专利名称：：一种中药何首乌蛋白质的提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋白质的提取方法，具体是一种中药何首乌蛋白质的提取方法及其应用。
背景技术：
：中药何首乌为蓼科植物何首乌(尸ofygo"甽mw/n;/7orawThunberg)的干燥块根。研究表明，中药何首乌具有抗肿瘤、保肝、降血脂、调节机体免疫功能等作用[杨晓丽，王立为.中药何首乌的药理作用研究进展.中医药信息，2004，21(6):1214]。许多中药的抗癌活性及保肝作用等均与调节机体免疫功能有关。淋巴细胞能在保存自身的前提下识别、杀伤和排斥外来异已分子及癌变细胞，与机体的免疫功能密切相关。中药何首乌中的蛋白质含量为2.36%，是中药何首乌的重要组成成分。但是人们至今尚未提取出中药何首乌的蛋白质。
发明内容为了确定中药何首乌蛋白质是否为中药何首乌调节机体免疫功能的有效部位之一，本发明对其进行了提取分离，并测定了其体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响，以及对刀豆蛋白A(conA)、脂多糖(LPS)诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。本发明提供的提取方法，可为进一步将中药何首乌蛋白质研究开发成药物或保健品打下基础。本发明的目的在于提供一种中药何首乌蛋白质的提取方法。本发明的目的还在于提供中药何首乌蛋白质在制备增强免疫力药物中的应用。实现本发明目的的技术方案如下一种中药何首乌蛋白质的提取方法，其特征在于包括以下步骤(1)将何首乌的干燥块根粉末，加入正己垸浸没，脱脂23次，每次46小时(2)离心，回收溶剂，风干残渣；(3)按lg何首乌的干燥块根粉末6070mL的比例加入50mmolpH为7.4的Na2HP04-NaH2P04缓冲液，46'C搅拌1015小时，在46°C、1200013000rpm条件下冷冻离心1015min，得上清液A:(4)残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末4050mL的比例加入上述缓冲液，46°。搅拌911小时，在46。C、1200013000rpm条件下冷冻离心1015min，得上清液B;(5)残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末3040ml的比例加入上述缓冲液，46'C搅拌79小时，在46。C、1200013000rpm条件下冷冻离心1015min，得上清液C;(6)合并上清液A、B和C，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵，边加边搅拌，冷冻离心收集硫酸铵饱和度为4070%之间的沉淀，冷冻离心的条件为46°C，l訓012000rpm，1520min;(7)将所得沉淀转移至透析袋，46°C，用双蒸水透析3648小时，每隔68小时换一次双蒸水；(8)在46°C、1100012000rpm对透析截留液进行冷冻离心1520min，上清液过sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即得中药何首乌蛋白质。实验结果表明，本发明提取的中药何首乌蛋白质能促进脾淋巴细胞增殖，可应用于制备增强免疫力的药物中。本发明与现有技术相比，具有如下有益效果1、首次从中药何首乌中提取出中药何首乌蛋白质；2、实验结果表明，本发明提取的中药何首乌蛋白质能促进脾淋巴细胞增殖，可应用于制备增强免疫力的药物中。具体实施例方式实施例1本实施例所用何首乌产自广东德庆。将何首乌(尸ofygomw77m^;/7w""wThunberg)的干燥块根粉末，加入正已垸浸没，脱脂2次，每次4小时；离心，回收溶剂，残渣风干后，按lg何首乌的干燥块根粉末60mL的比例加入50mmolpH为7.4的Na2HP04-NaH2P04缓冲液，46'C搅拌10小时。冷冻离心(条件4°C，10min，12000rpm)，得上清液A;残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末40mL的比例加入上述缓冲液，46'C搅拌9小时，冷冻离心(条件同前)，得上清液B;残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末30ml的比例加入上述缓冲液，46'C搅拌7小时，冷冻离心(条件同前)，得上清液C。合并上清液A、B和C，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至30%饱和度，冷冻离心(条件4'C，15min，11000rpm);向所得上清液中继续缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至40%的饱和度，冷冻离心(条件4'C，15min，11000rpm)，得沉淀I(硫酸铵饱和度3040%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至50%饱和度，冷冻离心(条件4°C,15min，11000rpm)，得沉淀II(硫酸铵饱和度4050%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至60°/。饱和度，冷冻离心(条件4'C，15min，11000rpm)，得沉淀III(硫酸铵饱和度5060%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至70%饱和度，冷冻离心(条件4'C，15min，11000rpm)，得沉淀W(硫酸铵饱和度6070%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至80%饱和度，冷冻离心(条件4°C，15min，11000rpm)，得沉淀V(硫酸铵饱和度7080%的蛋白质)。分别将所得沉淀I、沉淀II、沉淀III、沉淀IV、沉淀V转移至透析袋，用双蒸水透析36小时(46°C，每隔6小时换一次双蒸水)。对透析截留液进行离心(条件4°C，15min，11000rpm)，上清液过sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即分别得中药何首乌蛋白质i、蛋白质n、蛋白质ni、蛋白质iv、蛋白质v。测定实施例i获取的蛋白质i、蛋白质n、蛋白质m、蛋白质iv、蛋白质v体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响，以及对conA，LPS诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。1、试验试剂刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、硫酸酚嗪甲脂(PMS)、二甲氧唑黄(XTT)均购于美国Sigma公司。胎牛血清为杭州四季青生物工程材料公司生产。RPMI-1640为美国Gibco公司产品。2、试验方法(1)小鼠脾细胞悬液制备无菌取小鼠(Balb/c、雄性、SPF级)脾脏，制备脾细胞悬液，其活力>95%,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度至5X109L—1。(2)不同蛋白质对淋巴细胞增殖的直接作用取上述细胞悬液190rtV孔加入96孔板。空白对照组加入无血清培养液10ft;各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的各蛋白质10叱(终浓度均为2S0^.mL—1)。(3)不同蛋白质对ConA诱导T细胞增殖的影响取上述细胞悬液180W7孔加入96孔板，同时设空白对照组及模型组。空白对照组加入无血清培养204L，其它各组加入ConA104L(终浓度5PgmL")。模型组加入无血清培养液10叱，各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的各蛋白质10A(终浓度均为250Pg.mL—1)。(4)不同蛋白质对LPS诱导B细胞增殖的影响除将ConA换成LPS(终浓度为104gtnL勺外，其它均同(3)。将上述各96孔板置36°C，5%〔02培养箱中培养66小时，加入XTT-PMS20A/孔，继续培养6小时，在酶标仪上测450nm处各孔吸收值A。以A值表示细胞增殖程度。3、实验结果表l为实施例1获得的不同蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响。可见按实施例1分别获取的硫酸铵饱和度范围是4050%，5060%，6070%的蛋白质11、蛋白质III、蛋白质IV均能直接促进脾淋巴细胞增殖，与空白对照组比较有非常显著差异(P<0.01)。表1何首乌蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响±s，n=12)组别硫酸铰饱和度(％)A450空白对照组—-0.711±0扁蛋白质I30400.723±0.036蛋白质II40500.846±0.051"蛋白质m50600.829±0.047**蛋白质rv60700.817±0.048"蛋白质v70800.738±0.039与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01表2何首乌蛋白质对conA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响(^±s,n=12)组别硫酸铵饱和度(％)A45o(脾细胞+conA)A450(脾细胞+LPS)空白对照组—-0.723±0週0.721±0.023模型组—-0.811±0.037''0.899±0.042'*蛋白质I30400.838±0.0430.906±0.048蛋白质II40501.011±0,102s#0.998士0.079"蛋白质III50600.976±0,092ss0.978士0.066"蛋白质rv60700.959±0,094ss0.963±0.077*蛋白质v70800.827±0.0490.912±0.054与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较*P<0.05，#"P<0.01表2为实施例1获得的不同蛋白质对conA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。与未诱导组(空白对照组)相比，ConA、LPS模型组的细胞增殖能力非常显著地增加(P〈0.01)。加入按实施例i分别获取的不同蛋白质后，蛋白质n、蛋白质m、蛋白质IV均能显著或非常显著地增加ConA、LPS诱导的脾细胞增殖(P<0.05，P<0.01)。实施例2本实施例所用何首乌产自广东德庆。将何首乌的干燥块根粉末，加入正已烷浸没，脱脂2次，每次6小时；离心，回收溶剂，残渣风干后，按lg何首乌的干燥块根粉末65mL的比例加入50mmolpH为7.4的Na2HP04-NaH2P04缓冲液，46。C搅拌12小时。冷冻离心(条件5'C，12min，12500rpm)，得上清液A;残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末45mL的比例加入上述缓冲液，46'C搅拌10小时，冷冻离心(条件同前)，得上清液B;残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末35ml的比例加入上述缓冲液，46。C搅拌8小时，冷冻离心(条件同前)，得上清液C。合并上清液A、B和C，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至30%饱和度，冷冻离心(条件5°C,18min，11500rpm);向所得上清液中继续缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至40%的饱和度，冷冻离心(条件5°C，18min，11500rpm)，得沉淀I(硫酸铵饱和度3040%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至50%饱和度，冷冻离心(条件5°C，18min，11500rpm)，得沉淀II(硫酸铵饱和度4050%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至60%饱和度，冷冻离心(条件5°C，18min，11500rpm)，得沉淀III(硫酸铵饱和度5060%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至70%饱和度，冷冻离心(条件5°C，18min，11500rpm)，得沉淀IV(硫酸铵饱和度6070%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至80%饱和度，冷冻离心(条件5°C，18min，11500rpm)，得沉淀v(硫酸铵饱和度7080%的蛋白质)。分别将所得沉淀i、沉淀n、沉淀m、沉淀iv、沉淀V转移至透析袋，用双蒸水透析42小时(46°C，每隔7小时换一次双蒸水)。对透析截留液进行离心(条件5°C，18min，11500rpm)，上清液过sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即分别得中药何首乌蛋白质I、蛋白质II、蛋白质III、蛋白质IV、蛋白质V。测定实施例2获取的蛋白质I、蛋白质II、蛋白质III、蛋白质IV、蛋白质V体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响，以及对conA，LPS诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。1、试验试剂刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、硫酸酚嗪甲脂(PMS)、二甲氧唑黄(XTT)均购于美国Sigma公司。胎牛血清为杭州四季青生物工程材料公司生产。RPMI-1640为美国Gibco公司产品。2、试验方法(1)小鼠脾细胞悬液制备无菌取小鼠(Balb/c、雄性、SPF级)脾脏，制备脾细胞悬液，其活力>95%，用含10。/o胎牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度至5X1091/1。(2)不同蛋白质对淋巴细胞增殖的直接作用取上述细胞悬液190rtV孔加入96孔板。空白对照组加入无血清培养液IO叱；各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的各蛋白质lCmL(终浓度均为250^.mL-')。(3)不同蛋白质对ConA诱导T细胞增殖的影响取上述细胞悬液180WV孔加入96孔板，同时设空白对照组及模型组。空白对照组加入无血清培养204L，其它各组加入ConAl(mL(终浓度5Pgm1/1)。模型组加入无血清培养液IOA，各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的各蛋白质10A(终浓度均为25(^g.mL—1)。(4)不同蛋白质对LPS诱导B细胞增殖的影响除将ConA换成LPS(终浓度为lO^gtnL—1)外，其它均同(3)。将上述各96孔板置36°C，5%032培养箱中培养66小时，加入XTT-PMS20A/孔，继续培养6小时，在酶标仪上测450nm处各孔吸收值A。以A值表示细胞增殖程度。3、实验结果表3为实施例2获得的不同蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响。可见按实施例2分别获取的硫酸铵饱和度范围是4050%，5060%，6070%的蛋白质11、蛋白质III、蛋白质IV均能直接促进脾淋巴细胞增殖，与空白对照组比较有显著或非常显著差异(P〈0.05，P<0.01)。表3何首乌蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响±s，n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01表4何首乌蛋白质对conA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响(^±s,n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较*P<0.05，#*P<0.01表4为实施例2获得的不同蛋白质对conA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。与未诱导组(空白对照组)相比，ConA、LPS模型组的细胞增殖能力非常显著地增加(P〈0.01)。加入按实施例2分别获取的不同蛋白质后，蛋白质II、蛋白质III、蛋白质IV均能显著或非常显著地增加ConA、LPS诱导的脾细胞增殖(P<0.05，P<0.01)。实施例3本实施例所用何首乌产自广东德庆。将何首乌(尸o/观o"wnwratoyZon/mThunberg)的干燥块根粉末，加入正已垸浸没，脱脂3次，每次6小时；离心，回收溶剂，残渣风干后，按lg何首乌的干燥块根粉末70mL的比例加入50mmolpH为7.4的Na2HP04-NaH2P04缓冲液，46。C搅拌15小时。冷冻离心(条件6'C，15min，13000rpm)，得上清液A;残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末50mL的比例加入上述缓冲液，46'C搅拌11小时，冷冻离心(条件同前)，得上清液B;残渣再按lg何首乌的干燥块根粉末40ml的比例加入上述缓冲液，46。C搅拌9小时，冷冻离心(条件同前)，得上清液C。合并上清液A、B和C，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至30%饱和度，冷冻离心(条件6°C，20min，12000rpm);向所得上清液中继续缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至40°/。的饱和度，冷冻离心(条件6'C，20min，12000rpm)，得沉淀I(硫酸铵饱和度3040%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至50%饱和度，冷冻离心(条件6'C，20min，12000rpm)，得沉淀II(硫酸铵饱和度4050%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至60%饱和度，冷冻离心(条件6°C，20min，12000rpm)，得沉淀III(硫酸铵饱和度5060°/。的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至70%饱和度，冷冻离心(条件6°C，20min，12000rpm)，得沉淀IV(硫酸铵饱和度6070%的蛋白质)。继续向上清液中缓慢加入粉末状硫酸铵(边加边搅拌)至80%饱和度，冷冻离心(条件6°C，20min，12000rpm)，得沉淀V(硫酸铵饱和度7080%的蛋白质)。分别将所得沉淀i、沉淀n、沉淀ni、沉淀iv、沉淀v转移至透析袋，用双蒸水透析48小时u6。c，每隔8小时换一次双蒸水)。对透析截留液进行离心(条件6°C，20min，12000rpm)，上清液过sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即分别得中药何首乌蛋白质i、蛋白质n、蛋白质m、蛋白质IV、蛋白质V。测定实施例3获取的蛋白质i、蛋白质n、蛋白质in、蛋白质iv、蛋白质v体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响，以及对conA，LPS诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。1、试验试剂刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、硫酸酚嗪甲脂(PMS)、二甲氧唑黄(XTT)均购于美国Sigma公司。胎牛血清为杭州四季青生物工程材料公司生产。RPMI-1640为美国Gibco公司产品。2、试验方法(1)小鼠脾细胞悬液制备无菌取小鼠(Balb/c、雄性、SPF级)脾脏，制备脾细胞悬液，其活力>95%，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度至5X109!/1。(2)不同蛋白质对淋巴细胞增殖的直接作用取上述细胞悬液190叱/孔加入96孔板。空白对照组加入无血清培养液各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的各蛋白质10叱(终浓度均为250Pg.mL—1)。(3)不同蛋白质对ConA诱导T细胞增殖的影响取上述细胞悬液180W7孔加入96孔板，同时设空白对照组及模型组。空白对照组加入无血清培养20WL，其它各组加入ConA10W」(终浓度5PgmL—1)。模型组加入无血清培养液IOA，各蛋白质组加入用无血清RPMI-1640完全培养基配制的各蛋白质IO叱(终浓度均为250W.mL—1)。(4)不同蛋白质对LPS诱导B细胞增殖的影响除将ConA换成LPS(终浓度为10PgtiiL—1)外，其它均同(3)。将上述各96孔板置36°C，5%(]02培养箱中培养66小时，加入XTT-PMS20A/孔，继续培养6小时，在酶标仪上测450nm处各孔吸收值A。以A值表示细胞增殖程度。3、实验结果表5为实施例3获得的不同蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响。可见按实施例3分别获取的硫酸铵饱和度范围是4050°/。，50~60%，6070°/。的蛋白质11、蛋白质III、蛋白质IV均能直接促进脾淋巴细胞增殖，与空白对照组比较有显著或非常显著差异(P〈0.05，P<0.01)。表5何首乌蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响±s,n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01表6何首乌蛋白质对conA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响(^±s,n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较*P<0.05，"P<0.01表6为实施例3获得的不同蛋白质对conA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。与未诱导组(空白对照组)相比，ConA、LPS模型组的细胞增殖能力非常显著地增加(P〈0.01)。加入按实施例3分别获取的不同蛋白质后，蛋白质n、蛋白质m、蛋白质IV均能非常显著地增加ConA、LPS诱导的脾细胞增殖(P<0.01)。上述试验证明，本发明方法提取的中药何首乌蛋白质能够体外促进小鼠脾淋巴细胞增殖。权利要求1、一种中药何首乌蛋白质的提取方法，其特征在于包括以下步骤(1)将何首乌的干燥块根粉末，加入正已烷浸没，脱脂2～3次，每次4～6小时；(2)离心，回收溶剂，风干残渣；(3)按1g何首乌的干燥块根粉末60～70mL的比例加入50mmolpH为7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，4～6℃搅拌10～15小时，在4～6℃、12000～13000rpm条件下冷冻离心10～15min，得上清液A；(4)残渣再按1g何首乌的干燥块根粉末40～50mL的比例加入上述缓冲液，4～6℃搅拌9～11小时，在4～6℃、12000～13000rpm条件下冷冻离心10～15min，得上清液B；(5)残渣再按1g何首乌的干燥块根粉末30～40ml的比例加入上述缓冲液，4～6℃搅拌7～9小时，在4～6℃、12000～13000rpm条件下冷冻离心10～15min，得上清液C；(6)合并上清液A、B和C，即得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵，边加边搅拌，冷冻离心收集硫酸铵饱和度为40～70％之间的沉淀，冷冻离心的条件为4～6℃，11000～12000rpm，15～20min；(7)将所得沉淀转移至透析袋，4～6℃，用双蒸水透析36～48小时，每隔6～8小时换一次双蒸水；(8)在4～6℃、11000～12000rpm对透析截留液进行冷冻离心15～20min，上清液过sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即得中药何首乌蛋白质。2、权利要求1所述方法制备的中药何首乌蛋白质在制备增强免疫力药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种中药何首乌蛋白质的提取方法，将何首乌的干燥块根粉末，脱脂处理后加入50mmolpH为7.4的Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>-NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>缓冲液，冷冻离心得缓冲提取液，向其中缓慢加入粉末状硫酸铵，边加边搅拌，冷冻离心收集硫酸铵饱和度为40～70％之间的沉淀；将所得沉淀转移至透析袋，用双蒸水透析，对透析截留液进行冷冻离心，上清液过sephadexG75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥即得中药何首乌蛋白质。按上述方法制备的中药何首乌蛋白质能促进脾淋巴细胞增殖，可应用于制备增强免疫力的药物中。文档编号C07K1/14GK101445548SQ20081022072公开日2009年6月3日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者刘一流,敏张,李续娥申请人:华南师范大学