccttcagtcgttatgctatgcattgggtccgccaggctccg180ggc卿gggctggagtgggtggcatc犯catcatatgatggaggcaataaatactacgca240gactccgtga兆ggccgsUcaccatttccagagacaattcttatttgtg300gcctg鄉gcag兆'gacacggctgtttattactgtgc眺卿tgggagt3603tggttcgcgg卿cgg卿gg'￡ltg3CttXtggggcc鄉'g幼CC3tggtcaccgtctcc420tcagctagcaccaagggccca t442—eg gtc ttc ccc ctg gca ccc 'tec tec gca age ttt ata aag ggc gaa ttc 〈210〉 8 〈211〉 445〈212〉 CDS . 〈213〉人(human) <220〉<22i〉 V-region <222〉<223>人源抗破伤风毐素单克隆抗体B的重链可变区核酸序列(NS. ZB) 〈400〉 8Atgg￡LCtgg￡Lcctgg鄉gtettcttegtggtggcagcggctacaggtgtccagtcccag60gtacagctggtgcagtc鄉ggccg鄉tg犯g朋gcctgggtcctcggtg犯ggtctcc120tgc肌cctttctgg鄉caccttcaacatct3tgCt3tC3gctgggtgcgacaggcccct180ggacaagggcttgagtggatggg鄉ggtcatcccgatccatggtgcagtgcactacgcc240cag犯gttcc鄉st卿gtcaccattaccgcggacgagtccacgagcacagectacatg300gagctgagcagectgagatetgacgacacggecatgtattattgtggccttctgactacg360caccatgg已cgtctggggccggtceiccgtc420tcctcagctagC3CC犯gggcccat44权利要求
1. 一种人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于，其为人源抗体，包括抗体可变区，该抗体包括或不包括抗体的恒定区，该抗体具有中和破伤风毒素的能力，编码该抗体可变区的序列如序列表1的氨基酸序列2和4所示。
2、 编码权利要求1所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的可变区的氨 基酸序列的核酸序列，其特征在于，该核酸序列如序列表1中的序列6和8所示。
3、 根据权利要求1所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于， 抗体可变区的氨基酸序列包括所述序列或该序列的同系物或修饰物；其同系 物为该抗体可变区的氨基酸序列其同系性达到所述氨基酸序列的80%或以上， 其所改变的产物仍旧保留中和破伤风毒素的能力。
4、 根据权利要求3所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于，所述同系物和修饰物还包括对该抗体蛋白质翻录合成后的修饰，使表达的抗 体蛋白具有中和破伤风毒素的能力，修饰以达到增强治疗或预防效应、提高 在体外的稳定性或对体内蛋白酶的抵御能力。
5、 根据权利要求1所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于 对所述的氨基酸序列进行改变、缺失或添加一个或几个氨基酸，而仍保留其 中和破伤风毒素的能力。
6、 根据权利要求1所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B，其特征在于， 所述抗体的恒定区是人源免疫球蛋白重链或轻链的恒定区中的任何一种；该 重链恒定区是人源IgG 、 IgM、 IgA、 IgE或IgD的恒定区，或包括有绞链区的重链恒定区或重链恒定区中的任何片段；所述轻链恒定区片段是人体免疫 球蛋白轻链的K或A的恒定区。
7、 一种如权利要求1所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的制备方法， 其特征在于，其包括利用基因重组技术的方法或化学合成的方法来制备和生 产；其中，利用基因重组技术的方法来制备，包括A、抗体基因的克隆与序 列分析；B、抗体基因表达载体的构建；C、在一个合适的系统或宿主中，将抗体基因表达D、大量培养和扩增抗体表达宿主；E、对表达的抗体分离纯化F、对表达抗体的定性和定量分析。
8、 根据权利要求6所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的制备方法， 其特征在于，所述抗体基因的表达载体是质粒载体或病毒载体、动物转基因的载体或者通用载体；所述抗体基因载体转入一个合适的系统或宿主中加以 表达，其中合适的系统或宿主包括动物或植物的细胞，细胞株、细菌或酵母;该动物是转基因动物。
9、 根据权利要求6所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B的制备方法， 其特征在于，还包括检测抗体蛋白质或基因核酸的序列。
10、 权利要求1所述的人源抗破伤风毒素单克隆抗体B在制备预防破伤 风细菌感染药品中的应用以及在制备破伤风细菌感染的诊断制剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种人源抗破伤风毒素单克隆抗体，其为人源抗体，包括抗体可变区，该抗体包括或不包括抗体的恒定区，该抗体具有中和破伤风毒素的能力，抗体可变区的基因和蛋白质序列如序列表1所示；其具有不会诱发明显的过敏反应，有较高的效价且长效，产品无动物病毒污染，可以无限量地生产；本发明还提供了其生物功能、测定方法、生产制造方法及其应用。
文档编号C07K16/18GK101220096SQ20061014498
公开日2008年7月16日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者李卓娅, 龚疆红 申请人:龚小迪