专利名称：一种c端特异的人ywhae多肽及其抗体制备方法
技术领域：
本发明涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种C端特 异的YWHAE多肽及其抗体制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术：
YWHAE (tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase activation protein)蛋白属于14-3-3家族，通过结合phosphoserine國containing proteins介导信号转导。这一高度保守的蛋白家族已被证实存在于植物和哺乳 动物。YWHAE可以和CDC25, RAF1以及IRS1蛋白相互作用，提示其可能 具有多种生物学功能，并已证明与胰岛素代谢相关，与小细胞肺癌相关。
发明内容
本发明是为解决通过免疫实验特异性检测YWHAE的表达与天然存在， 并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异性 针对YWHAE的C端的合成多肽、相应抗体及其制备方法。本发明还可同时 解决目前使用的类似抗体价格高，亲和力低，抗体结合蛋白的位置不特异且抗原性较差等问题。本发明所述的抗YWHAE合成多肽、相应抗体，按照以 下步骤制备
抗原表位分析与拮抗位置确定利用多种表位预测软件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗原 指数、表面可及性等，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定 第184到第198位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为ILNSPDRACRLAKAA。
多肽的合成靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化， 然后通过HPLC，用每分钟1。/。的标准乙晴梯度来检测纯度。
多肽与载体蛋白交联由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱 导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥孔嘁 血蓝素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制备出人工免疫原。
免疫动物所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免疫
家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性词养后进行多点注射 免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。
抗体纯化达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用 辛酸l酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过
SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。
本发明制备的髙质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然YWHAE分 子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试 验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为YWHAE分子 的研究及其相关疾病的研究(如诊断策略的制定，流行病学调査、预防和控 制)提供了一个重要的工具，以及在生物医学研究中对相应靶蛋白的特性、 含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要作用。
图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。 图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。
图3是通过间接ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。
图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度为 81.1%。
图2表明多肽分子量理论值为1700.1,质谱鉴定实测值NI+H+为 1702.4。
图3中ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为106-107L/mol。
具体实施方式
实施例1: YWHAE抗原肽的合成。
用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析软件，对YWHAE氨基酸 序列进行亲水性结构(hydrophiHcity)、抗原指数(antigenicity)、表面可及性 (surface probability)以及同源性等分析(homology)，再结合我们已有实际 制备抗体的验证经验，最终确定第184到第198位为耙标，其氨基酸序列为 ILNSPDRACRLAKAA。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合 成后获得粗品。经30%乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC)分析，计 算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。
实施例2:合成多肽与载体的偶联。
载体蛋白选择KLH (Keyhole limpet hemocyanin),用双功能试剂 顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联-取KLH5mg (O."ymol，含赖氨酸2.2jjmol),溶于0.75mL偶联缓冲液 1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5) ; 3mg MBS ("jjmo)溶于75pL 二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温下 作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8mL)加入预先用偶联缓 冲液2 (0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。 溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56， 室温下旋转混合，作用2小时后置4。C过夜，将反应混合物(约0.7mL) 加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将 KLH、 MBS-KLH和偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE (聚丙 烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。实施例3:抗多肽抗体的制备。
取偶联的KLH-多肽500jjg，溶于SOOpL磷酸缓冲液，加等体积完全福 氏佐剂。免疫选取适龄免疫用新西兰兔(体重标准为2-2.5公斤)，经过适 应性饲养后，背部皮内不少于15点注射。2周后抗原量减半(250jig)，加 等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行第二次加强免疫， 方法同前。再2周后耳缘静脉少量采血，用合成多肽(1jjg/mL)包被酶标 板，间接ELISA法检测免疫血清效价。反复加强免疫，至取血测抗体效价达 到1: 16万时停止免疫，采用颈动脉放血收集抗体。
实施例4:亲和层析纯化抗多肽抗体。
① YWHAE合成多肽亲和层析柱的制备称取1.5g CNBr活化 Sepharose4B，用1mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液洗 2次，迅速与溶于5mL偶联缓冲液的合成多肽500jjg混合，室温下旋转混 合2小时。加入0.2mol/L甘氨酸4mL终止反应，室温下旋转混合1小时。 用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50mL磷酸盐缓冲液 洗凝胶，按终止浓度0.02%加叠氮钠(NaN3)，置4。C保存。
② 亲和层析纯化抗多肽抗体:将20mL兔抗多肽血清与1.6mL多肽偶联 的S印harose 4B共同加入50mL离心管，4°C旋转混合6小时。将凝胶加 入层析柱，弃去流出液，用15mL磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每次加0.8mL pH2.9, 0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别加入8支预先加 入80jjL 2mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.5) ， 20mL磷酸盐缓冲液洗凝胶。上述全部操作过程在4°C下完成。每管取洗脱液2jjL，稀释50倍后测280nm 的OD值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。
实施例5:抗体的鉴定，使用间接ELISA方法检测抗体相对亲和常数。
用合成肽交联BSA，分别以5 ug/mL和10 ix g/mL的浓度，在4度 下包被ELISA检测板过夜，10。/。的山羊血清室温封闭2小时后加入倍比稀释 的已知蛋白浓度的纯化后的抗体，再加入HRP标记的羊抗兔lgG二抗 0.1mL, TMB显色测定A4s。。以抗体浓度的对数为横坐标，以曲线达到水平 时的A4so值为100%，以其他相对于该浓度的百分数为纵坐标作图，求出A50 即50% A值对应的抗体浓度。按照Kaff=(n-1)/2(nAb， ] t-2[Abt>算出抗 体相对亲和常数，其中[Ab' ]t Abt指的是AsQ时即包被抗原分别为5 ug/mL和10wg/mL时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度，Ag] t、 [Ag't 指的是包被的抗原浓度本实验中即指10ug和5wg， n-[Ag]t/[Ag' ] t，本 实验中n=2。
试验效果
1. YWHAE合成多肽:HPLC纯化后，使用液相色谱鉴定纯度为81.1。/。。 多肽分子量理论值为1700.1，质谱鉴定实测值M+H+为1702.4。
2. 多肽与载体的偶联效率SDS-PAGE电泳鉴定偶联效率与样品回收 率大致相符，大于80%。
3. 抗体效价多只家兔得到的抗血清效价均在1:10万以上。4. 抗体亲和力相对亲和常数为106-107L/mol。
5. 抗体的应用以上技术指标的实现保证该抗体完全可以应用于蛋白 印迹和各种酶免实验，以及建立相应体外免疫分析试剂。序列表
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ILNSPDRACRLAKAA
权利要求
1.一种C端特异的人YWHAE多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为ILNSPDRACRLAKAA。
2. —种特异的抗人YWHAEC端合成多肽抗体，其特征在于该抗体效价在l: 100000以上， 特异性强，亲和力高达106—107L/mol。
3. —种特异的抗人YWHAE C端合成多肽抗体的制备方法，其特征在于以人YVVHAE氨基 酸序列中第184到第198位的ILNSPDRACRLAKAA肽段序列作为抗原肽合成人 YWHAE抗原肽；纯化的抗原肽与蛋白载体偶联，经柱层析纯化后；制备出人工免疫原， 免疫动物，制备多肽抗体，并经亲和层析纯化而成。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于载体蛋白为钥孔嘁血蓝素。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于偶联的KLH—多肽加福氏佐剂免疫后收集抗体。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于抗原肽与载体蛋白偶联作为免疫原，免疫家 兔制备兔抗人YWHAE合成多肽抗体。
7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于合成多肽偶联Sepharose4B，制备亲和层析 柱，用于纯化抗多肽抗体。
全文摘要
本发明公开了一种C端特异的人YWHAE多肽及其抗体的制备方法，属于以抗体为特征的体外试验用的生物制品。C端特异的人YWHAE多肽的氨基酸序列为ILNSPDRACRLAKAA。抗人YWHAE多肽抗体按以下方法制备(1)人YWHAE抗原表位的分析；(2)人YWHAE C端多肽的合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗人YWHAE多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人YWHAE多肽抗体。本发明制备的C端特异的抗人YWHAE合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人YWHAE发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可完全用于免疫印迹和酶联免疫吸附实验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为研究人YWHAE的生物学作用及其与各种疾病的关系提供了有用的工具。
文档编号C07K16/18GK101319003SQ200710100208
公开日2008年12月10日 申请日期2007年6月6日 优先权日2007年6月6日
发明者杜宏武, 王德仙, 陈光宇, 陈吾奇 申请人:北京意宏安生物科技有限公司