专利名称：：牛樟芝的环己烯酮萃取物的制作方法
技术领域：
：本发明是关于一种新颖化合物，尤其是关于一种由牛樟芝(Antrodiacamphomta)萃取物中所分离纯化的化合物及其在抑制肿瘤细胞生长的应用。技术背景牛樟芝(Antrodiacamphorata)，又称樟芝、牛樟燕、红樟、红樟芝、樟菰或樟窟内菰等，为台湾特有种真菌，只生长于台湾山区海拔4502000公尺间的牛樟树(CinnamoumkanehiraiHay)的中空腐朽心材内壁上，因此是由树干内面生长出子实体。牛樟树目前主要分布于桃园、南投等山区，由于牛樟树是台湾数量极为稀少的保育类树种，加上人为的盗伐，使得寄生于其中方能生长的野生牛樟芝数量更形稀少，且由于其生长相当缓慢，生长期也仅在六月至十月之间，因此价格非常昂贵。牛樟芝的子实体为多年生，无柄，呈木栓质至木质，其外形多变，有板状、钟状、马蹄状或塔状。初时为扁平型，贴生于木材表面，之后其前缘会略为巻曲翘起，而呈板块状(层纹板状)或如钟乳石状。牛樟芝顶部表面呈褐色至黑褐色，具不明显的皱纹，有光泽，边缘平而钝，其腹面则为橘红色或局部黄色，并有许多细孔。此外，牛樟芝具有强烈的黄樟香气，其晒干后褪色成土黄白色，味极苦，民间将其用作解毒、保肝、抗癌的草药。牛樟芝如同一般食药用的蕈菇类，具有许多复杂的成分，己知的生理活性成分中，包括多醣体(polysaccharides,如卩-萄聚醣)、三萜类化合物(triterpenoids)、超氧歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、腺苷(adenosine)、蛋白质(含免疫球蛋白)、维生素(如维生素B、烟碱酸)、微量元素(如钙、磷及锗等)、核酸、凝集素、胺基酸、固醇类、木质素以及血压稳定物质(如aiitodiaacid)等，这些生理活性成分被认为具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗过敏、抑制血小板凝集、抗病毒、抗细菌、抗高血压、降血糖、降胆固醇以及保护肝脏等功能。牛樟芝众多成分中以三萜类化合物被研究的最多，三萜类化合物是由三十个碳元素结合成六角形或五角形天然化合物的总称，牛樟芝所具的苦味即主要来自三萜类此成分。1995年时，Chemg等人发现牛樟芝子实体萃取物中含有三种新的以麦角甾垸(ergostane)为骨架的三萜类化合物antcinA、antcinB与antcinC(Chemg,I.H.,andChiang,H.C.1995.ThreenewtriterpenoidsfromAntrodiacinnamomea.J.Nat.Prod.58:365-371)。Chen等人以乙醇萃取樟芝子实体后发现zhankuicacidA、zhankuicacidB及zhankuicacidC等三禾中三砲类化合物(Chen，C.H.,andYang,S.W.1995.NewsteroidacidsfromAntrodiacinnamomea,-afUngusparasiticonCinnamomummicranthum.J.Nat.Prod.58:1655-1661)。此外，Chiang等人于1995年也由子实体萃取物中发现另外三种分别为倍半萜内酯(sesquiterpenelactone)与两种双酚类衍生物的新三萜类化合物，此即antrocin，4，7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二氧环(4,7-(1^6化(《7-5-methy-l，3-benzodioxole)与2，2'，5，5'-四甲氧基-3，4,3'，4'-双-亚甲二氧基-6,6'-二甲基联苯(2，2'，5，5'-teramethoxy-3,4,3'，4'-bi-methylenedioxy-6，6'-dimethylbiphenyl)(Chiang,H.C.，Wu，D.P.，Chemg,I.W"andUeng,C.H.1995.Asesquiterpenelactone,phenylandbiphenylcompoundsfromAntrodiacinnamomea.Phytochemistry.39:613-616)。到了1996年，Chemg等人以同样分析方法再度发现四种新的三萜类化合物antcinE、antcinF、methylantcinateG、methylantcinateH(Chemg,I.H.，Wu，D.P"andChiang,H.C.1996.TriteroenoidsfromAntrodiacinnamomea.Phytochemistry.41:263-267);而Yang等人则发现了二种以麦角甾烷为骨架的新化合物AankuicacidD、zhankuicacidE和三种以羊毛甾烷(lanostane)为骨架的新化合物15a-乙酰-去氢硫色多孑L菌酸(15a-acetyl-dehydrosulphurenicacid)、去氢齿孑L酸(dehydroeburicoicacid)与去水硫色多孑L菌酸(dehydrasulphurenicacid)(Yang,S.W"Shen，YC.，andChen，C.H.1996.SteroidsandtriterpenoidsofAntrodiacinnamomea—afbngusparasiticonCinnamomummicranthum.Phytochemistry.41:1389-1392)。虽然由目前诸多实验可得知牛樟芝萃取物具有抑癌的功效(如前述Chen(1995)),但究为何种有效成分可达到抑制肿瘤细胞效果的研究，目前则仍处于试验阶段，并未有具体的有效成分发表，故若能将该萃取物进一步纯化分析，找出其真正有效抑癌成分，对于人类癌症的治疗实将产生莫大的帮助。
发明内容为明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌的效果，本发明由牛樟芝萃取物中分离纯化出具有式(1)结构式的新颖化合物其中，X是氧(0)或硫(S)，Y是氧或硫；R,是氢基(H)、甲基(CH3)或(CEb)m-CH3，R2是氢基、甲基或(CH2)m-CH3，R3是氢基、甲基或(CH2)nrCH3，m=l12;n=l12。如式(1)结构式的化合物中，较佳者为如下所示式(2)的化合物式(2)的化合物，其化学名为4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5-(3，7，11-trimethyl—dodeca-2，G，10-trknyl)-cyGlohex國2隱enone)，^f《力C24H38C)4，外观为淡黄色粉末状，分子量为390。本发明中式(1)、式(2)的化合物是分离纯化自牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物，有机溶剂可包括醇类(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、垸类(例如己垸)或卤烷(例如氯甲烷、氯乙垸)，但并不以此为限，其中较佳者为醇类，更佳者为乙醇。借由前述化合物，本发明是将其应用在抑制肿瘤细胞生长上，使能进一步应用于治疗癌症的医药组成份中，增益癌症的治疗效果。本发明化合物的应用的范围包括对于乳癌肿瘤细胞、肝癌肿瘤细胞与摄护腺癌肿瘤细胞等细胞的生长产生抑制效果，使该等肿瘤细胞无法迅速生长，进而抑制肿瘤的增生，延缓肿瘤的恶化，因此，可进一步利用于乳癌、肝癌与摄护腺癌等癌症的治疗。另一方面，本发明中也可将式(1)或/与式(2)的化合物利用于治疗乳癌、肝癌与摄护腺癌等医药组成物的成分中，借以抑制该等肿瘤细胞的生长。前述医药组成物除包括有效剂量的式(1)或/与式(2)的化合物外，尚可包括药学上可接受的载体。载体可为赋形剂(如水)、填充剂(如蔗糖或淀粉)、黏合剂(如纤维素衍生物)、稀释剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂，但并未仅限于此。本发明医药组成物可依一般已知药学的制备方法生产制造，将式(1)或/与式(2)有效成分剂量与一种以上的载体相混合，制备出所需的剂型，此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶囊或其它液体制剂，但未以此为限。此外，由于本发明中的化合物同时具有抗氧化活性，因此亦可将其添加于保健食品、饮食品、医药品、化妆品当中，借由其抗氧化能力达到预防心血管疾病或避免细胞突变等效用，使助益于施用人体的健康。以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟悉该技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许修改与改进，因此本发明的保护范围应该视后附的权利要求书所限定为准。实施方式首先取牛樟芝(Antrodiacamphorata)菌丝体、子实体或二者的混合物，利用已知的萃取方式，以水或有机溶剂进行萃取，借以取得牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物。其中，有机溶剂可包括醇类(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卤垸(例如氯甲垸、氯乙垸)，但并不以此为限。其中较佳者为醇类，更佳者为乙醇。经萃取过后的牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物，可进一步借由高效液相层析加以分离纯化，之后再对每一分液(fraction)进行抑癌效果的测试。最后，则针对具抑癌效果的分液进行成分分析，将可能产生抑癌效果的成分再分别进一步做不同癌症肿瘤细胞的抑制效果测试。最终即发现本发明中如式(1)/式(2)的化合物是具有抑制不同癌症肿瘤细胞生长的效果，且该化合物经与已知文献对比，并未曾在牛樟芝中发现，因此是新颖的化合物。为方便说明本发明，以下将以式(2)的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7,ll-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮化合物进行说明。此外，为证实4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5G,7，ll-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮化合物对肿瘤细胞生的抑制效果，本发明中是以MTT分析法，根据美国国家癌症研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗肿瘤药物筛检模式，对包括乳癌、肝癌与摄护腺癌等肿瘤细胞进行细胞存活率的测试。由这些测试证实，4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7,ll-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对于乳癌肿瘤细胞(包括MCF-7与MDA-MB-231)、肝癌肿瘤细胞(包括Hep3B与HepG2)与摄护腺癌肿瘤细胞(包括LNCaP与DU-145)等都可降低其存活率，相对之下并可同时降低生长半抑制率所需浓度(即IC5()值)，因此得借由4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮，应用于包括乳癌、肝癌与摄护腺癌等肿瘤细胞的生长抑制上，而进一步可利用于乳癌、肝癌与摄护腺癌等癌症的治疗。现对前述实施方式详尽说明如下实施例l:4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮的分离将100克左右的牛樟芝菌丝体、子实体或二者的混合物，置入三角锥形瓶中，加入适当比例的水与醇类(70%~100%醇类水溶液)，在2025。C下搅拌萃取至少l小时以上，之后以滤纸及0.45pm滤膜过滤，收集萃取液。将前述收集的牛樟芝萃取液，利用高效能液相层析仪(HighPerformanceLiquidchromatography),以RPl8的层析管(column)进行分析，并以甲醇(A)及0.1。/。0.5。/。醋酸水溶液(B)做为移动相(mobilephase)(其溶液比例是(MO分钟，B比例为95。/。20。/。；10~20分钟，B比例为20°/。~10%;2035分钟，B比例为10%~10%;35~40分钟，B比例为10%~95%)，在每分钟1ml的速度下冲提，同时以紫外-可见光全波长侦测器分析。将25分钟至30分钟的冲提液收集浓縮即可得淡黄色粉末状的固体产物，此即4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮。经分析，其分子式为C24H3804，分子量390，熔点(m.p.)为48°C52°C。核磁共振(NMR)分析值则如下所示'H-NMR(CDCl3)S(ppm):1.51、1.67、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07与5.14。13C-NMR(CDC13)S(ppm):12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120,97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45与197.12。经将4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7，ll-三甲基-2,6,10冲二碳三烯)-2-环己烯酮与化学式数据库对比后，并未发现与前述相同的化合物结构，因此，此化合物是一新颖且前所未见的化合物。实施例2:体外抗乳癌肿瘤细胞的活性测试为进一步测试实施例1中所发现化合物对肿瘤细胞的抑制效果，本实施例将根据美国国家癌症研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗肿瘤药物筛检模式，首先取实施例1中所分离的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮化合物，加入MCF-7与MDA-MB-231人类肿瘤细胞培养液中，进行肿瘤细胞存活性的测试。细胞存活性的测试可采用已知的MTT分析法进行分析，而MCF-7与MDA-MB-231都是人类的乳癌肿瘤细胞系。MTT分析法是一种常见用于分析细胞增生(cellproliferation)、存活率(percentofviablecells)以及细胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。其中，MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]2，5-diphenyltetrazoliumbromide)为一黄色染剂，它可被活细胞吸收并被粒腺体中的琥珀酸四唑还原酶(succinatetetrazoliumreductase)还原成不溶水性且呈蓝紫色的formazan，因此借由formazan形成与否，即可判断并计算细胞的存活率。首先将人类乳癌细胞MCF-7与MDA-MB-231分别于含有胎牛血清的培养液中培养24小时。将增生后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞，随后于1，200rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将细胞分置于96孔微量盘内。测试时，分别于每一孔内加入30、10、3、1、0.3、0.1与0.03pg/ml牛樟芝乙醇萃取物(对照组，未经纯化分离的总萃取物)以及4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(试验组)，于37°C、5%(302下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入2.5mg/ml的MTT，反应4小时后再于每一孔内加入100^1的lysisbuffer终止反应。最后以酵素免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值，借以计算细胞的存活率，并推算出其生长半抑制率所需浓度(B卩IC5o值)，其结果如表一所示。表一体外对乳癌肿瘤细胞存活率的测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表一中可知，借由4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮的作用，其对于MCF-7人类乳癌肿瘤细胞的IC5o值为0.852pg/ml，对于MDA-MB-231人类乳癌肿瘤细胞的ICso值则为1.031Hg/ml，相较于牛樟芝萃取混合物所测得的IC5o值是低的多，因此可证实牛樟芝萃取物中的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够利用于乳癌肿瘤细胞生长的抑制。实施例3:体外对乳癌肿瘤细胞辅助治疗的活性测试本测试同样是根据美国国家癌症研究所的体外筛检模式进行测试。首先，取人类乳癌细胞MCF-7与MDA-MB-231，分别于含有胎牛血清的培养液中培养24小时后，将增生后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞，随后于l，200rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮。测试前，先加入0.0017pg/ml紫杉醇(Taxd)处理细胞72小时，再将细胞分置于96孔微量盘内，之后分别于每孔内加入Oiag/ml(对照组)，30、10、3、1、0.3、0.1与0.03吗/ml实施例1中所分离的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(试验组)，于37。C、5%C02下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入2.5mg/ml的MTT，反应4小时后于每一孔内加入lOOpl的lysisbuffer终止反应。最后以酵素免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值，借以计算细胞的存活率，并推算出其生长半抑制所需浓度(即ICso值)，其结果如表二所示。表二体外对乳癌肿瘤细胞经紫杉醇辅助治疗后抑制的测试结果测试样品结果对照组细胞存活率(％)MCF-7(0.0017pg/mlTaxol)65±1MDA-MB-231(0.0017pg/mlTaxol)76±3试验组IC50(ng/ml)MCF-7(0.0017pg/mlTaxol+式2)0.009MDA-MB-231(0.0017|ig/mlTaxol+式2)0.011由表二中可知，透过紫杉醇的协同作用，4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对于MCF-7人类乳癌肿瘤细胞的ICso值降为0.009ng/ml，对于MDA-MB-231人类乳癌肿瘤细胞的IC50值也降为约0.011pg/ml，因此可证实牛樟芝萃取物中的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够利用于乳癌肿瘤细胞生长的抑制，且在紫杉醇的协同作用下，有更佳的抑制效果。实施例4:体外抗肝癌肿瘤细胞的活性测试本测试也是根据美国国家癌症研究所抗肿瘤药物筛检模式进行，将实施例1中所分离的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6,10冲二碳三烯)-2-环己烯酮化合物，加入Hep3B与HepG2人类肝癌肿瘤细胞培养液中进行培养，借以进行肿瘤细胞存活性的测试。首先将人类肝癌细胞Hep3B与HepG2分别于含有胎牛血清的培养液中培养24小时。将增生后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞，随后于l，200rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将细胞分置于96孔微量盘内。测试时，分别于每一孔内加入30、10、3、1、0.3、0.1与0.03pg/ml的牛樟芝乙醇萃取物(对照组，未经纯化分离的总萃取物)以及30、10、3、1、0.3、0.1与0.03^lg/ml的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，ll-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(试验组)，于37。C、5%C02下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入2.5mg/ml的MTT，反应4小时后再于每一孔内加入lOOpl的lysisbuffer终止反应。最后以酵素免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值，借以计算细胞的存活率，并推算出其IC50值，其结果如表三所示。_表三体外对肝癌肿瘤细胞抑制的测试结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表三中可知，借由4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮的作用，其对于Hep3B人类肝癌肿瘤细胞的IC50值降为0.005pg/ml，对于HepG2人类肝癌肿瘤细胞的1(:5()值则降为1.679pg/ml，相较于牛樟芝萃取混合物所测得的IC5o值是低的多，因此可证实牛樟芝萃取物中的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6，10冲二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够利用于肝癌肿瘤细胞生长的抑制。实施例5:体外对肝癌肿瘤细胞辅助治疗的活性测试本测试同样是根据美国国家癌症研究所的体外筛检模式进行测试。首先，取人类肝癌细胞Hep3B与HepG2，分别于含有胎牛血清的培养液中培养24小时后，将增生后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理5.12118.631细胞，随后于l，200rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮。测试前，先于Hep3B细胞株试验加入0.0043pg/ml的Lovastatin，而于HepG2细胞株试验加入0.0017ng/ml紫杉醇(Taxol)，处理细胞72小时，再将细胞分置于96孔微量盘内，之后分别于每孔内加入Opg/ml(对照组)，30、10、3、1、0.3、0.1与0聊g/ml实施例1中所分离的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(试验组)，于37。C、5%C02下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入2.5mg/ml的MTT，反应4小时后于每一孔内加入10(^1的lysisbuffer终止反应。最后以酵素免疫分析仪在570nrn吸光波长下测定其吸光值，借以计算细胞的存活率，并推算出其IC50值，其结果如表四所示。表四体外对肝癌肿瘤细胞经紫杉醇辅助治疗后抑制的测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表四中可知，透过Lovastatin及紫杉醇的协同作用，4-羟基-2，3-二甲氧基_6_甲基_5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对于Hep3B人类肝癌肿瘤细胞的ICso值降为0.002pg/ml，对于HepG2人类肝癌肿瘤细胞的IC5o值也降为约0.008吗/ml，因此可证实牛樟芝萃取物中的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够利用于肝癌肿瘤细胞生长的抑制，且在紫杉醇的协同作用下，有更佳的抑制效果。实施例6:体外抗摄护腺癌肿瘤细胞的活性测试本测试也是根据美国国家癌症研究所抗肿瘤药物筛检模式进行，将实施例1中所分离的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮化合物，加入LNCaP与DU-145人类摄护腺癌肿瘤细胞培养液中进行培养，借以进行肿瘤细胞存活性的测试。首先将人类摄护腺癌细胞LNCaP与DU-145分别于含有胎牛血清的培养液中培养24小时。将增生后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞，随后于1，200rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将细胞分置于96孔微量盘内。测试时，分别于每一孔内加入30、10、3、1与0.3|iig/ml牛樟芝乙醇萃取物(对照组，未经纯化分离的总萃取物)以及30、10、3、1与0.3pg/ml由实施例l所分离的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7，ll-三甲基-2,6，10冲二碳三烯)-2-环己烯酮(试验组)，于37X:、5%C02下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入2.5mg/ml的MTT，反应4小时后再于每一孔内加入10(^1的lysisbuffer终止反应。最后以酵素免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值，借以计算细胞的存活率，并推算出其IC50值，其结果如表五所示。表五体外对摄护腺癌肿瘤细胞抑制的测试结果测试样品IC5。(pg/ml)对照组(加入牛樟芝萃取物)LNCaP11.491DU-14541.392试验组(加入式2)LNCaP2.378DU隱1451.812由表五中可知，借由4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮的作用，其对于LNCaP人类摄护腺癌肿瘤细胞的IQo值降为2.378pg/ml，对于DU-145人类摄护腺癌肿瘤细胞的1<35()值则降为1.812pg/ml，相较于牛樟芝萃取混合物所测得的IC5。值是低的多，因此可证实牛樟芝萃取物中的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够利用于摄护腺癌肿瘤细胞生长的抑制。实施例7:体外对摄护腺癌肿瘤细胞辅助治疗的活性测试本测试同样是根据美国国家癌症研究所的体外筛检模式进行测试。首先，取人类摄护腺癌细胞LNCaP与DU-145，分别于含有胎牛血清的培养液中培养24小时后，将增生后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞，随后于l，200rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮。测试前，先于LNCaP细胞株试验加入0.0017ng/ml紫杉醇，而于DU-145胞株试验加入0.0043pg/ml紫杉醇分别处理细胞72小时，再将细胞分置于96孔微量盘内，之后分别于每孔内加入Opg/ml(对照组)，30、10、3、1、0.3、0.1与0.03|ig/ml于实施例1中所分离的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，'6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(试验组)，于37"C、5%C02下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入2.5mg/ml的MTT，反应4小时后于每一孔内加入的lysisbuffer终止反应。最后以酵素免疫分析仪在570nrn吸光波长下测定其吸光值，借以计算细胞的存活率，并推算出其IC5。值，其结果如表六所示。表六体外对摄护腺癌肿瘤细胞经紫杉醇辅助治疗后抑制的测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表六中可知，透过紫杉醇的协同作用，4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对于LNCaP人类摄护腺癌肿瘤细胞的IQo值降为0.961|ig/ml，对于DU-145人类摄护腺癌肿瘤细胞的IC50值也降为约0.515pg/ml，相较于牛樟芝萃取混合物所测得的ICs。值是低的多，因此可证实牛樟芝萃取物中的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够利用于摄护腺癌肿瘤细胞生长的抑制，且在紫杉醇的协同作用下，有更佳的抑制效果。实施例8:体外抗氧化活性的试验一般抗氧化活性的测试，是利用人类低密度脂蛋白(humanlowdensitylipoprotein,LDL)，加入铜离子(Cu2+)与待测样本进行氧化反应，检测LDL上二烯的反应结果后，以维生素E的水溶性类似物Trolox作为对照(Trolox浓度为2(aM时，其效力值定为标准值l.O)，计算出待测样本的抗氧化活性。首先准备二次纯水(控制组)，并配制5mM磷酸钠缓冲溶液(sodiumphosphatebuffer,SPB)、lpM与2nM的Trolox(对照组)及40|ig/ml由实施例1中所分离的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6,10冲二碳三烯)-2-环己烯酮(试验组)。利用酵素法测得低密度胆固醇浓度(LDL-C)后，利用5mM的SPB将LDL稀释至0.10~0.25mg/ml间。取96孔的石英微量盘，于其中先加入lOOpl的LDL，再分别加入前述预定浓度的Trolox及由实施例1中所分离的化合物，之后再分别加入CuSO4溶液以启动氧化反应(每250)al孔中的铜(II)浓度为5.0pM)，最后将该微量盘置于酵素免疫微量盘分析仪(ELISAreader)中进行检测。酵素免疫微量盘分析仪检测波长设为232nm，温度设为37。C，监测时间为12小时，釆样间隔时间为15分钟，其结果如表七所示。表七体外抗氧化活性的测试结果测试样品Tlag(分)ATlag(分)效力值H20(控制组，Tlago)1851pMTrolox(对照组)266810.482|jMTrolox3441591.0040—1式24392081.30注1:Tlag(分)是指在吸收光波长为234nm下，延滞期(lagphase)与连锁期(propagationphase)的交差点；ATlag(分)是指各测试样品Tlag时间与TlagO时间的差值。注2:效力值>0.5时，表示其具抗氧化作用。由表七中可知，4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮具有1.30的效力值，其比具抗氧化能力的标准值0.5高出甚多，也就是，其具有相当的抗氧化能力，因此可用作保健食品、饮食品、医药品、化妆品当中的成分，借由其抗氧化能力达到预防心血管疾病或避免细胞突变等效用，使对于施用的人体健康产生莫大的帮助。权利要求1.一种化合物，包括下列结构式id="icf0001"file="A2007100042350002C1.gif"wi="81"he="35"top="39"left="70"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中，X是氧(O)或硫(S)，Y是氧或硫；R1是氢基(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3，R2是氢基、甲基或(CH2)m-CH3，R3是氢基、甲基或(CH2)m-CH3，m＝1～12；n＝1～12。2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是分离自牛樟芝。3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是由牛樟芝的有机溶剂萃取物中所分离。4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，该有机溶剂是选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群。5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，该醇类是乙醇。6.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分离。7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是4-羟基-2,3-二甲氧基_6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy隱5(3，7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone)。8.—种将具有如权利要求1或7所述化合物利用于抑制乳癌肿瘤细胞生长的应用。9.如权利要求8所述的将该化合物利用于抑制乳癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是分离自牛樟芝。10.如权利要求9所述的将该化合物利用于抑制乳癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是由牛樟芝的有机溶剂萃取物中所分离。11.如权利要求IO所述的将该化合物利用于抑制乳癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该有机溶剂是选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群。12.如权利要求11所述的将该化合物利用于抑制乳癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该有机溶剂是乙醇。13.如权利要求9所述的将该化合物利用于抑制乳癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分离。14.如权利要求8所述的将该化合物利用于抑制乳癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该乳癌肿瘤细胞是MCF-7或MDA-MB-231细胞系。15.—种将具有如权利要求1或7所述的化合物利用于抑制肝癌肿瘤细胞生长的应用。16.如权利要求15所述的将该化合物利用于抑制肝癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是分离自牛樟芝。17.如权利要求16所述的将该化合物利用于抑制肝癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是由牛樟芝的有机溶剂萃取物中所分离。18.如权利要求17所述的将该化合物利用于抑制肝癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该有机溶剂是选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群。19.如权利要求18所述的将该化合物利用于抑制肝癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该有机溶剂是乙醇。20.如权利要求16所述的将该化合物利用于抑制肝癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分离。21.如权利要求15所述的将该化合物利用于抑制肝癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该肝癌肿瘤细胞是Hep3B或HepG2细胞系。22.—种将具有如权利要求1或7所述的化合物利用于抑制摄护腺癌肿瘤细胞生长的应用。23.如权利要求22所述的将该化合物利用于抑制摄护腺癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是分离自牛樟芝。24.如权利要求23所述的将该化合物利用于抑制摄护腺癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是由牛樟芝的有机溶剂萃取物中所分离。25.如权利要求24所述的将该化合物利用于抑制摄护腺癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该有机溶剂是选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群。26.如权利要求25所述的将该化合物利用于抑制摄护腺癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该有机溶剂是乙醇。27.如权利要求23所述的将该化合物利用于抑制摄护腺癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分离。28.如权利要求22所述的将该化合物利用于抑制摄护腺癌肿瘤细胞生长的应用，其特征在于，该摄护腺癌肿瘤细胞是LNCaP或DU145细胞系。29.如权利要求1或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有抗氧化活性。30.—种利用于抑制肿瘤细胞生长的医药组成物，其包括有效剂量的如权利要求1所述的化合物以及药学上可接受的载体，其中该肿瘤细胞是选自乳癌、肝癌或摄护腺癌的肿瘤细胞。31.—种利用于抑制肿瘤细胞生长的医药组成物，其特征在于，其包括有效剂量的如权利要求7所述的化合物以及药学上可接受的载体，其中该肿瘤细胞是选自乳癌、肝癌或摄护腺癌的肿瘤细胞。全文摘要本发明是关于一种新颖化合物及其用途，尤其是关于一种由牛樟芝萃取物中所分离出的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5(3，7，11-trimethyl-dodeca-2，6，10-trienyl)-cyclohex-2-enone)及其在抑制肿瘤细胞生长的应用。本发明中的前述化合物是首次见于牛樟芝中，其可应用于抑制乳癌、肝癌与摄护腺癌肿瘤细胞的生长，同时可作为抑制前述肿瘤细胞生长的医药组成物的成分，或进一步借由其抗氧化活性应用于心血管疾病的预防或添加于健康饮食品当中。文档编号C07C403/02GK101225066SQ20071000423公开日2008年7月23日申请日期2007年1月18日优先权日2007年1月18日发明者刘胜勇,张君绶,李雅嫈,温武哲,邹宛玲,郭茂田,霍嘉恒,黄俊鸿申请人:国鼎生物科技股份有限公司