4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-1-羰基)-4-氟-苄基]-2h-酞嗪-1-酮的多晶型物的制作方法

专利名称：：4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-1-羰基)-4-氟-苄基]-2h-酞嗪-1-酮的多晶型物的制作方法4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-l-羰基)-4-氟-苄基]-2H-酞溱小酮的多晶型物本发明涉及晶型和合成特别的酞溱酮衍生物的改进方法、合成中间体和药物组合物以及该晶型的用途。哺乳动物的酶PARP(—种113-kDa的多结构域蛋白质)参与了DNA损伤的信号转导，其具有识别并迅速与DNA单链或双链的断裂处结合的能力(D，Amours等人，Biochem.J.，342,249-268(1999))。若干观察结果已经得出结论，PARP参与多种DNA-相关功能，包括基因扩增、细胞分裂、分化、凋亡、DNA碱基切除修复，以及影响端粒长度和染色体稳定性(d'AddadiFagagna等人，NatureGen.，23(1)，76-80(1999))。对PARP调控DNA修复和其他过程的机理研究已经确认了它在细胞核内的聚(ADP-核糖)链生成中的重要性(Althaus，F.R.和Richter，C""ADP-RibosylationofProteins:EnzymologyandBiologicalSignificance",Springer-Verlag，Berlin(1987))。与DNA结合的活化的PARP利用NAD在多种核的靶蛋白上合成聚(ADP-核糖)，包括拓朴异构酶、组蛋白和PARP本身(Rhun等人，Biochem.Biophys.Res.Commun"245，1-10(1998))。聚(ADP-核糖基)化作用也与恶性转化有关。例如，PARP活性在所分离的SV40-转化的成纤维细胞的核中较高，而白血病细胞和结肠癌细胞都显示出比相应的正常白细胞和结肠粘膜更高的酶活性(Miwa等人，Arch.Biochem.Biophys"181，313-321(1977);Burzio等人，Proc.Soc.Exp.Bioi,Med"149,933-938(1975);以及Hirai等人，CancerRes"43，3441-3446(1983))。PARP的大量低分子量抑制剂已经被用于阐明聚(ADP-核糖基)化作用在DNA修复中的功能作用。在用烷化剂处理的细胞中，PARP的抑制导致I)NA-链断裂和细胞杀死的显著增加(Durkacz等人，Nature,283，593-5%(1980);Berger，N.A.,RadiationResearch,101，4-14(1985))。随后，这类抑制剂已经显示出通过抑制潜在致命性损伤的修复而增强放射响应的效杲(Ben-Hur等人，BritishJournalofCancer,49(增刊VI)，34-42(1984);Schlicker等人，Int.J.Radiat,Bioi"75,91-100(1999))。PARP抑制剂已报道在放射敏感的低氧胂瘤细胞中有效(US5,032,617;US5,215,738和US5,041,653)。此外，PARP敲除(PARP-Z-)的动物显示出响应于烷化剂和Y-照射的基因组不稳定性(Wang等人，GenesDev.，9，509-520(1995);MenissierdeMurcia等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA,94，7303-7307(1997))。PARP的作用已经在某些血管疾病、败血症性休克、局部缺血损伤和神经毒性中得到证明(Cantoni等人，Biochim.Biophys.Acta,1014，1-7(1989);Szabo等人，J.Clin.Invest"100，723-735(1997))。造成DNA链断裂的氧自由基DNA损伤，其随后被PARP识别，是对这类疾病状态的主要作用因素，如PARP抑制剂研究所显示(Cosi等人，J.Neurosci，Res"39，38-46(1994);Said等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93,4688-4692(1996))。最近，PARP被证明在出血性休克的发病机制中起作用(Liaudet等人，Proc.Natl,Acad.Sci.U.S.A.,97(3)，10203-10208(2000))。也已证明，哺乳动物细胞的高效的逆转录病毒感染受到PARP活性抑制的阻滞。对重组逆转录病毒载体感染的这类抑制作用发生在多种不同的细胞类型中(Gaken等人，丄Virology,70(6),3992-4000(1996))。因此PARP抑制剂已被开发用在抗病毒治疗和癌症治疗中(WO91/18591)。此外，推测PARP的抑制可延緩人成纤维细胞老化特征的出现(Rattan和Clark,Biochem.Biophys.Res.Comm.,201(2)，665-672(1994))。这可能与PARP在控制端粒功能中所起的作用有关(d'AddadiFagagna等人，NatureGen.，23(1)，76-80(1999))。WO2004/0809767>开了多种酞,酮衍生物、其在抑制PARP中的活性以及其在治疗癌症中的相应用途，无论其是作为放疗或化疗的辅剂还是作为标准的单一药物使用。WO2005/053662描述了PARP抑制剂、特别是酞漆酮衍生物作为碱基切除修复(BER)抑制剂的用途。描述了这些抑制剂在制备治疗癌症的药物中的用途，所述癌症具有同源重组(HR)依赖的DNADSB修复活性的缺陷，特别是具有BRCA1和/或BRCA2缺陷表型的癌症。在WO2004/080976中公开的4-3-(4-环丙烷羰基-哌溱-1-羰基)-4-氟-千基卜2H-酞奉-l-S同(化合物A):是特别令人关注的。在WO2004/080976中，化合物A是作为化合物库中的一种化合物，从4-[4-氟-3-(哌"秦-l-羰基)-千基l-2H-酞溱-l-酮(化合物B)合成的加入到(B)在二氯曱烷中的溶液中，随后加入Hunig碱(N，N-二异丙基乙胺)来合成。该反应在搅拌下于室温进行l6小时，所得化合物通过制备型HPLC纯化。哌嗪衍生物(B)是通过将4-[2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞。秦-1-基甲基)-苯甲酰l-哌嗪-l-甲酸叔丁基酉旨(化合物C):通过将环丙烷曱酰氯:用6MHC1和乙醇处理1小时脱保护，随后用氨碱化至pH9并萃取到二氯曱烷中而制备。Boc-保护的派唤衍生物(C)是从2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-l-基甲基)-苯曱酸(化合物D):2-(lH-苯并三唑-l-基)-l，l,3，3-四曱基脲错六氟磷酸盐(HBTU)和N，N，画二异丙基乙胺在二甲基乙酰胺中的溶液，随后搅拌18小时而制备。化合物A的特定形式可能具有有利的特性，例如关于其溶解度和/或其稳定性和/或其生物利用度和/或其杂质特点和/或其过滤特性和/或其干燥特性和/或其缺乏吸湿性和/或其可以更容易地处理和/或微粉化和/或制成片剂。还希望具有改进的合成方法，该方法适合于以几克的规模来合成化合物A。因此，本发明的第一方面提供了基本上为结晶形式的4-[3-(4-环丙烷羰基-哌。秦-l-羰基)-4-氟-卡基j-2H-酞嗪-l-酮(化合物A),特别是以晶型A的形式。通过加入哌溱-l-甲酸叔丁基酯:上文所用的"基本上为结晶形式"，是指至少50重量。/。的化合物A为结晶形式，优选至少70重量％、80重量％或90重量％的化合物A为结晶形式。在某些实施方案中，至少95重量。/。、99重量％或甚至99.5重量%的化合物A可以为结晶形式。化合物A的晶型A具有包含以下特定峰的X射线衍射图()^1.5418A):<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>化合物A的晶型A还可以具有包含以下其它的峰的X射线衍射图(bl.5418A):_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>化合物A的晶型A还可以通过选自上面列出的10个峰中的3个或更多个峰的任何组合来表征。化合物A的晶型A的代表性粉末X射线衍射图显示于图3。在不希望受到理论束縛的情况下，化合物A能够容易地形成其中溶剂分子可以占据晶格点阵中的位置的结构。这些溶剂化物在天然条件下不一定是化学计量量的，可以由一种纯的溶剂化物(例如，化合物A的甲醇化物和化合物A的四氢呋喃化物)组成，或者可能包括一种以上的溶剂成分(例如甲醇和乙醚)。溶剂分子通常位于化合物A分子所形成的口袋中。在某些情况下，这些口袋的体积对于掺入一定范围的溶剂来说是足够柔韧的，可引起该物质的总体结构的微小变化，因此在xrpd反射中有小的偏移。溶剂化物，包括具有相同总体结构的那些溶剂化物，是来自溶液饱和和结晶试验，从二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、异丙醇、2-丁酮、叔丁基曱基醚、甲苯、四氢呋喃、水、环己烷、环丙基甲基酮、1，2-二氯乙烷、三氟乙酸乙酯、氟苯六氟异丙醇、曱基九氟丁基醚、2-曱基-l-丙醇、硝基甲烷、丙腈、三氯乙烯、aaa-三氟甲苯、庚烷、二噁烷、乙腈中获得的，所述溶剂为纯溶剂或与另一种溶剂组合的形式。最常见的溶剂化物结构的x射线衍射图谱显示于图4，其通常包含在下列位置上的最强的峰<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>应当理解，图中所示的峰的相对强度可以随着样品在试验条件下的取向和所用仪器的类型和设置而变化，以至于本文所包括的xrd曲线的强度是示例性的，并不意味着用于绝对值的比较。化合物A的晶型A基本上不含溶剂。本文所用的术语"基本上不含溶剂，，是指仅具有轻微量的任何溶剂的晶型，例如具有总量为0.5重量％或更少的任何溶剂的晶型。任何溶剂(包括水)的总量可以是0.25重量％、0.1重量％、0.05重量％或0.025重量％或者更少的量。化合物A的晶型A也可以用DSC来表征。化合物A的晶型A当以10。C/分钟从25°C加热到325。C时会在210.1。C±1。C开始熔化。化合物A的晶型A的代表性的DSC曲线显示于图5。本发明的笫二方面提供了获得4-[3-(4-环丙烷羰基-哌溱-1-羰基)-4-氟-千基-2H-酞溱-l-酮(化合物A)的晶型A的方法，该方法包括使溶剂中的化合物A结晶，随后用顶替剂将溶剂从晶型中替换出来。所述的顶替剂可以是水或醇和水的混合物。在第一个实施方案中，该方法包括以下步骤(i)使舡[3-04-环丙烷羰基-哌溱-l-羰基)4-氟-千基l-2H-肽溱-l-酮(化合物A)从溶剂中结晶；(ii)如果最初的溶剂不是乙醇，则用乙醇处理结晶的化合物A;(Hi)用水处理结晶的化合物A，以除去所捕获的乙醇；(")将所得产物干燥。在最初结晶中使用的溶剂可以是例如二氯曱垸或乙腈。获得晶型A的方法一般来说可以包括溶剂的替换。已经发现化合物A以下述方式结晶形成晶格点阵中的通道，其可以捕获溶剂，从而使溶剂难以移动。第一个实施方案中的方法可以用于特别是当化合物A结晶中所用的溶剂是二氯甲烷时。用乙醇作为溶剂交换二氯曱烷的步骤可以通过在大气压强下、在乙醇存在下蒸馏化合物A的溶剂来实现。当探头温度达到乙醇的沸点例如至少73。C时完成所述的交换。具体而言，该交换可以通过蒸馏掉大多数的DCM、随后加入一定体积的乙醇来实现。接着持续该蒸馏，用等体积的乙醇分批替换馏出液。将化合物A从乙醇溶剂中结晶可以通过冷却溶液至15。C以下、优选低于10。C、更优选约8°C来实现。随后化合物A的晶体可以通过过滤从溶液中分离。结晶的化合物A可以用水处理以除去所捕获的乙醇，方法是通过将结晶物悬浮于水中并在回流温度下加热足够长的时间，例如至少3小时，优选约4小时。结晶的化合物A可以通过过滤从水中的混悬液中分离。干燥上述步骤所得的产物是很容易实现的。例如，通过将产物在烘箱中于温度至少60。C、优选约70。C下加热来实现。在另一个这类实施方案中，该方法包括以下步骤(i)获得包含溶剂的化合物A的结晶形式；(ii)如果在合成结晶形式的化合物A中所用的最初溶剂不是水和d-2醇(即曱醇、乙醇)的混合物的话，将结晶形式的化合物A用水和Q-2醇的混合物处理；(ii)将所得产物干燥。所得产物可以用水和d.2醇的混合物进一步处理并干燥，以便进一步分离化合物A的晶型A。水和Cw醇的混合物优选为2:1到1:2的体积比，更优选1.5:1到1:1.5的体积比。特别优选的混合物是1份的水对1.2份的d—2醇。另一个特别优选的混合物是2份的水对1份的Cw醇。该d-2醇优选乙醇。结晶形式的化合物A可以通过将化合物A从溶剂中结晶而获得，如上所述。在步骤(ii)中的溶剂处理可以通过将化合物A悬浮于水和C,-2醇的混合物中并在搅拌下加热回流来实现。其随后可以被冷却到55-65°C并过滤，例如通过硅藻土层过滤。该滤层可以用水和Cu醇的混合物洗涤，随后在环境压力(通常为1大气压)或更高压力下蒸馏。蒸馏可以被终止以获得混悬液，将其置于室温下，随后过滤。所得滤饼可以用水洗涤。干燥上述步骤所得的产物是很容易实现的。例如，通过将产物在烘箱中于温度至少50。C、优选约60。C下加热来实现。进一步的处理可以以类似于上述的方式进行。在第三个实施方案中，该方法包括(i)将化合物A悬浮于作为溶剂的水和Cw醇的混合物中；(ii)将混悬液加热回流；(iii)冷却该溶液并用化合物A的晶型A种晶；(iv)将所得产物干燥。所得产物可以用水和d-2醇的混合物进一步处理并干燥，以便进一步分离化合物A的晶型A。水和Cw醇的混合物优选为2:1到1:5的体积比，更优选1:2到1:4的体积比。特别优选的混合物是1份水对3份的C,-2醇。该d-2醇优选乙醇。步骤(iii)可以包括将所述溶液冷却至65-75。C之间(例如70。C)并过滤，例如经硅藻土层过滤。用水和d-2醇的混合物洗涤该过滤层，然后蒸馏(例如在环境压力下或上述条件下)。将所得滤液冷却至40-50。C之间(例如45。C)后可以进行种晶。所得混悬液可以在2-3小时(例如2.5小时)内冷却至环境温度(例如20。C)，并在所述温度下保持足够长的时间使得结晶形成。此过程可能在12-24小时之间，并且可能为约16小时。该过程结束时，再加入水。加水的量约等于所存在的总溶剂(水和C，.2醇)的体积，并且要緩慢地加入，例如持续4-6小时(例如5小时)的时间。加水后可以将该混悬液保持在环境温度下例如2小时。然后可以过滤该混悬液，用C,—2醇和水的混合物(以1:3到1:2，例如1:2.3的比例)洗涂所得滤饼。对上述步骤所得产物进行干燥很容易实现。例如，通过将所述产物在烘箱内在真空中于40-60。C的温度下加热。本发明的第三方面提供了从化合物B合成化合物A的方法，包括以下步骤(i)以可控的方式将预先混合的三乙胺和环丙烷甲酰氯在适合的有机溶剂(例如DCM(二氯甲烷))中的溶液加入在相同有机溶剂中的化合物B中，同时使溶液温度控制在20。C以下。在某些实施方案中，所述方法还包括以下步骤(ii)搅动(例如搅拌)从(i)中所得的溶液直至反应完全，同时保持该溶液的温度低于20°C。在步骤(i)中，溶液的加入可以以逐滴加入的方式进行。该方法比WO2004/080976所述的方法更易控制，使酰氯的加成有更强的区域选择性。现有技术中可控性较差的方法可能导致酰氯加成在酞嗪酮的氮和/或氧上，以及加成在所期望的哌淀的氮上。优选上述方法在氮气中进行。还优选将步骤(ii)中的溶液温度保持在10-15°C。上述反应的产物优选通过至少一步的水洗步骤进行后处理。更加优选的后处理包括起始和最终的水洗步骤，以及先后使用稀酸(例如5%柠檬酸溶液)和稀碱(例如5%碳酸钠溶液)的中间的洗涤步骤。本发明的第四方面提供了从化合物D合成化合物A的方法，该方法包括将化合物D与l-(环丙基羰基)哌溱或其与无机酸的盐在酰胺偶联剂和碱例如胺(例如^又胺，如二异丙基乙胺)存在下进行反应。所述的无机酸盐可以是例如盐酸盐。将l-(环丙基羰基)哌嗪或其与无机酸的盐加入化合物D可以在任何适宜的溶剂例如乙腈中进行。酰胺偶联剂优选2-(lH-苯并三唑-l-基)-l，l，3，3-四甲基脲错六氟磷酸盐(HBTU)。优选在一定时间如30分钟内将l-(环丙基羰基)哌溱或其与无机酸的盐的溶液、二异丙基乙胺和化合物D加入。所得溶液的温度可以保持在25。C或更低(或者20。C或更低，例如18。C)。在其加入后，所得溶液可以静置一段时间。优选的温度方案是使溶液保持室温2小时。所得的化合物A可以通过将溶液冷却到低于10。C(或低于5°C，例如3。C)一段时间(例如1小时)，随后过滤而从溶液中分离。所得的化合物A可以用例如冷的乙腈洗涤。在WO2004/080976中，公开了化合物D的以下路线<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>在0。C下将亚磷酸二曱酯滴加到甲醇钠在甲醇的溶液中。接着将2-羧基苯甲醛(H)以在甲醇中的浆体形式分批加入到反应混合物中，同时保持温度低于5。C。将所得浅黄色溶液历经1小时加温到20。C。向反应中滴加入曱磺酸，并将所得白色混悬液真空蒸发。白色残余物用水猝灭，萃取到氯仿中。合并的有机萃取物用水洗涤，用MgS04干燥，真空蒸发得到(3-氧代-l,3-二氢-异苯并呋喃-l-基)膦酸二甲酯(G),为白色固体(产率95%)。接着将其不经进一步纯化而用于下一阶段。向在四氢呋喃中的(3-氧代-l，3-二氢-异苯并呋喃-l-基)膦酸二甲酯(G)和2-氟-5-甲酰基节腈(F)的混合物中历经25分钟滴加三乙胺，同时维持温度低于15。C。将反应混合物历经1小时緩慢加温至20°C，真空浓缩。白色残余物在水中浆体化30分钟，过滤，用水、己烷和乙醚洗涤并干燥，得到2-氟-5-(3-氧代-3H-异苯并呋喃-l-亚基甲基)节腈(E)，其为50:50的E和Z异构体的混合物(产率96%)。向2-氟-5-(3-氧代-3H-异苯并呋喃-l-亚基曱基)千腈(E)在水中的混悬液中加入氢氧化钠水溶液，将反应混合物在氮气下加热到卯。C持续30分钟。将反应混合物部分冷却到70°C，加入水合肼，在70°C搅拌18小时。将反应冷却到室温，并用2MHCl酸化到pH4。混合物搅拌10分钟并过滤。所得固体用水、己烷、乙醚、乙酸乙酯洗涤并干燥，得到浅粉红色粉末状的化合物D(产率77%)。还希望拥有合成化合物D的改进方法。因此，本发明的第五方面提供了合成化合物D的方法，包括以下步骤(a)从2-羧基苯曱醛(H)合成(3-氧代-l，3-二氢-2-苯并呋喃-l-基)膦酸二乙酯(G，)；(b)从(3-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-1-基)膦酸二乙酯合成2-氟-s-[(E/z)-(s-氧代-:2-苯并呋喃-i(j/o-亚基)曱基i苄腈(E)。优选在该合成中不分离化合物G，。该方法避免了在醇溶液中使用不稳定的亚磷酸二甲酯的钠盐(Pelchowicz，W/.C7^附.Soc，4348-4350(1961))。优选步骤(a)在2-曱基四氢呋喃中发生，其中亚磷酸二乙酯的钠盐是稳定的。该盐可以通过将亚磷酸二乙酯加入冷却的叔戊醇钠的2-曱基四氢呋喃溶液而在原位形成。与亚磷酸二乙酯的钠盐反应之后与甲磺酸反应。步骤(b)可以在2-甲基四氢呋喃中进行，同时加入三乙胺。合成化合物D的方法可以进一步包含以下步骤(c)从化合物E通过与水合肼反应合成2-氟-5-|(4-氧代-3，4-二氢酞嗪-l-基)甲基l千腈(ED):和(d)通过与氢氧化钠的反应从化合物ED合成化合物D。步骤(c)可以通过使用1.1-1.3当量的在四氢呋喃中的水合肼来完成，随后使用乙酸中和过量的水合肼。本发明的第六方面提供了化合物ED:及其在化合物D的合成中的应用。本发明的另一方面提供了l-(环丙基羰基)哌嗪的无机酸盐，以及通过将哌,与乙酸反应、随后加入环丙烷甲酰氯的其合成方法。本发明的第七方面提供了包含第一方面的化合物和可药用的载体或稀释剂的药物组合物。本发明的第八方面提供了用于治疗人体或动物体的方法的第一方面的化合物。本发明的第九方面提供了如本发明第一方面所定义的化合物在制备抑制PARP活性的药物中的用途。本发明的其他方面提供了如本发明第一方面所定义的化合物在制备治疗下述疾病的药物中的用途血管病；败血症性休克；局部缺血损伤；神经毒性；出血性休克；病毒感染或者通过抑制PARP活性而改善的疾病。本发明的另一方面提供了如本发明第一方面所定义的化合物在制备用作癌症治疗中的辅剂或者用于使胂瘤细胞对电离辐射或化疗剂变得敏感的药物中的用途。本发明的其他方面提供了能够通过抑制PARP得到緩解的疾病的治疗，其包括向需要治疗的个体施用治疗有效量的如第一方面所定义的化合物，优选以药物组合物的形式施用，和治疗癌症，其包括向需要治疗的个体组合施用治疗有效量的第一方面所定义的化合物与电离辐射或化疗剂的组合，其中第一方面所定义的化合物优选以药物组合物的形式，与电离辐射或化疗剂同时或先后施用。在本发明的其他方面中，所述化合物可用于制备治疗缺乏同源重组(HR)依赖的DNA双链断裂(DSB)修复活性的癌症的药物，或用于治疗患有缺乏HR依赖的DNADSB修复活性的癌症的患者，其包括向所述患者施用治疗有效量的所述化合物。HR依赖的DNADSB修复途径通过同源性机制修复DNA中的双链断裂(DSB),以重新形成连续的DNA螺旋(K.K.Khanna和S.P.Jackson,Nat.Genet27(3):247-254(2001))。HR依赖的DNADSB修复途径的组分包括但不限于ATM(NMJJ00051)、RAD51(NM002875)、RAD51L1(NM—002877)、RAD51C(NM_002876)、RAD51L3(NM—002878)、DMC1(NM—007068)、XRCC2(NM_005431)、XRCC3(NM—005432)、RAD52(醒一002879)、RAD54L(薩一003579)、RAD54B(匪一012415)、BRCA1(醒—007295)、BRCA2(腿一000059)、RAD50(NM一005732)、MRE11A(NM—005590)和NBS1(NM—002485)。参与HR依赖的DNADSB修复途径的其他蛋白质包括调节因子如EMSY(Hughes-Davies等人，Cell,115，523-535页)。Wood等，Science,291，1284-1289(2001)中也描述了HR组分。缺乏HR依赖的DNADSB修复的癌症可能包含或由一种或多种癌细胞組成，其与正常细胞相比通过该途径来修复DNADSB的能力降低或丧失，即在所述的一种或多种癌细胞中，HR依赖的DNADSB修复途径的活性降低或丧失。在患有缺乏HR依赖的DNADSB修复的癌症患者的一种或多种癌细胞中，HR依赖的DNADSB修复途径的一种或多种组分的活性可能丧失。例如Wood等，Science,291，1284-1289(2001))，包括以上所列出的组分。在一些优选的实施方案中，所述癌细胞可以具有BRCA1和/或BRCA2缺陷表型，即在癌细胞中BRCA1和/或BRCA2活性降低或丧失。例如，借助核酸編码中的突变或多态性，或者通过编码调节因子的基因、例如编码BRCA2调节因子的EMSY基因的扩增、突变或多态性(Hughes-Davies等，Cell,115,523-535),具有这种表型的癌细胞可能在BRCA1和/或BRCA2中有缺陷，即BRCA1和/或BRCA2在这些癌细胞中的表达和/或活性可能降低或丧失。BRCA1和BRCA2是已知的肿瘤抑制基因，其野生型等位基因在杂合子携带者的肿瘤中常常丟失(JasinM.，Oncogene,21(58)，8981-93(2002);Tutt等，TrendsMolMed"8(12),571-6,(2002))。本领域对BRCA1和/或BRCA2突变与乳腺癌的关联特征进行了充分描述(Radice，P.J.，ExpClinCancerRes"21(增刊3)，9-12(2002))。也已知編码BRCA2结合因子的EMSY基因的扩增与乳腺癌和卵巢癌有关。BRCA1和/或BRCA2突变的携带者患卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌的风险也较高。在一些优选实施方案中，所述个体是具有BRCA1和/或BRCA2或其调节因子的一种或多种变异(例如突变和多态性)的杂合子。BRCA1和BRCA2变异的检测方法在本领域内是熟知的，描述于例如EP699754、EP705卯3、Neuha獄n，S丄.和Ostrander，E.A.，Genet.Test,1，75-83(1992);Chappnis,P.O.和Foulkes，W.D.，CancerTreatRes,107，29-59(2002);JanatovaM.等，Neoplasma,50(4)，246-50(2003);Jancarkova,N.，CeskaGynekol"68(1),11-6(2003)中。在Hughes-Davies等，Cell,115，523-535中描述了BRCA2结合因子EMSY扩增的测定方法。与癌症有关的突变和多态性可以在核酸水平上通过检测变异核酸序列的存在或者在蛋白质水平上通过检测变异(即突变或等位基因变异)多肽的存在来进行检测。附图简述图1显示了在水处理之后(实施例l)化合物A的NMR;图2显示了在水处理之后(实施例l)化合物A的晶型A的粉末X射线衍射图谱；图3显示了化合物A的晶型A的代表性的粉末X射线衍射图谱；图4显示了化合物A的溶剂化物形式的代表性的粉末X射线衍射图谱；图5显示了化合物A的晶型A通过以10。C/分钟从25。C加热到325。C所得的代表性的DSC曲线。用途本发明提供了化合物A的晶型A作为活性化合物，具体而言是在抑制PARP活性中具有活性。本文所用的术语"活性，，涉及能够抑制PARP活性的化合物。在下文实施例中描述了一种可以方便地用于评估由化合物所提供的PARP抑制作用的测定法。本发明还提供了抑制细胞中PARP活性的方法，其包括使所述细胞与有效量的活性化合物、优选以可药用的组合物形式接触。该方法可以在体外或体内实施。例如，可以体外培养细胞样品，并使活性化合物与所述细胞接触，观察该化合物对这些细胞的作用。作为"作用"的实例，可以测定在某一时间完成的DNA修复的量。若发现活性化合物对细胞发挥影响，则这可以用作化合物在治疗携带相同细胞型细胞的患者的方法中的效能的预后或诊断标志。就治疗病症而言，本文所用的术语"治疗，，一般涉及人类或动物(例如在兽医应用中)的治疗和疗法，其中达到了所需的一些疗效，例如病症进展的抑制，包括#速度的降低、进展速度的停止、病症的改善和病症的治愈。也包括作为预防性措施的治疗(即预防)。本文所用的术语"辅剂，，涉及活性化合物与已知治疗手段的联合应用。这类手段包括用于治疗不同癌症类型的药物细胞毒方案和/或电离辐射。具体而言，该活性化合物已知可增强多种癌症化学疗法的治疗作用，包括用于治疗癌症的拓朴异构酶类毒物(例如托泊替康、伊立替康、卢比替康)、大多数已知的烷化剂(例如DTIC、替莫唑胺)和基于铂的药物(例如卡铂、顺铂)。活性化合物也可以用作抑制PARP的细胞培养添加剂，例如用来4吏细胞在体外对已知化学剂或电离辐射治疗敏感。活性化合物也可以用作体外测定法的一部分，例如用来测定候选宿主是否可能从所述化合物的治疗中受益。施用活性化合物或包含活性化合物的药物组合物可以借助任何方便的施用途径对个体施用，无论全身性/外周性还是在所需作用部位上施用，包括但不限于口服(例如摄食)；局部(包括例如透皮、鼻内、眼、含服和舌下)；肺(例如吸入或吹入疗法，例如使用气雾剂，例如通过口或鼻施用)；直肠；阴道；胃肠外，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、脊柱内、囊内、嚢下、眼眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内注射；通过植入药库，例如皮下或肌内植入。所述个体可以是真核生物、动物、脊推动物、哺乳动物、啮齿类动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长目、猿猴(例如猴子或猿)、猴(例如绒猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。制剂尽管该活性化合物可能单独施用，但优选以药物组合物(例如制剂)呈递，该组合物包含如上所定义的活性化合物以及一种或多种可药用的载体、助剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、緩冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员熟知的其他材料以及任选的其他治疗剂或预防剂。因而，本发明进一步提供了如上所定义的药物组合物和制备药物组合物的方法，该方法包括将如上所定义的活性化合物与本文所述的一种或多种可药用的载体、赋形剂、緩冲剂、助剂、稳定剂或其他材料混合，以使活性化合物保持晶型A的形式。本文所用的术语"可药用的"涉及化合物、材料、组合物和/或剂型，它们在合理的医学判定范围内适用于接触个体(例如人)的组织，而不产生过分的毒性、刺激性、过敏反应或者其他问题或并发症，并与合理的效益/风险比相称。每种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是"可接受的"。适合的载体、稀释剂、赋形剂等可以参见标准的药学著作。例如参见"药物添加剂手册",第2版(M.Ash和I.Ash编辑)，2001(SynapseInformationResources,Inc.，Endicott，纽约，美国)；"雷明顿药物科学"，第20版，Lippincott,Williams&Wilkins出版，2000;和"药用赋形剂手册，，，第2版，1994。制剂可以方便地以单位剂型呈递，可以借助药学领域熟知的任意方法制备。这类方法包括使活性化合物与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。一般而言，制剂制备如下使活性化合物与液体载体或微细粉碎的固体载体或者与这两种载体一起均匀和紧密地结合，然后如果必要时-使产物成形。制剂可以是混悬剂、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁嚢剂、丸剂或糊剂的形式。适合于口服施用(例如摄食)的制剂可以呈递为离散的单位，例如胶嚢剂、扁嚢剂或片剂，每一单位含有预定量的活性化合物；粉剂或颗粒剂；在水性或非水性液体中的混悬剂；或者糊剂。片剂可以借助常规手段制备，例如，任选地与一种或多种附属成分压制或模制。压制片可以这样制备在适合的机器中压制活性化合物的自由流动形式，例如粉末或颗粒，其任选地混合有一种或多种粘合剂(例如聚维酮、明胶、阿拉伯胶、山梨醇、黄蓍胶、羟丙甲基纤维素)、填充剂或稀释剂(例如乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅)、崩解剂(例如幾乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂或湿润剂(例如月桂基硫酸钠)和防腐剂(例如对-羟基苯甲酸甲酯、对-羟基苯曱酸丙酯、山梨酸)。才莫制片可以这样制备在适合的机器中将用惰性液体稀释剂湿润了的粉末化合物的混合物模压。片剂可以任选地包衣或划痕，并且可以配制为提供其中的活性化合物的緩释或控释形式，例如使用不同比例的羟丙曱基纤维素，以提供所需的释放特性。片剂可以任选地带有肠溶包衣，以提供在肠部分而非胃中的释放。胶嚢可以包含在混悬液中的活性化合物。适合于局部施用(例如透皮、鼻内、眼、含服和舌下)的制剂可以被配制成糊剂。适合于对眼睛局部施用的制剂也包括滴眼剂，其中活性化合物悬浮在适合的栽体中，尤其是用于活性化合物的水性溶剂。其中载体是固体的适合于鼻施用的制剂包括粗粉，其粒径例如在约20至约500微米的范围内，采取鼻吸的方式施用，也就是说从靠近鼻子的装有粉剂的容器中通过鼻道快速吸入。适合于吸入施用的制剂包括从加压包装中以气雾剂呈递的那些制剂，采用适合的抛射剂，例如二氯二氟曱坑、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。剂量可以理解的是，活性化合物和包含活性化合物的组合物的适当剂量可以因患者而异。确定最佳剂量一般而言涉及本发明治疗的治疗效益水平与任何风险或有害副作用之间的平衡。所选择的剂量水平将依赖于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性、施用途径、施用时间、化合物的排泄速率、治疗的持续时间、联合使用的其他药物、化合物和/或材料，以及患者的年龄、性别、体重、条件、一般健康状况与既往病史。化合物的量和施用途径最终将取决于医师，不过一般而言，剂量为在作用部位达到可实现所需效果的局部浓度，而不导致实质性伤害或有害的副作用。体内施用可以以单一剂量实现，其在治疗过程中连续地或间歇地(例如按适当间隔以分次剂量)进行。确定最有效的施用手段和剂量的方法是本领域技术人员所熟知的，并且随着治疗所用的制剂、治疗目的、所治疗的靶细胞和所治疗的个体而异。可以以主治医师所选择的剂量水平和方式进行单次或多次施用。一般而言，该活性化合物的适宜剂量为每日约10mg到约600mg/m个体体表面积。原料(D)通过WO2004/080976中所公开的方法合成。才法制备型HPLC样品用Waters质量-定向式纯化系统纯化，采用Waters600LC泵、WatersXterraCI8柱(5jum，19mmx50mm)和MicromassZQ质语仪，按阳离子电喷雾电离模式操作。流动相A(0.1。/。曱酸水溶液)和B(0."/。曱酸的乙腈溶液)按梯度使用；5%的B至100%历经7分钟，保持3分钟，流速20ml/分钟。分析型HPLC-MS分析型HPLC用SpectraSystemP4000泵和JonesGenesisC18柱(4pm50mmx4.6mm)进行。流动相A(O.l%甲酸水溶液)和B(乙腈)按梯度使用o:NIN5%B达1分钟，5分钟后升至98%B,保持3分钟，流速2ml/分钟。用TSPUV6000LP检测器在254nm紫外下检测，PDA范围210-600nm。质谱仪是FinniganLCQ，按阳离子电喷雾模式操作。醒R^NMR谱利用BrukerDPX300光傳仪在300MHz下记录。化学位移按百万分之份数(ppm)、相对于四甲基硅烷内标的5比例进行报告。除非另有说明，否则全部样品均溶解于DMSO-dU中。W^/2曙疯-5-^/-歲^-3，孓二蟲-^參/-^f差)-革ff^农r差斷o在室温下、在氮气中向搅拌下的原料D(850g)在二曱基乙酰胺(DMA)(3561ml)的溶液中一次性地加入HBTU(2-(lH-苯并三唑-l-基)-l，l，3，3-四甲基脲錄六氟磷酸盐)(1402g)。接着加入Hunig碱(iPr2NEt，1096ml)，同时保持温度为15-25。C，随后加入l-Boc-哌漆(637g)在DMA(1428ml)中的溶液，同时保持温度为15-25°C。将溶液在室温下搅拌2小时，取样检验是否完全反应(HPLC)。一旦反应完全，将溶液加入剧烈搅拌的水中(17085ml)，同时保持温度为15-25°C，滤出固体，用水(2x7131ml)、己烷(2x7131ml)和曱基叔丁基醚(MTBE)(2x3561ml)洗涤。接着将固体干燥过夜，随后取样检验含水量和化学纯度。接着重复该反应，见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>a.超过100。/。的产率是由于非代表性的取样所致。在室温下、在氮气中向搅拌下的工业用含甲醇的酒精(IMS)(2200ml)和浓盐酸(4400ml)的溶液中分批加入化合物C(2780.2g),通过加入的速率来控制起泡。接着将溶液在15-25。C搅拌30分钟，取样检验反应是否完全(HPLC)。一旦反应完成，蒸发溶液以除去任何IMS,水相用CH2C12(2x3500ml)萃取，随后用浓氨水将pH调节至〉8。接着将所得浆体用水(10000ml)稀释，用CH2Cl2(4x3500ml)萃取，用水洗涤(2x2000ml)，用MgSO4(250g)干燥并蒸发。随后粗产物在CH2C12(3500ml)中形成浆体，加入到MTBE(5000ml)中。过滤所得混悬液，在50。C干燥过夜，得到611.0g(58.5。/。产率)的物质，纯度为94.12%。^4-/3-~-环丙處漠差-^參7-羰4)一-恭，差/-^/-^养7-^「4)在氮气中向搅拌下的化合物B(12卯g)在CH2Cl2(15480ml)中的混悬液中滴加预先混合的三乙胺(470ml)和环丙烷曱酰氯(306ml)在CH2C12(1290ml)中的溶液，同时保持温度低于20。C。随后将溶液在10-15°C搅拌15分钟，取样检验是否反应完全。发现反应混合物仅包含1.18%的原料B，因此认为反应完全，接着将该批次进行后处理。反应混合物用水(7595ml)、5。/。柠檬酸溶液(7595ml)、5。/o碳酸钠(7595ml)溶液和水(7595ml)洗涤。接着有机层用硫酸镁(500g)干燥。接着分离包含产物的CBbCl2层，经硅藻土过滤，装入25L容器中。随后在大气压下蒸馏出CH2Cl2(8445ml),并加入乙醇(10000ml)。接着继续蒸馏，每除去4000ml馏出液用乙醇(4000ml)代替，直到探头温度达到73.7°C。随后减少反应体积(至7730ml)，直到探头温度达到78.9。C，将溶液冷却到8°C过夜。随后滤出固体，用乙醇(12卯ml)洗涤，在70°C干燥过夜。产量-1377.3g(90。/。)。HPLC纯度(99.34。/。|面积％1)。经GC检查，包含4.93%的乙醇和0.45%的CH2C12。按照实施例1的方法制备的化合物A(1377,0g)在水(13770ml)中的混悬液加热回流4小时，冷却到室温并过滤。固体用水(2754ml)洗涤，在70。C干燥过夜。产量-1274.8g(92.60/。)。HPLC纯度(99.49%面积％])。经GC检查，包含0.01%的乙醇和0.01%的CH2C12。经过水处理后的化合物A的，HNMR(DMSO-d6)图谱显示于图1。经过水处理后的化合物A的粉末XRD图i普显示于图2，其显示了该化合物是晶型A。实施例2:使用l-(环丙基羰基)哌。秦的化合物A的备选合成方案才法(^岸^f关施辦3X)醒R'HNMR用BrukerDPX400光i瞽计在400MHz下记录。化学位移按百万分之份数(ppm)、相对于四曱基硅烷内标的5比例进行报告。除非另有说明，否则全部样品均溶解于DMSO-d6中。质镨质谱用串联质谱法(MS/MS)在安捷伦XCT离子阱质镨仪上记录，用于结构确认。该仪器以阳离子电喷雾方式操作。橫A在氮气中、在搅拌下将2-氟-5-l(4-氧代-3，4-二氢酞奉-l-基)曱基]笨甲酸(D)(15.23g，51.07mmol)悬浮于乙腈(96ml)中。加入二异丙基乙胺(19.6ml，112.3mmol)，随后加入1-环丙基羰基派溱(I)(9.45g，61.28mmol)和乙腈(lml)。将反应混合物冷却到18。C。历经30分钟，加入O-苯并三唑-l-基-四甲基脲错六氟磷酸盐(25.18g，66.39mmo1)，反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物冷却到3°C,在该温度下保持l小时，随后过滤。滤饼用冷的(3。C)乙腈(20ml)洗涤，随后在最多40。C下真空干燥，得到浅黄色固体的标题化合物(20,21g)。质谱:MH+4351H匪R(400MHz，DMSO-d6)S:0.70(m，4H)，1.88(brs,1H)，3.20(brs，2H)，3.56(m，6H)，4.31(s,2H)，7.17(t，1H)，7.34(dd，1H),7.41(m，1H)，7.77(dt,1H)，7.83(dt，1H)，7.92(d，1H),8.25(dd,1H)，12.53(s,1H)。实施例3:使用l-(环丙基羰基)哌唤盐酸盐的化合物A的备选合成方盡oW/-(环丙差蔬4)^漭#虔^^')在氮气中、在搅拌下将乙酸(700ml)与哌嗪(50.00g，0,581mol)历经15分钟分批反应。将反应混合物加温到40。C，并保持在该温度下，直到获得反应完全的溶液。将环丙烷甲酰氯(59，2ml，0.638mol)历经15分钟加入。反应混合物在室温下搅拌过夜。过滤反应混合物，减压蒸馏滤液，直到收集到约430ml馏出液。将甲苯(550ml)加入反应混合物，继续减压蒸馏，直到再收集到400ml馏出液。再加入甲苯(550ml)并继续减压蒸馏，直到收集到350ml馏出液。所得浆体用曱苯(200ml)稀释，搅拌过夜。再加入甲苯(500ml)，以4吏浆体流动。过滤该浆体，用曱苯(100ml)洗涤，在40。C真空干燥，得到灰白色固体状的标题化合物(86.78g)。质谱MH+1551HNMR(400MHz,DO)5:0.92(m，4H)，1.98(m，1H)，3,29(m，2H)，3.38(m，2H)，3.84(m，2H)，4.08(m，2H)。在氮气中、在搅拌下将2-氟-5-[(4-氧代-3，4-二氢酞嗪-l-基)甲基l苯曱酸(D)(0.95g，3.19mmo1)悬浮于乙腈(4ml)中。力口入2-(lH画苯并三唑國l-基)-l,l，3，3-四甲基脲镇六氟磷酸盐(HBTU)(1.45g，3.83mmo1)，随后加入1-环丙基羰基哌溱盐酸盐(I，)(0.73g，3.83mmo1)。历经3分钟加入二异丙基乙胺(1.39ml，7.98mmo1)，在室温下搅拌反应混合物过夜。将反应混合物冷却到5。C，并在该温度下保持l小时，随后过滤。滤饼用冷的(3。C)乙腈(2ml)洗涤，随后在最多40。C下真空干燥，得到浅黄色固体状的标题化合物(0.93g)。^^合錄^^f寧^溶该哞,潜^将来自步骤(b)的化合物A(9.40g，21.64mmol)悬浮于水(100ml)和曱醇(120ml)的混合物中。混悬液在搅拌下加热回流。所制备的混浊溶液随后冷却到60°C,通过一层珍珠岩助滤剂(harborlite)过滤。滤层用水(5ml)和曱醇(5ml)的混合物洗涤。滤液在大气压下蒸馏，直到收集到115ml馏出液。接着停止蒸馏，将所制备的混悬液冷却到室温。搅拌所得混悬液约18小时，随后过滤。滤饼用水(20ml)洗涤，随后在最多60。C下真空干燥，得到标题化合物的晶型A,为白色固体(8.67g)。质傳:MH+4351HNMR(400MHz，DMSO画d6)5:0.70(m，4H)，1.88(brs，1H)，3.20(brs，2H)，3.56(m，6H)，4.31(s，2H)，7.17(t，1H)，7.34(dd，1H)，7.41(m，1H),7.77(dt,1H)，7.83(dt，1H)，7.92(d，1H)，8.25(dd，1H)，12.53(s，1H)。问^乙寧^溶濕哞重潜^将来自步骤(b)的化合物A(9.40g，21.64mmol)悬浮于水(100ml)和乙醇(50ml)的混合物中。混悬液在搅拌下加热回流。所制备的混浊溶液随后冷却到60。C,通过一层harborlite过滤。滤层用水(5ml)和乙醇(5ml)的混合物洗涤。滤液在大气压下蒸馏，直到收集到53ml馏出液。接着停止蒸馏，将所制备的混悬液冷却到室温。搅拌所得混悬液约18小时，随后过滤。滤饼用水(20ml)洗涤，随后在60。C下真空干燥，得到标题化合物的晶型A，为白色固体(8.74g)。质谱:MH+4351H画R(楊MHz，DMSO画d6)5:0.70(m，4H)，1.88(brs，1H)，3.20(brs，2H),3.56(m，6H)，4.31(s，2H)，7.17(t，1H)，7.34(dd，1H)，7.41(m，1H)，7.77(dt，1H)，7.83(dt，1H)，7.92(d，1H)，8.25(dd，1H)，12.53(s，1H)。实施例4:化合物D的备选合成方案EDD(^2-恭5-/(￡^>0真^-2-^并^喊-7卩历-亚差)f差/卡库在氮气下将叔戊醇钠(99.00g,0,854mol)和2-甲基四氢呋喃(960ml)冷却到2。C。滴加亚磷酸二乙酯(110ml，0.855mol),同时保持温度〈5。C。加入2-甲基四氢呋喃(40ml)，用于清洗加样管路。在2。C搅拌反应1小时40分钟。加入2-羧基苯曱醛(H)(80g，0.533mol)在2-甲基四氢呋喃(200ml)中的溶液，在加入过程中保持温度〈7。C。加入用于清洗管路的2-曱基四氬呋喃(40ml)。反应混合物加温到20。C,在20。C保持20分钟。历经1小时10分钟加入甲磺酸(66ml，1.01mo1)，随后加入2-甲基四氬呔喃(40ml)。反应混合物在20。C搅拌过夜。加入甲磺酸(7ml，0.101mol)，随后加入2-甲基四氢呋喃(7ml)，在20。C再搅拌反应4小时。在室温下加入水(400ml)，将所得两相混合物在室温下搅拌20分钟。除去下层的水层，向有机层中加入碳酸氬钾(53.50g，0.534mol)在水(400ml)中的溶液。该两相混合物在室温下搅拌20分钟，随后除去下层的水溶液。保留有机部分((3-氧代-l，3-二氬-2-苯并呋喃-l-基)膦酸二乙酯的溶液)。向有机部分中加入2-氟-5-甲酰基苄腈(64g，0.429mol)，混合物在20。C搅拌。滴加三乙胺(66ml，t),473mo1)，随后加入2-曱基四氢呋喃(7ml)。反应混合物在20°C搅拌过夜，接着冷却到5。C,过滤，以工业用含曱醇的酒精(480ml)洗涤，随后在最多40。C下真空干燥，得到标题化合物(91.2g)。质谱:MH+2661HNMR(400MHz，DMSO画d6)5:6.89(s,1H，主要异构体)，6.94(s，1H，次要异构体)，7.40(dd，1H，次要异构体)，7.58(t，1H，两种异构体都有)，7.70(t，1H，两种异构体都有)，7.89(t，1H，两种异构体都有)，7.95(d，1H，两种异构体都有)，8.05(d，1H，两种异构体都有)，8.15(m，2H，主要异构体)。2-秦5-/(^-真^^,:產^秦/-差)f差/f#将2-氟-5-(E/Z)-(3-氧代-2-苯并呋喃-l(J^-亚基)曱基l千腈(E)(20g，75.40mmol)和四氢呋喃(200ml)在室温下、在氮气中搅拌30分钟。加入一水合肼(4.40ml，90.53mmo1)，随后加入用于清洗管路的四氯呋喃(4ml)。反应混合物在室温下搅拌1小时45分钟。加入乙酸(1.10ml，19.20mmo1)，并将反应混合物加温到60。C。反应混合物保持在60°C过夜。将反应混合物冷却到50。C，滴加水(200ml)。在加入过程中温度保持在45。C。将反应混合物冷却到20。C，过滤，用水(30ml)和四氢呋喃(30ml)洗涤，接着在最多40。C下真空干燥，得到标题化合物(18.7g)。质谱:MH+2801H匪R(400MHz，DMSO-d6)5:4.38(s，2H)，7.46(t，1H)，7.72(m，1H),7.85(dt，1H)，7.92(m，2H)，7.99(d，1H)，8.27(dd，1H)，12.57(s，1H).^2-恭5-/^-真^^，(二產^参/-差)f差/^:f^卩A)2-氟-5-[(4-氧代-3，4-二氢酞嗪-l-基)甲基节腈(ED)(9.60g，34.37mmo1)和水(40ml)在20。C下搅拌。加入2M氬氧化钠(36ml，72.00mmo1)，将反应混合物加温到90°C，并在该温度下保持过夜。反应混合物冷却到室温并过滤。滤层用水(10ml)洗涤，将合并的滤液在60。C历经40分钟加入2MHC1(56ml，112.00mmol)中。所得混悬液冷却到50。C并过滤，用水(57ml)洗涤，在最多60。C下真空干燥，得到白色固体状的标题化合物(9.72g)。质谱:MH+2991H醒R,MHz,DMSO-d6)5:4.36(s，2H)，7.24(dd，1H)，7.59(m，1H)，7.84(dt，2H)，7.90(dt，1H),7.98(d，1H)，8.27(dd，1H)，12.59(s，1H)，13.22(brs，1H)。实施例5:化合物A从乙醇水溶液中的重结晶将4-(3-{4-(环丙基羰基)哌溱-1-基]羰基}-4-氟节基)酞嗪-1(211)-酮(化合物A)(20，00g,44.66mmol)悬浮在水(50ml)和乙醇(150ml)的混合物中。将混悬液在搅拌下加热回流。接着将所制备的溶液冷却到70。C并过滤。滤层用水(8ml)和乙醇(22ml)的混合物洗涤。将滤液在搅拌下冷却到45°C。加入4-(3-{[4-(环丙基羰基)哌噪-1-基羰基)-4-氟苄基)酞嗪-l(2H)-酮(化合物A)的晶型A(0.08g)，以向混合物中种晶。将所得混悬液历经2.5小时冷却到20。C，在该温度下再搅拌16小时，以使之结晶。历经5小时加入水(200ml)，同时保持温度在20。C。在加入结束之后，将混悬液在20。C保持2小时。过滤混悬液，滤饼用乙醇(24ml)和水(56ml)的混合物洗涤。排出分离的固体，在40-60。C真空干燥，得到灰白色固体的标题化合物(晶型A)(l8.1g)。获得图3-5的方法粉末XRD-图3(晶型A形式的化合物A)粉末X-射线衍射用BrukerD5000衍射仪记录(X-射线波长1.5418A,Cu源，电压40kV，灯丝发射40mA)。样品以0.02。的步长和4秒时间计数在2-40。的2e间扫描。粉末XRD-图4(溶剂化形式的化合物A)溶剂化物的粉末X-射线衍射采用装有弯曲位置灵敏探测器(范围为120°的26)的InelXRG-3000衍射仪进行记录(X-射线波长1.5418A，Cu源，电压40kV，灯丝发射30mA)。样品以0.03。的步长在2.5-40。的26间扫描，通常总收集时间为300秒。差示扫描量热法(DSC)-图5DSC使用具有TSO801RO机器人系统的梅特勒DSC820E进行记录。通常有少于5mg的物质装在带有穿孔盖子的40jil铝盘中，以10。C/分钟的恒定加热速率将其从25。C加热到325。C。用100ml/分钟的流速通入氮气。实施例6抑制作用为了评估活性化合物的抑制作用，利用下列测定法测定ICso值。将从Hela细胞核提取物中分离的哺乳动物PARP用Z-緩冲液(25mMHepes(西格玛公司(Sigma));12.5mMMgCl2(Sigma);50mMKC1(Sigma);ImMDTT(Sigma);10%甘油(Sigma);0.001%NP-40(Sigma);pH7.4)在96孔FlashPIates(商标)(NEN，UK)中孵育，加入不同浓度的所述抑制剂。全部化合物均稀释在DMSO中，最终测定浓度为lO-O.Ol)uM，DMSO的最终浓度为每孔1%。每孔的总试验体积为40(^1。在30。C下孵育10分钟后，加入10nl反应混合物引发反应，所述反应混合物中含有NAD(5|uM)、3H-NAD和30mer双链DNA-寡聚物。所指定的阳性和阴性反应孔与化合物孑L(未知的)一起处理，以计算酶活性％。然后将板子振摇2分钟，在30。C孵育45分钟。在孵育之后，向每孔加入50(^1的30%乙酸猝灭反应。然后将板子在室温下振摇l小时。将板子转移至TopCountNXT(商标)(Packard，UK)用于闪烁计数。所记录的值是对每孔计数30秒后得到的每分钟计数(cpm)。然后利用以下方程计算化合物的酶活性％:(未知的cpm-平均阴性cpm)抑制。/。100-(100x-)(平均阳性cpm-平均阴性cpm)计算ICs。值(抑制50%酶活性的浓度)，其是在某一范围内的不同浓度下测定的，通常从lOpM至O.OOlpM。这类ICs。值用作比较值，以确认增加的化合物效能。化合物A具有约5nM的IC50。强化因子计算活性化合物的强化因子(PFso),其为对照细胞生长的ICsc除以细胞生长+PARP抑制剂的ICso之比。对照和化合物处理的细胞的生长抑制曲线是在烷化剂甲磺酸曱酯(MMS)的存在下得到的。供试化合物使用0.2|aM的固定浓度。MMS的浓度为0-10|ig/ml的范围。利用磺基罗丹明B(SRB)测定法评估细胞生长(Skehan，P.等人，(1990)，"用于抗癌药物筛选的新的比色细胞毒性测定法"，J.Natl.CancerInst.82，1107-1112.)。将2,000个HeLa细胞接种到平底96孔微量滴定板的每孔中，体积为100|J,在37。C下孵育6小时。将细胞以单独的培养基或者含有终浓度为0.5、1或5|iM的PARP抑制剂的培养基替换。使细胞再生长1小时，然后向未处理的细胞或PARP抑制剂处理的细胞加入一定范围浓度的MMS(通常为0、1、2、3、5、7和10ing/ml)。使用单独的PARP抑制剂处理过的细胞来评估PARP抑制剂的生长抑制作用。将细胞再静置16小时，然后更换培养基，使细胞在37。C下再生长72小时。然后除去培养基，用lOOial冰冷的10。/。(w/v)三氯乙酸固定细胞。将板子在4。C下孵育20分钟，然后用水洗涤四次。然后将每孔细胞用100pl0.4。/。(w/v)的SRB在1%乙酸中的溶液染色20分钟，然后用1。/。乙酸洗涤四次。然后将板在室温下干燥2小时。向每孔加入lOOpl10mMTris碱，使来自染色细胞的染料溶解。轻轻振摇板子，室温下静置30分钟，然后在Microquant微量板读数器上测量564nm下的光密度。化合物A在2t)0nM下具有至少20的PFS0。权利要求1.晶型A形式的4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-1-羰基)-4-氟-苄基]-2H-酞嗪-1-酮。2.如权利要求1所述的化合物，其在粉末XRD中具有以下的特征峰<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>3.如权利要求1所述的化合物，其在粉末XRD中具有以下的特征峰:<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>4.如权利要求1-3中任意一项所述的化合物，其在DSC中以10。C/分钟从25。C加热到325。C时在210.1。C土1。C开始熔化。5.获得4-3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-l-羰基)-4-氟-千基-2H-酞唤-l-酮(化合物A)的晶型A的方法，该方法包括下述步骤(i)使4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嚷-l-羰基)-4-氟-千基卜2H-酞嚷-l-酮从溶剂中结晶；(ii)如杲最初的溶剂不是乙醇，则用乙醇处理结晶的化合物A;(iii)用水处理结晶的化合物A，以除去所捕获的乙醇；(")将所得产物干燥。6.获得4-[3-(4-环丙烷羰基-哌溱-l-羰基)-4-氟-千基I-2H-酞噪-l-酮(化合物A)的晶型A的方法，该方法包括下述步骤(i)使4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-l-羰基)-4-氟-千基-2H-酞嗪-1-酮从溶剂中结晶；(ii)如果在合成结晶形式的化合物A中所用的最初溶剂不是水和d-2醇的混合物的话，将该化合物与水和C^醇的混合物一起加热；(iii)在环境压力下蒸馏该混合物；和(iv)将所得产物千燥。7.获得4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嚷-l-羰基)-4-氟-千基]-2H-酞溱-l-酮(化合物A)的晶型A的方法，该方法包括下述步骤(i)将化合物A悬浮于作为溶剂的水和d—2醇的混合物中；(ii)将混悬液加热回流；(iii)冷却该溶液并用化合物A的晶型A种晶；(W)将所得产物干燥。8.从4-[4-氟-3-(旅溱-l-羰基)-卡基-2H-酞。秦-l-酮合成4-3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-l-羰基)-4-氟-千基l-2H-酞噪-l-酮的方法，该方法包括下述步骤(i)以可控的方式将预先混合的三乙胺和环丙烷甲酰氯在有机溶剂中的溶液加入到在相同有机溶剂中的4-[4-氟-3-(哌嚷-l-羰基)-千基j-2H-酞。秦-l-酮中，同时使溶液温度控制在20。C以下。9.从2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞溱-l-基曱基)-苯甲酸合成4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嚷-l-羰基)-4-氟-节基l-2H-酞溱-l-酮的方法，该方法包括将2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嚷-1-基甲基)-苯曱酸与l-(环丙基羰基)哌嗪或其无机酸盐在酰胺偶联剂存在下反应。10.合成2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基曱基)-苯甲酸的方法，该方法包括下述步骤(a)从2-羧基苯曱醛合成(3-氧代-l，3-二氢-2-苯并呋喃-l-基)膦酸二乙酯；(b)从(3-氧代-l，3-二氢-2-苯并呋喃-l-基)膦酸二乙酯合成2-氟-5-[(E/Z)-(3-氧代-2-苯并呋喃-l(3/0-亚基)甲基苄腈。11.如权利要求10所述的方法，其还包括下述步骤(c)从化合物E通过与7jC合肼反应合成2-氟-5-[(4-氧代-3，4-二氢酞溱-l-基)曱基l苄腈(ED):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>(d)通过与氢氧化钠的反应从化合物ED合成化合物D。12.2-氟-5-[(4-氧代-3，4-二氢酞溱-l-基)曱基苄腈(ED):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>13.药物组合物，其包含如权利要求1-4中任意一项所述的化合物和可药用的载体或稀释剂。ED;和14.如权利要求l-4中任意一项所述的化合物，其用于治疗人体或动物体的方法。15.如权利要求1-4中任意一项所述的化合物，其用于在治疗人体或动物体中抑制PARP的方法。16.如权利要求1-4中任意一项所述的化合物在制备抑制PARP活性的药物中的用途。17.如权利要求1-4中任意一项所述的化合物在制备治疗下述疾病的药物中的用途血管病；败血症性休克；局部缺血损伤；神经毒性；出血性休克；病毒感染；或者通过抑制PARP活性而改善的疾病。18.如权利要求1-4中任意一项所述的化合物在制备用作癌症治疗中的辅剂或者用于使肿瘤细胞对电离辐射或化疗剂的治疗变得敏感的药物中的用途。19.如权利要求1-4所述的化合物在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述的癌症在HR依赖的DNADSB修复途径中有缺陷。20.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症包括一种或多种与正常细胞相比通过HR来修复DNADSB的能力降低或丧失的癌细胞。21.如权利要求20所述的用途，其中所述癌细胞具有BRCA1或BRCA2缺陷的表型。22.如权利要求21所述的用途，其中所述癌细胞为BRCA1或BRCA2缺陷。23.如权利要求19-22中任意一项所述的用途，其中所述个体是在编码HR依赖的DNADSB修复途径的组分的基因中有突变的杂合子。24.如权利要求23所述的用途，其中所述个体是在BRCA1和/或BRCA2中有突变的杂合子。25.如权利要求19-24中任意一项所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。26.如权利要求19-25中任意一项所述的用途，其中所述治疗还包括施用电离辐射或化疗剂。全文摘要晶型A形式的4-[3-(4-环丙烷羰基-哌嗪-1-羰基)-4-氟-苄基]-2H-酞嗪-1-酮。文档编号C07D237/32GK101528714SQ200780038855公开日2009年9月9日申请日期2007年10月15日优先权日2006年10月17日发明者A·P·奥特里奇,D·D·P·拉法恩,D·J·隆德斯布拉夫,I·W·阿什沃思,J·D·皮塔姆,J·H·谢里曼,K·A·米尼尔,K·R·马尔霍兰德,M·F·琼斯,M·R·哈勒特申请人:库多斯药物有限公司